恙螨与恙虫病立克次体的系列研究
作者：黎家灿 郑小英 奚志勇 倪宏 张海红 陈成福
单位：中山医科大学寄生虫学教研室； 广州，510089
关键词：立克次体，恙虫热；遗传学；媒介恙螨
中山医科大学学报990401
摘 要 恙虫病是由感染恙螨幼虫叮咬人体传入恙虫病立克次体所致的急性传染病。地里纤恙螨和小板纤恙螨分别为我国南方和北方的主要传播媒介。近年来，新、旧流行区的恙虫病陆续发生、疫情上升。本课题系为进一步控制恙虫病的流行，对我国主要媒介地里纤恙螨的一些生物学特征和恙虫病立克次体进行了系列研究，包括：①地里纤恙螨射线诱发突变、种株杂交、种株染色体与氨基酸测定；②恙螨人工接种恙虫病立克次体及其阳性恙螨模型的建立；③恙螨体内恙虫病立克次体的分离、检测及其效果；④恙螨、鼠宿主和患者体内恙虫病立克次体动态及其传病关系；⑤恙螨、鼠宿主和患者体内恙虫病立克次体株型特异性基因序列的扩增、鉴定及克隆。
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中图号 R 376.2； 384.4
A Series Studies on Trombiculid Mite and Rickettsia tsutsugamushi
Li Jiacan Zheng Xiaoying Xi Zhiyong Ni Hong Zhang Haihong Chen Chengfu
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
Abstract -Tsutsugamushi disease is caused by Rickettsia tsutsugamushi through the bite of vector chigger mite on human. Leptotrombidium deliense is the vector of tsutsugamushi disease in the south of China, and L. scutellare in the north. In recent years, the cases of tsutsugamushi disease is increasing in epidemic area. For controlling the prevalence of scrub typhus, we have a series studies on biological characteristics of trombiculid mites and R. tsutsugamushi. The contents include: ①60Co gamma rays on induced mutations of L. deliense; hybridization culture; karyotype and of trombiculid; detection and analysis on trmbiculid amino acid; ② Inoculation of R. tsutsugamushi on trombiculid mites and establishment of R. Tsutsugamushi positive model of L. deliense; ③ Isolating and detecting R. tsutsugamushi from trombiculid mites; ④ Dynamic state of R. tsutsugamushi in trombiculid mites and its effect on transmition of disease; ⑤ Amplification, cloning and identification of gene of R. tsutsugamushi.
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Subject headings Rickettsia tsutsugamushi/genetics; trombiculid mite
我国恙虫病的传播媒介地里纤恙螨[Leptotrombidium deliense(Walch, 1992)]和小板纤恙螨[L.scutellare(Nagayo, et al, 1921)]等5～6种自然感染恙虫病立克次体[Rickettsia tsutsugamushi(Hayasi) Ogata, 1931]，其中地里纤恙螨和小板纤恙螨分别为我国南方和北方的主要传播媒介。近年国内外不断发现新流行区，旧流行区亦不断有恙虫病病例出现，且病例逐年增加。80年代后期起以地里纤恙螨(简称：恙螨)作为主要传播媒介的地区广东、福建、海南、广西、云南、浙江、四川、湖南和台湾等省市陆续有病例出现，尤其前5省市病例较多；广东佛山、湛江等地区患者逐年增加，且有误诊导致死亡病例；广东省和广州市等地区的恙虫病虽是50年代后期已控制了的疾病，但近年疫情再次出现[1]；山东、江苏等地以小板纤恙螨为主要传播媒介，恙虫病相继爆发流行；1997年河北保定地区确证发现有恙虫病病例和爆发流行；因此，深入研究媒介恙螨和病原体相互关系包括恙螨本身生物学特性对控制恙虫病具有重要意义。由于恙螨特别细小和生活史复杂等特点，实验室培养对食物要求特殊等因素，给实验带来困难；恙虫病立克次体因行严格细胞内寄生，繁殖缓慢，故组织培养难于获得大量纯化的立克次体，在恙螨与立克次体间的循环关系则更难弄清楚。近20年来，我们对恙螨的一些生物学特性和恙螨传病规律等方面作了试验，特别是在建立恙虫病立克次体阳性恙螨模型基础上，对媒介恙螨和它的亲代及子代体内立克次体动态等进行了一系列研究，现分述如下。
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1 恙虫病媒介恙螨
1.1 地里纤恙螨射线诱发突变
我们从70年代起利用60Co γ射线7个剂量(0.64～5.16 C/kg)以一次照射和小剂量(0.0064 C/kg和0.025 C/kg)多次照射恙螨生活史各期的方法。经筛选后，照射0.64 C/kg和1.29 C/kg组的后代得到许多诱发突变个体，诱发突变个体数量从第一代起随代数增加而增加，其中的一类外观呈纯白色(原为红色)，后来还用纯系选育的方法获得几个品系。实验室试验包括2个部分：①寻找诱发突变遗传性稳定种群增殖能力强的品系；②在这些品系中筛选出失去传播恙虫病能力的品系。我们在突变品系增殖能力测定证明：60Co γ射线照射地里纤恙螨饱食蚴的方法已获得至少一个比纯系原种种群增殖能力强的诱发突变品系，它和纯系原种连续杂交4代仍保有明显优势的种群增殖能力，增殖能力高达2倍以上[2，3]。
