胚胎肝发育相关基因-1在氯高铁血红素诱导分化的红白血病细胞中的表达
作者：王丹 汪思应 胡兆平 许望翔 杨晓明
单位：王丹(安徽省立医院输血科，合肥 230001)；汪思应(安徽医科大学病理生理学教研室，合肥 230032)；胡兆平(安徽省立医院输血科，合肥 230001)；许望翔 杨晓明(北京军事医学科学院二所十室，北京 100051)
关键词：血液肿瘤；氯化血红素
安徽医科大学学报报000503 摘要：目的 研究胚胎肝发育相关基因-1(EDAG-1)在红系肿瘤分化中的表达及意义。方法 用细胞生物学、RT-PCR及Northern杂交法。结果 含4.0×10-5 mol*L-1氯高铁血红素(Hemin)的RPMI 1640培养K562细胞5天，可使70%～80%细胞呈现正常红系特征； EDAG-1 、c-fos表达降低。结论 Hemin可诱导红白血病细胞分化； EDAG-1、 c-fos表达下调可能与其有关。
, 百拇医药
自由词：胚胎肝发育相关基因-1
中图书类号：R733.7 文献标识码：A
文章编号：1000-1492(2000)05-0336-03
肿瘤的诱导分化是目前临床及基础研究的热门课题，已发现大多数肿瘤尤其是血液系统肿瘤可被诱导向正常细胞转化，但分化的机制却不明了。胚胎肝发育相关基因-1(EDAG-1)是我们在用RDA技术建立的4月龄人胎肝