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本实验室为了证实突变品系能否长期保有与纯系原种杂交4代以上的优势，经5年以上长期观察其种群的增殖能力：地里纤恙螨饱食蚴分别照射60Co γ射线0.64 C/kg和1.29 C/kg的2个剂量组；两组均从第一代起出现外观呈纯白色(原为红色)诱发突变个体，诱发突变个体数量从第一代起随代数增加而增加；其中1.29 C/kg剂量组从1～3代生殖能力逐渐减少，至第3代的成虫已无生殖能力了，而0.64 C/kg剂量组增殖能力显著增强，该剂量组继续在恒温(25±1) ℃和湿度85%～100%的实验室常规培养经5年时间连续传代培养至14代。增殖能力用每个成虫分得的幼虫统计：1～5代照射组46.04个，对照组38.12个(P<0.01)，差异有显著性；6～10代照射组56.91个，对照组37.90个，(P<0.01)，差异有显著性；11～14代照射组20.23个，对照组24.38个(P>0.05)，差异不显著。60Co γ射线0.64 C/kg剂量诱发地里纤恙螨的体色突变品系经14代连续培育显示，有可能筛选出保持生殖与遗传优势而又失去传病能力的新品系，至少能选育出红体色和白体色2个突变品系；该剂量对地里纤恙螨生殖能力效应是传至10以后，在各代呈现为雌少雄多的异常比例，以及生活史各期和一代代体色不固定改变说明经5年传至第10～14代的突变后遗传的不稳定性[4]。
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1.2 地里纤恙螨种株杂交
我国到目前为止恙螨的杂交试验的报道，包括不同株、同属不同种、和不同种属等3种试验。本实验是同种不同株杂交。于1980年从广州郊区(以前有恙虫病流行的地区)野鼠检获的一批地里纤恙螨连续8年的传代培养中分离和培育的红、白体色幼虫叮咬小鼠后两者的饱食蚴培养至成蛹期，单个成蛹分管发育羽化为成虫，鉴别雌雄虫后，各培养管的红、白体色成虫配对(正交：红♀×白♂；反交：红♂×白♀)产卵孵出的均为红色子代幼虫(F1，杂种第一代)(正、反交获得幼虫均为红色和眼点鲜红色，未见白色幼虫，说明红色为显性性状)，该批红色幼虫(F1)叮咬小鼠48 h检获的饱食蚴，计数分管，每石膏炭粉培养管放置饱食蚴30个进行自交培养，经若虫(红色)达成虫(红色)产卵孵出3∶1(卡方测验求理论分离比例，即像显性亲本的占3/4，像稳性亲本的占1/4，符合遗传规律χ2=0.0164；P>0.05)的红色子二代(红F2)和白色子二代(白F2)，称杂种第2代(简称红F2和白F2)。红F2和白F2做杂交培养、传代，红F2和白F2杂交培养与传代能提高其生殖能力，即后代数量成倍增加。红F2和白F2单独分别培养传代的后代生殖力比上述低，特别是白F2培养传代生殖能力明显下降，出现雄多雌少甚至达第4代时仅有雄虫，没有出现雌虫的现象[5]。在自然界单独红F2或白F2分开的可能性极少或没有这种现象存在，一般都处于红F2和白F2同时在一个孳生点杂交孳生，导致后代数量增加和传播恙虫病的威胁大，是流行病学和防制方面很重要的问题。我们还试验证明：红F2和白F2幼虫包括它的子代幼虫不仅有叮咬动物宿主的能力，并且有传病能力[6]。
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本实验室还对不同属种恙螨进行杂交试验，太平洋无前恙螨在实验培养达第2代时，仅存一个雄虫单独培养达180 d，移至新制备的培养管后，挑加入地里纤恙螨成蛹一只，该成蛹14 d羽化后为雌性成虫，这对恙螨培养159 d后太平洋无前恙螨死亡(寿命342 d)，经制片鉴定为雄虫。地里纤恙螨成虫被另被移至新制备的培养管单独培养仍继续产卵孵出幼虫(红色)，203 d后死亡(寿命365 d)，经制片鉴定为雌虫，总共孵出幼虫168个。2种恙螨配对培养观察的结果说明：地里纤恙螨雌虫似可以获得太平洋无前恙螨雄虫所产的精胞并受精产卵孵化子代幼虫。地里纤恙螨(♀，红色)和太平洋无前恙螨(♂，白色)配对杂交的子代幼虫、若虫和成虫形态、体色、幼虫背板形态和鞭状感觉毛等均似地里纤恙螨。两者杂交后代的生活史各期发育时间和成活率，与纯系地里纤恙螨对照比较未见明显差别[7]。
1.3 地里纤恙螨种株染色体与氨基酸测定
染色体是生物机体主要的遗传物质的载体，对它的研究可以了解生物的遗传变异、系统演化、性别决定，个体发育和生理过程的平衡控制等方面均有重要作用。国内外对恙螨染色体的研究仅是零星报道，因为恙螨生活史复杂，分7个变态期，有寄生生活和自由生活的交替，实验室培养不易。另外恙螨个体细小，仅仅肉眼可见，取材困难，给染色体研究带来很大困难。我们对地里纤恙螨红体色纯系及其白体色突变株染色体核型观察结果：红体色纯系恙螨的中期分裂相染色体数目为2n=14,n=7的占多数，占观察细胞的70%。所以地里纤恙螨的14个染色体可以配成7对。前4对可以看出是中部着丝粒，第5至第7对染色体则着丝粒不清。染色体的长度按顺序递减。在某些核型的2号染色体看到有明显的端部小随体，性决定机制不清。白体色突变株的二倍体染色体数目亦以2n=14，n=7为多数，占已观察细胞的80%，第1号至第4号染色体应为中部着丝粒，第5号至第7号则着丝粒不清。在某些核型中也看到2号染色体有端随体，染色体长度依次递减。纯系红体色与白体色突变株的染色体核型比较，发现它们的二倍体数目相同，都是2n=14。但第6号染色体的长度则有明显区别。把2株染色体绝对长度测验则发现第6号、7号染色体差异有显著性。结合2株恙螨的体色、活动力和生殖力等都有明显的不同，又通过杂交与传代试验证明，这些特征似乎是基于基因隐性化或丢失部分同源染色体引起的。从本试验结果2株在第6号染色体的长度有明显的差异，推测可能由于红体色的后代突变为白体色虫体后丢失一部分染色体引起的[8]。
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在2株染色体核型有差别基础上，由细胞水平到分子水平探索它们氨基酸组成和含量，可能有助于媒介恙螨传病基因的了解。地里纤恙螨红体色纯系及其白体色突变株氨基酸组成和含量测定的成虫要求虫龄和培养条件相同，测定前让成虫饥饿12～14 d，排清体内代谢产物后经测定前的各种处理，原样稀释50倍，在全自动氨基酸分析仪测定氨基酸的组成和含量，计算机记录扫描和数据处理。红体色纯系和白体色突变株均有17种氨基酸，除组氨酸外，其余氨基酸从不同程度的含量波动趋势为：2株基本一致，均以谷氨酸和甘氨酸最高，而以蛋氨酸的含量最低。红体色纯系(w红总=645.59 mg/g)的总量低于白体色突变株(w白总=749.189 mg/g)的总含量；组氨酸的含量红体色纯系(w红组=56.69 mg/g)比白体色突变株(w白组=39.11 mg/g)高外，其余16种均是红体色低于白体色，其中低于10 mg/g以上的氨基酸达5种，低于5～10 mg/g的7种，低于1～4.9 mg/g 3种，低于0.1～1 mg/g 2种，上述2体色结果不同显示，可能与白体色突变株成虫生殖能力降低与生活习性的改变有关[9]。
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2 恙螨人工接种恙虫病立克次体及其阳性恙螨模型的建立
1991年首次报告地里纤恙螨成虫腹内人工接种恙虫病立克次体Karp株获得成功。试验的恙螨是经实验室纯化证实无立克次体感染并连续饲养20代以上的成虫。培养和传代均按实验室常规方法。纯化的恙虫病立克次体Karp株对Balb/c小鼠LD50为10-6～10-8；立克次体悬液的制备是Balb/c小鼠腹腔接种富含立克次体Karp株的鼠脾悬液，发病小鼠的腹水和腹腔冲洗液经各种处理手续后制成各种浓缩立克次体悬液，涂片染色，镜检平均每视野约20个立克次体，置4 ℃冰箱当日接种。采用有刻度的微细玻璃注射针，乙醚麻醉成虫，镜下腹腔接种，每成虫接种立克次体悬液约0.1 μL以下，接种后的成虫置石膏炭粉管培育，观察存活率和生殖能力，以及立克次体的感染率和增殖情况[10]。
2.1 存活率
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共计4批恙螨(各批成虫数分别为60个，68个，42个和45个)接种10 d后的存活率为88.3%～97.8%；总共接种215个，10 d后存活201个，平均存活率93.5%。4个月后为68.9%～95.2%，总共接种215个，4个月后存活180个，平均存活率83.7%；各批对照组存活率均在96%以上[10]。
2.2 生殖能力
第一年内接种组21个雌虫，总共产卵孵出2 268个幼虫，对照组20个雌虫产卵孵出2 216个幼虫，每个雌虫平均孵出幼虫分别为108个和110.8个(P>0.05)，两组的幼虫总数无明显差异，说明立克次体接种的成虫第一年内能保持较好的生殖能力[10]。
2.3 立克次体感染和增殖
接种的成虫经过不同时间进行直接、间接免疫荧光染色法和金银免疫染色法结合透射电镜的检测结果，立克次体感染率高达41.2%以上。用PCR技术检测结果，立克次体感染率高达92.3%。经人工接种的恙虫病立克次体Karp株能在地里纤恙螨体内增殖长达360 d以上，并经卵传递至少4代。实验证明，恙螨成虫腹内人工接种立克次体不但能使恙螨有较高的感染率，而且在它体内增殖达一年以上和经卵传递达子代。这一实验感染方法的建立，对于制作立克次体阳性恙螨模型及深入研究病原体在媒介恙螨体内的定位和动态变化，以及在传病机理研究等均具有极重要的意义[10～12]。
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3 恙螨体内恙虫病立克次体的分离、检测及其效果
3.1 传统法、免疫法和透射电镜观察
一直应用的传统法分离和检测恙螨、人体内恙虫病立克次体的技术，前者是恙螨幼虫研磨浆液，后者是血液(抗凝)，进行小鼠腹腔接种后观察其发病(一般每次观察21 d左右)，病鼠解剖取腹膜液涂片(或脾组织印片)，Giemsa染色，镜检立克次体(常见在内皮细胞浆内，核旁)。盲传3次不发病为阴性结果。该法检获结果时间长，反复次数多，立克次体数少或毒性低不发病等影响检出效果。
1991年起我们应用免疫法包括直接免疫荧光染色，间接免疫荧光染色和金银免疫染色对恙螨生活史各期特别是子代幼虫体内立克次体的检测，比传统法检出率高，但抗原抗体的制备，标本制备复杂，手续繁锁，有一定的局限性，影响检出效果。1990年和1991年应用透射电镜观察人工感染恙螨体内恙虫病立克次体的分布和定位，虽然效果可靠，但技术复杂，尤其是虫体切片部位选择等问题，影响检出效果[13～16]。
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3.2 分子生物学技术
由于上述方法对恙螨体内恙虫病立克次体的检测存在许多不足之处，1991年起我们应用分子生物学技术检测恙螨体内恙虫病立克次体。
3.2.1 聚合酶链反应技术 根据恙虫病立克次体Sta58和Sta56基因序列设计合成引物，做PCR检测地里纤恙螨的两种实验感染途径(成虫人工接种和幼虫叮咬病鼠)获得立克次体的生活史各期和子代幼虫体内立克次体DNA获得成功。PCR技术检测不同途径感染恙虫病立克次体的小鼠、流行区捕获的野鼠、病人血标本亦均获成功。免疫荧光和免疫金银染色法等检测实验感染立克次体阳性的地里纤恙螨体内病原体，其阳性检出率为41.2%，而PCR检测则阳性检出率为90%以上。应用传统法：立克次体阳性地里纤恙螨幼虫研磨浆液做小鼠腹腔接种和立克次体阳性地里纤恙螨未食蚴叮咬健康小鼠，观察小鼠发病情况，解剖病鼠腹膜液涂片，染色镜检立克次体，与PCR对立克次体阳性未食蚴和饱食蚴标本的检测结果比较，传统法每组52个未食蚴，共检102组中52组阳性，阳性率为50.98%；饱食蚴每组52个，共检102组，13组阳性，阳性率为12.74%；PCR法每组5个未食蚴，共检5组中5组阳性，阳性率为100%；饱食蚴每组8个，共检8组，8组阳性，阳性率为100%；结果说明传统法检出率极低，每次所需标本量大，且实验周期长，操作复杂、繁琐，反复次数多，而PCR技术正是克服了传统法的上述缺点，特异性强，敏感性好，省时快速，阳性检出率高，还克服了传统法易出现假阴性结果[17～19]。
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3.2.2 核酸杂交技术 在国内外未见DNA探针研究恙螨体内恙虫病立克次体的文献和资料，虽然PCR和核酸杂交法同样具有独特的优点，两法均敏感、特异，稳定和高效，但PCR技术每次检测的标本数量不多，而斑点杂交检测的标本数每次可达100份。根据恙虫病立克次体Sta56基因序列合成1对引物，应用PCR反应扩增立克次体DNA来大量制备地高辛探针，试验证明该探针具有独特性的优点，方法敏感特异，且稳定、高效，适用于现场恙螨、鼠类宿主和人群等流行病学调查研究[20～24]。
4 恙螨体内恙虫病立克次体动态及其传病关系
因恙螨个体细小，生活史复杂，且周期长，用传统法分离恙虫病立克次体需要时长和阳性率低，故对立克次体在恙螨体内恙虫病立克次体动态情况尚不清楚，但恙螨体内立克次体的资料对流行病学又具有重要的意义。1991年开始在建立实验感染恙虫病立克次体的阳性恙螨模型基础上，自行设计、合成2个主要抗原基因恙虫病立克次体Sta56和Sta58引物，应用PCR技术为主，配合核酸杂交、PCR结合核酸杂交(核酸杂交检测PCR产物)和包括传统法分离立克次体法对恙螨体内恙虫病立克次体动态及其传病关系研究[25～27]。
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4.1 立克次体经期传递
恙虫病立克次体接种组成虫产卵孵出未食幼虫，叮咬健康Balb/c小鼠后检获饱食蚴，培养发育经若蛹、若虫、成蛹达成虫，各期(未食幼虫、饱食幼虫、若蛹、若虫、成蛹和成虫)的PCR检测立克次体DNA阳性率高达92.3%以上，叮咬组生活史各期和成虫产卵孵出子代未食幼虫，PCR检测立克次体DNA的阳性率高达40%以上[19，29]。
4.2 立克次体经卵传递
恙虫病立克次体接种组和叮咬组恙螨亲代成虫和传代的子代幼虫体内立克次体DNA检测结果，2组PCR检测不仅是成虫体内立克次体DNA阳性，和成虫产卵孵出的幼虫亦呈阳性外，而且2组立克次体能经卵传递多代，接种组至少达5代，叮咬组至少达3代。经长期跟踪的定期PCR检测结果，恙虫病立克次体阳性成虫及其产卵孵出的幼虫体内立克次体阳性动态一致，阳性成虫在1年内产卵孵出的幼虫具有传病能力，首次揭示了恙螨内在的传病规律，说明防治恙虫病需要长期而艰苦的努力[28，29]。
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4.3 立克次体经精胞传递
PCR技术检测恙螨体内立克次体DNA获成功后，我们应用PCR、核酸杂交、核酸杂交检测PCR产物和传统分离立克次体法等几种方法结合，检测人工接种立克次体的地里纤恙螨雄虫和非感染健康的雌虫配对培养的子代体内立克次体阳性，发现了恙螨也能经精胞传递恙虫病立克次体；经精胞传递是雌虫从培养管的炭粉上(自然界是地面)摄取雄虫产下的精胞而间接受精，从雄虫产精胞数量可使更多雌虫摄取受精，本结果给防治提出了非常重要的问题[30，31]。
地里纤恙螨成虫腹内人工接种立克次体Karp株和幼虫叮咬小鼠实验感染的恙螨，立克次体不仅1年多时间能在它体内生长繁殖，而且不断产卵孵出的子代幼虫亦携带立克次体，立克次体在恙螨体内的持续时间和经卵传递代数有一定限度，并与恙螨的感染率、立克次体数量相关，持续、反复从携带立克次体鼠，和经期、经卵及经精胞传递是保持恙螨代代体内立克次体动态的循环的基础；而循环又是恙螨体内立克次体能长期保持种族的延续和传病的动力。恙螨经期、经卵及经精胞传递恙虫病立克次体的结果，既再次证明地里纤恙螨是我国恙虫病极为重要的传播媒介，又是在该病流行动力学上具有防制重要意义的科学依据[17，18，29]。
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5 恙螨、鼠宿主和患者体内恙虫病立克次体株型特异性基因序列的扩增、鉴定及克隆
我们以恙虫病立克次体的主要表面抗原56 kDa基因编码区序列作为群、型特异性引物对构建的靶基因，因56 kDa抗原是恙虫病立克次体的主要外膜蛋白抗原，与致病性和毒力变异有关，既有种特异抗原决定簇又有株抗原决定簇。所构建的恙虫病立克次体Sta56基因特异DNA引物，检测结果显示外引物Rt34、Rt55和内引物Rt10、Rt11对恙虫病立克次体的所有5个株均可进行扩增，在约507 bp出现一清晰条带，与设计片段大小相符，而对普氏立克次体[R.prowazekii(da Rocha-Lima,1916)]、莫氏立克次体[R. Mooseri(Monteiro,1931)]则未见阳性扩增带，表明外引物Rt34、Rt55和内引物Rt10、Rt11具有很好的恙虫病立克次体种特异性。而Karp、Gilliam、Kato、Kuroki和Kawasaki株的特异性引物对则仅扩增各相应的分离株，对其他株则无扩增，所得特异性DNA片段大小分别为230、407、242、220和523 bp多核苷酸，均与设计大小相符，显示各株引物对具有很好的特异性。
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根据恙虫病立克次体56 kDa的群型特异性引物，自行设计合成后，进行套式聚合酶链反应(NPCR)对广东佛山等地有恙虫病病例住家周围现场捕获的野鼠和鼠体表检获的地里纤恙螨，以及有发热和有焦痂的典型恙虫病人等恙虫病立克次体阳性标本进行检测和分型，采用NPCR技术对上述3种标本进行恙虫病立克次体株型鉴定，用外引物Rt34、Rt55和内引物Rt10、Rt11做NPCR选出恙虫病立克次体阳性标本，病者28份、野鼠12份和恙螨7份，共47份阳性标本，进一步用各株特异性引物对进行株型鉴定，结果仅Karp株特异性引物对扩增出约230 bp大小的特异的DNA片段，其它Gilliam、Kato、Kuroki和Kawasaki均未见任何扩增带。显示广东顺德、南海等地区的流行优势株为Karp株，且媒介恙螨、野鼠宿主及患者所携带的立克次体均为同一型别[32，33]。
正体我们在Karp株特异性引物对5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点，并用这对引物从Karp株的基因组DNA中扩增出一条大小约230 bp的株特异性DNA片段，经HindⅢ和BamHⅠ酶切后，用低熔点琼脂糖胶纯化回收，以粘端连接的方式重组到酶切后的pUC18质粒，并转化入大肠杆菌TGI中，选择阳性克隆，以碱裂解法提取质粒DNA，对重组质粒进行酶切和PCR鉴定，证实有目的基因片段插入，构建了重组质粒pUC-RK[34]，为下一步的基因序列分析和株特异性基因片段表达及株型诊断性抗原的制备打下了基础。
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参考文献
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(1999 - 04 - 12收稿 1999 - 07 - 12修回), http://www.100md.com
单位：中山医科大学寄生虫学教研室； 广州，510089
关键词：立克次体，恙虫热；遗传学；媒介恙螨
中山医科大学学报990401
摘 要 恙虫病是由感染恙螨幼虫叮咬人体传入恙虫病立克次体所致的急性传染病。地里纤恙螨和小板纤恙螨分别为我国南方和北方的主要传播媒介。近年来，新、旧流行区的恙虫病陆续发生、疫情上升。本课题系为进一步控制恙虫病的流行，对我国主要媒介地里纤恙螨的一些生物学特征和恙虫病立克次体进行了系列研究，包括：①地里纤恙螨射线诱发突变、种株杂交、种株染色体与氨基酸测定；②恙螨人工接种恙虫病立克次体及其阳性恙螨模型的建立；③恙螨体内恙虫病立克次体的分离、检测及其效果；④恙螨、鼠宿主和患者体内恙虫病立克次体动态及其传病关系；⑤恙螨、鼠宿主和患者体内恙虫病立克次体株型特异性基因序列的扩增、鉴定及克隆。
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中图号 R 376.2； 384.4
A Series Studies on Trombiculid Mite and Rickettsia tsutsugamushi
Li Jiacan Zheng Xiaoying Xi Zhiyong Ni Hong Zhang Haihong Chen Chengfu
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
Abstract -Tsutsugamushi disease is caused by Rickettsia tsutsugamushi through the bite of vector chigger mite on human. Leptotrombidium deliense is the vector of tsutsugamushi disease in the south of China, and L. scutellare in the north. In recent years, the cases of tsutsugamushi disease is increasing in epidemic area. For controlling the prevalence of scrub typhus, we have a series studies on biological characteristics of trombiculid mites and R. tsutsugamushi. The contents include: ①60Co gamma rays on induced mutations of L. deliense; hybridization culture; karyotype and of trombiculid; detection and analysis on trmbiculid amino acid; ② Inoculation of R. tsutsugamushi on trombiculid mites and establishment of R. Tsutsugamushi positive model of L. deliense; ③ Isolating and detecting R. tsutsugamushi from trombiculid mites; ④ Dynamic state of R. tsutsugamushi in trombiculid mites and its effect on transmition of disease; ⑤ Amplification, cloning and identification of gene of R. tsutsugamushi.
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Subject headings Rickettsia tsutsugamushi/genetics; trombiculid mite
我国恙虫病的传播媒介地里纤恙螨[Leptotrombidium deliense(Walch, 1992)]和小板纤恙螨[L.scutellare(Nagayo, et al, 1921)]等5～6种自然感染恙虫病立克次体[Rickettsia tsutsugamushi(Hayasi) Ogata, 1931]，其中地里纤恙螨和小板纤恙螨分别为我国南方和北方的主要传播媒介。近年国内外不断发现新流行区，旧流行区亦不断有恙虫病病例出现，且病例逐年增加。80年代后期起以地里纤恙螨(简称：恙螨)作为主要传播媒介的地区广东、福建、海南、广西、云南、浙江、四川、湖南和台湾等省市陆续有病例出现，尤其前5省市病例较多；广东佛山、湛江等地区患者逐年增加，且有误诊导致死亡病例；广东省和广州市等地区的恙虫病虽是50年代后期已控制了的疾病，但近年疫情再次出现[1]；山东、江苏等地以小板纤恙螨为主要传播媒介，恙虫病相继爆发流行；1997年河北保定地区确证发现有恙虫病病例和爆发流行；因此，深入研究媒介恙螨和病原体相互关系包括恙螨本身生物学特性对控制恙虫病具有重要意义。由于恙螨特别细小和生活史复杂等特点，实验室培养对食物要求特殊等因素，给实验带来困难；恙虫病立克次体因行严格细胞内寄生，繁殖缓慢，故组织培养难于获得大量纯化的立克次体，在恙螨与立克次体间的循环关系则更难弄清楚。近20年来，我们对恙螨的一些生物学特性和恙螨传病规律等方面作了试验，特别是在建立恙虫病立克次体阳性恙螨模型基础上，对媒介恙螨和它的亲代及子代体内立克次体动态等进行了一系列研究，现分述如下。
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1 恙虫病媒介恙螨
1.1 地里纤恙螨射线诱发突变
我们从70年代起利用60Co γ射线7个剂量(0.64～5.16 C/kg)以一次照射和小剂量(0.0064 C/kg和0.025 C/kg)多次照射恙螨生活史各期的方法。经筛选后，照射0.64 C/kg和1.29 C/kg组的后代得到许多诱发突变个体，诱发突变个体数量从第一代起随代数增加而增加，其中的一类外观呈纯白色(原为红色)，后来还用纯系选育的方法获得几个品系。实验室试验包括2个部分：①寻找诱发突变遗传性稳定种群增殖能力强的品系；②在这些品系中筛选出失去传播恙虫病能力的品系。我们在突变品系增殖能力测定证明：60Co γ射线照射地里纤恙螨饱食蚴的方法已获得至少一个比纯系原种种群增殖能力强的诱发突变品系，它和纯系原种连续杂交4代仍保有明显优势的种群增殖能力，增殖能力高达2倍以上[2，3]。
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本实验室为了证实突变品系能否长期保有与纯系原种杂交4代以上的优势，经5年以上长期观察其种群的增殖能力：地里纤恙螨饱食蚴分别照射60Co γ射线0.64 C/kg和1.29 C/kg的2个剂量组；两组均从第一代起出现外观呈纯白色(原为红色)诱发突变个体，诱发突变个体数量从第一代起随代数增加而增加；其中1.29 C/kg剂量组从1～3代生殖能力逐渐减少，至第3代的成虫已无生殖能力了，而0.64 C/kg剂量组增殖能力显著增强，该剂量组继续在恒温(25±1) ℃和湿度85%～100%的实验室常规培养经5年时间连续传代培养至14代。增殖能力用每个成虫分得的幼虫统计：1～5代照射组46.04个，对照组38.12个(P<0.01)，差异有显著性；6～10代照射组56.91个，对照组37.90个，(P<0.01)，差异有显著性；11～14代照射组20.23个，对照组24.38个(P>0.05)，差异不显著。60Co γ射线0.64 C/kg剂量诱发地里纤恙螨的体色突变品系经14代连续培育显示，有可能筛选出保持生殖与遗传优势而又失去传病能力的新品系，至少能选育出红体色和白体色2个突变品系；该剂量对地里纤恙螨生殖能力效应是传至10以后，在各代呈现为雌少雄多的异常比例，以及生活史各期和一代代体色不固定改变说明经5年传至第10～14代的突变后遗传的不稳定性[4]。
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1.2 地里纤恙螨种株杂交
我国到目前为止恙螨的杂交试验的报道，包括不同株、同属不同种、和不同种属等3种试验。本实验是同种不同株杂交。于1980年从广州郊区(以前有恙虫病流行的地区)野鼠检获的一批地里纤恙螨连续8年的传代培养中分离和培育的红、白体色幼虫叮咬小鼠后两者的饱食蚴培养至成蛹期，单个成蛹分管发育羽化为成虫，鉴别雌雄虫后，各培养管的红、白体色成虫配对(正交：红♀×白♂；反交：红♂×白♀)产卵孵出的均为红色子代幼虫(F1，杂种第一代)(正、反交获得幼虫均为红色和眼点鲜红色，未见白色幼虫，说明红色为显性性状)，该批红色幼虫(F1)叮咬小鼠48 h检获的饱食蚴，计数分管，每石膏炭粉培养管放置饱食蚴30个进行自交培养，经若虫(红色)达成虫(红色)产卵孵出3∶1(卡方测验求理论分离比例，即像显性亲本的占3/4，像稳性亲本的占1/4，符合遗传规律χ2=0.0164；P>0.05)的红色子二代(红F2)和白色子二代(白F2)，称杂种第2代(简称红F2和白F2)。红F2和白F2做杂交培养、传代，红F2和白F2杂交培养与传代能提高其生殖能力，即后代数量成倍增加。红F2和白F2单独分别培养传代的后代生殖力比上述低，特别是白F2培养传代生殖能力明显下降，出现雄多雌少甚至达第4代时仅有雄虫，没有出现雌虫的现象[5]。在自然界单独红F2或白F2分开的可能性极少或没有这种现象存在，一般都处于红F2和白F2同时在一个孳生点杂交孳生，导致后代数量增加和传播恙虫病的威胁大，是流行病学和防制方面很重要的问题。我们还试验证明：红F2和白F2幼虫包括它的子代幼虫不仅有叮咬动物宿主的能力，并且有传病能力[6]。
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本实验室还对不同属种恙螨进行杂交试验，太平洋无前恙螨在实验培养达第2代时，仅存一个雄虫单独培养达180 d，移至新制备的培养管后，挑加入地里纤恙螨成蛹一只，该成蛹14 d羽化后为雌性成虫，这对恙螨培养159 d后太平洋无前恙螨死亡(寿命342 d)，经制片鉴定为雄虫。地里纤恙螨成虫被另被移至新制备的培养管单独培养仍继续产卵孵出幼虫(红色)，203 d后死亡(寿命365 d)，经制片鉴定为雌虫，总共孵出幼虫168个。2种恙螨配对培养观察的结果说明：地里纤恙螨雌虫似可以获得太平洋无前恙螨雄虫所产的精胞并受精产卵孵化子代幼虫。地里纤恙螨(♀，红色)和太平洋无前恙螨(♂，白色)配对杂交的子代幼虫、若虫和成虫形态、体色、幼虫背板形态和鞭状感觉毛等均似地里纤恙螨。两者杂交后代的生活史各期发育时间和成活率，与纯系地里纤恙螨对照比较未见明显差别[7]。
1.3 地里纤恙螨种株染色体与氨基酸测定
染色体是生物机体主要的遗传物质的载体，对它的研究可以了解生物的遗传变异、系统演化、性别决定，个体发育和生理过程的平衡控制等方面均有重要作用。国内外对恙螨染色体的研究仅是零星报道，因为恙螨生活史复杂，分7个变态期，有寄生生活和自由生活的交替，实验室培养不易。另外恙螨个体细小，仅仅肉眼可见，取材困难，给染色体研究带来很大困难。我们对地里纤恙螨红体色纯系及其白体色突变株染色体核型观察结果：红体色纯系恙螨的中期分裂相染色体数目为2n=14,n=7的占多数，占观察细胞的70%。所以地里纤恙螨的14个染色体可以配成7对。前4对可以看出是中部着丝粒，第5至第7对染色体则着丝粒不清。染色体的长度按顺序递减。在某些核型的2号染色体看到有明显的端部小随体，性决定机制不清。白体色突变株的二倍体染色体数目亦以2n=14，n=7为多数，占已观察细胞的80%，第1号至第4号染色体应为中部着丝粒，第5号至第7号则着丝粒不清。在某些核型中也看到2号染色体有端随体，染色体长度依次递减。纯系红体色与白体色突变株的染色体核型比较，发现它们的二倍体数目相同，都是2n=14。但第6号染色体的长度则有明显区别。把2株染色体绝对长度测验则发现第6号、7号染色体差异有显著性。结合2株恙螨的体色、活动力和生殖力等都有明显的不同，又通过杂交与传代试验证明，这些特征似乎是基于基因隐性化或丢失部分同源染色体引起的。从本试验结果2株在第6号染色体的长度有明显的差异，推测可能由于红体色的后代突变为白体色虫体后丢失一部分染色体引起的[8]。
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在2株染色体核型有差别基础上，由细胞水平到分子水平探索它们氨基酸组成和含量，可能有助于媒介恙螨传病基因的了解。地里纤恙螨红体色纯系及其白体色突变株氨基酸组成和含量测定的成虫要求虫龄和培养条件相同，测定前让成虫饥饿12～14 d，排清体内代谢产物后经测定前的各种处理，原样稀释50倍，在全自动氨基酸分析仪测定氨基酸的组成和含量，计算机记录扫描和数据处理。红体色纯系和白体色突变株均有17种氨基酸，除组氨酸外，其余氨基酸从不同程度的含量波动趋势为：2株基本一致，均以谷氨酸和甘氨酸最高，而以蛋氨酸的含量最低。红体色纯系(w红总=645.59 mg/g)的总量低于白体色突变株(w白总=749.189 mg/g)的总含量；组氨酸的含量红体色纯系(w红组=56.69 mg/g)比白体色突变株(w白组=39.11 mg/g)高外，其余16种均是红体色低于白体色，其中低于10 mg/g以上的氨基酸达5种，低于5～10 mg/g的7种，低于1～4.9 mg/g 3种，低于0.1～1 mg/g 2种，上述2体色结果不同显示，可能与白体色突变株成虫生殖能力降低与生活习性的改变有关[9]。
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2 恙螨人工接种恙虫病立克次体及其阳性恙螨模型的建立
1991年首次报告地里纤恙螨成虫腹内人工接种恙虫病立克次体Karp株获得成功。试验的恙螨是经实验室纯化证实无立克次体感染并连续饲养20代以上的成虫。培养和传代均按实验室常规方法。纯化的恙虫病立克次体Karp株对Balb/c小鼠LD50为10-6～10-8；立克次体悬液的制备是Balb/c小鼠腹腔接种富含立克次体Karp株的鼠脾悬液，发病小鼠的腹水和腹腔冲洗液经各种处理手续后制成各种浓缩立克次体悬液，涂片染色，镜检平均每视野约20个立克次体，置4 ℃冰箱当日接种。采用有刻度的微细玻璃注射针，乙醚麻醉成虫，镜下腹腔接种，每成虫接种立克次体悬液约0.1 μL以下，接种后的成虫置石膏炭粉管培育，观察存活率和生殖能力，以及立克次体的感染率和增殖情况[10]。
2.1 存活率
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共计4批恙螨(各批成虫数分别为60个，68个，42个和45个)接种10 d后的存活率为88.3%～97.8%；总共接种215个，10 d后存活201个，平均存活率93.5%。4个月后为68.9%～95.2%，总共接种215个，4个月后存活180个，平均存活率83.7%；各批对照组存活率均在96%以上[10]。
2.2 生殖能力
第一年内接种组21个雌虫，总共产卵孵出2 268个幼虫，对照组20个雌虫产卵孵出2 216个幼虫，每个雌虫平均孵出幼虫分别为108个和110.8个(P>0.05)，两组的幼虫总数无明显差异，说明立克次体接种的成虫第一年内能保持较好的生殖能力[10]。
2.3 立克次体感染和增殖
接种的成虫经过不同时间进行直接、间接免疫荧光染色法和金银免疫染色法结合透射电镜的检测结果，立克次体感染率高达41.2%以上。用PCR技术检测结果，立克次体感染率高达92.3%。经人工接种的恙虫病立克次体Karp株能在地里纤恙螨体内增殖长达360 d以上，并经卵传递至少4代。实验证明，恙螨成虫腹内人工接种立克次体不但能使恙螨有较高的感染率，而且在它体内增殖达一年以上和经卵传递达子代。这一实验感染方法的建立，对于制作立克次体阳性恙螨模型及深入研究病原体在媒介恙螨体内的定位和动态变化，以及在传病机理研究等均具有极重要的意义[10～12]。
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3 恙螨体内恙虫病立克次体的分离、检测及其效果
3.1 传统法、免疫法和透射电镜观察
一直应用的传统法分离和检测恙螨、人体内恙虫病立克次体的技术，前者是恙螨幼虫研磨浆液，后者是血液(抗凝)，进行小鼠腹腔接种后观察其发病(一般每次观察21 d左右)，病鼠解剖取腹膜液涂片(或脾组织印片)，Giemsa染色，镜检立克次体(常见在内皮细胞浆内，核旁)。盲传3次不发病为阴性结果。该法检获结果时间长，反复次数多，立克次体数少或毒性低不发病等影响检出效果。
1991年起我们应用免疫法包括直接免疫荧光染色，间接免疫荧光染色和金银免疫染色对恙螨生活史各期特别是子代幼虫体内立克次体的检测，比传统法检出率高，但抗原抗体的制备，标本制备复杂，手续繁锁，有一定的局限性，影响检出效果。1990年和1991年应用透射电镜观察人工感染恙螨体内恙虫病立克次体的分布和定位，虽然效果可靠，但技术复杂，尤其是虫体切片部位选择等问题，影响检出效果[13～16]。
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3.2 分子生物学技术
由于上述方法对恙螨体内恙虫病立克次体的检测存在许多不足之处，1991年起我们应用分子生物学技术检测恙螨体内恙虫病立克次体。
3.2.1 聚合酶链反应技术 根据恙虫病立克次体Sta58和Sta56基因序列设计合成引物，做PCR检测地里纤恙螨的两种实验感染途径(成虫人工接种和幼虫叮咬病鼠)获得立克次体的生活史各期和子代幼虫体内立克次体DNA获得成功。PCR技术检测不同途径感染恙虫病立克次体的小鼠、流行区捕获的野鼠、病人血标本亦均获成功。免疫荧光和免疫金银染色法等检测实验感染立克次体阳性的地里纤恙螨体内病原体，其阳性检出率为41.2%，而PCR检测则阳性检出率为90%以上。应用传统法：立克次体阳性地里纤恙螨幼虫研磨浆液做小鼠腹腔接种和立克次体阳性地里纤恙螨未食蚴叮咬健康小鼠，观察小鼠发病情况，解剖病鼠腹膜液涂片，染色镜检立克次体，与PCR对立克次体阳性未食蚴和饱食蚴标本的检测结果比较，传统法每组52个未食蚴，共检102组中52组阳性，阳性率为50.98%；饱食蚴每组52个，共检102组，13组阳性，阳性率为12.74%；PCR法每组5个未食蚴，共检5组中5组阳性，阳性率为100%；饱食蚴每组8个，共检8组，8组阳性，阳性率为100%；结果说明传统法检出率极低，每次所需标本量大，且实验周期长，操作复杂、繁琐，反复次数多，而PCR技术正是克服了传统法的上述缺点，特异性强，敏感性好，省时快速，阳性检出率高，还克服了传统法易出现假阴性结果[17～19]。
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3.2.2 核酸杂交技术 在国内外未见DNA探针研究恙螨体内恙虫病立克次体的文献和资料，虽然PCR和核酸杂交法同样具有独特的优点，两法均敏感、特异，稳定和高效，但PCR技术每次检测的标本数量不多，而斑点杂交检测的标本数每次可达100份。根据恙虫病立克次体Sta56基因序列合成1对引物，应用PCR反应扩增立克次体DNA来大量制备地高辛探针，试验证明该探针具有独特性的优点，方法敏感特异，且稳定、高效，适用于现场恙螨、鼠类宿主和人群等流行病学调查研究[20～24]。
4 恙螨体内恙虫病立克次体动态及其传病关系
因恙螨个体细小，生活史复杂，且周期长，用传统法分离恙虫病立克次体需要时长和阳性率低，故对立克次体在恙螨体内恙虫病立克次体动态情况尚不清楚，但恙螨体内立克次体的资料对流行病学又具有重要的意义。1991年开始在建立实验感染恙虫病立克次体的阳性恙螨模型基础上，自行设计、合成2个主要抗原基因恙虫病立克次体Sta56和Sta58引物，应用PCR技术为主，配合核酸杂交、PCR结合核酸杂交(核酸杂交检测PCR产物)和包括传统法分离立克次体法对恙螨体内恙虫病立克次体动态及其传病关系研究[25～27]。
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4.1 立克次体经期传递
恙虫病立克次体接种组成虫产卵孵出未食幼虫，叮咬健康Balb/c小鼠后检获饱食蚴，培养发育经若蛹、若虫、成蛹达成虫，各期(未食幼虫、饱食幼虫、若蛹、若虫、成蛹和成虫)的PCR检测立克次体DNA阳性率高达92.3%以上，叮咬组生活史各期和成虫产卵孵出子代未食幼虫，PCR检测立克次体DNA的阳性率高达40%以上[19，29]。
4.2 立克次体经卵传递
恙虫病立克次体接种组和叮咬组恙螨亲代成虫和传代的子代幼虫体内立克次体DNA检测结果，2组PCR检测不仅是成虫体内立克次体DNA阳性，和成虫产卵孵出的幼虫亦呈阳性外，而且2组立克次体能经卵传递多代，接种组至少达5代，叮咬组至少达3代。经长期跟踪的定期PCR检测结果，恙虫病立克次体阳性成虫及其产卵孵出的幼虫体内立克次体阳性动态一致，阳性成虫在1年内产卵孵出的幼虫具有传病能力，首次揭示了恙螨内在的传病规律，说明防治恙虫病需要长期而艰苦的努力[28，29]。
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4.3 立克次体经精胞传递
PCR技术检测恙螨体内立克次体DNA获成功后，我们应用PCR、核酸杂交、核酸杂交检测PCR产物和传统分离立克次体法等几种方法结合，检测人工接种立克次体的地里纤恙螨雄虫和非感染健康的雌虫配对培养的子代体内立克次体阳性，发现了恙螨也能经精胞传递恙虫病立克次体；经精胞传递是雌虫从培养管的炭粉上(自然界是地面)摄取雄虫产下的精胞而间接受精，从雄虫产精胞数量可使更多雌虫摄取受精，本结果给防治提出了非常重要的问题[30，31]。
地里纤恙螨成虫腹内人工接种立克次体Karp株和幼虫叮咬小鼠实验感染的恙螨，立克次体不仅1年多时间能在它体内生长繁殖，而且不断产卵孵出的子代幼虫亦携带立克次体，立克次体在恙螨体内的持续时间和经卵传递代数有一定限度，并与恙螨的感染率、立克次体数量相关，持续、反复从携带立克次体鼠，和经期、经卵及经精胞传递是保持恙螨代代体内立克次体动态的循环的基础；而循环又是恙螨体内立克次体能长期保持种族的延续和传病的动力。恙螨经期、经卵及经精胞传递恙虫病立克次体的结果，既再次证明地里纤恙螨是我国恙虫病极为重要的传播媒介，又是在该病流行动力学上具有防制重要意义的科学依据[17，18，29]。
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5 恙螨、鼠宿主和患者体内恙虫病立克次体株型特异性基因序列的扩增、鉴定及克隆
我们以恙虫病立克次体的主要表面抗原56 kDa基因编码区序列作为群、型特异性引物对构建的靶基因，因56 kDa抗原是恙虫病立克次体的主要外膜蛋白抗原，与致病性和毒力变异有关，既有种特异抗原决定簇又有株抗原决定簇。所构建的恙虫病立克次体Sta56基因特异DNA引物，检测结果显示外引物Rt34、Rt55和内引物Rt10、Rt11对恙虫病立克次体的所有5个株均可进行扩增，在约507 bp出现一清晰条带，与设计片段大小相符，而对普氏立克次体[R.prowazekii(da Rocha-Lima,1916)]、莫氏立克次体[R. Mooseri(Monteiro,1931)]则未见阳性扩增带，表明外引物Rt34、Rt55和内引物Rt10、Rt11具有很好的恙虫病立克次体种特异性。而Karp、Gilliam、Kato、Kuroki和Kawasaki株的特异性引物对则仅扩增各相应的分离株，对其他株则无扩增，所得特异性DNA片段大小分别为230、407、242、220和523 bp多核苷酸，均与设计大小相符，显示各株引物对具有很好的特异性。
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根据恙虫病立克次体56 kDa的群型特异性引物，自行设计合成后，进行套式聚合酶链反应(NPCR)对广东佛山等地有恙虫病病例住家周围现场捕获的野鼠和鼠体表检获的地里纤恙螨，以及有发热和有焦痂的典型恙虫病人等恙虫病立克次体阳性标本进行检测和分型，采用NPCR技术对上述3种标本进行恙虫病立克次体株型鉴定，用外引物Rt34、Rt55和内引物Rt10、Rt11做NPCR选出恙虫病立克次体阳性标本，病者28份、野鼠12份和恙螨7份，共47份阳性标本，进一步用各株特异性引物对进行株型鉴定，结果仅Karp株特异性引物对扩增出约230 bp大小的特异的DNA片段，其它Gilliam、Kato、Kuroki和Kawasaki均未见任何扩增带。显示广东顺德、南海等地区的流行优势株为Karp株，且媒介恙螨、野鼠宿主及患者所携带的立克次体均为同一型别[32，33]。
正体我们在Karp株特异性引物对5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点，并用这对引物从Karp株的基因组DNA中扩增出一条大小约230 bp的株特异性DNA片段，经HindⅢ和BamHⅠ酶切后，用低熔点琼脂糖胶纯化回收，以粘端连接的方式重组到酶切后的pUC18质粒，并转化入大肠杆菌TGI中，选择阳性克隆，以碱裂解法提取质粒DNA，对重组质粒进行酶切和PCR鉴定，证实有目的基因片段插入，构建了重组质粒pUC-RK[34]，为下一步的基因序列分析和株特异性基因片段表达及株型诊断性抗原的制备打下了基础。
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(1999 - 04 - 12收稿 1999 - 07 - 12修回), http://www.100md.com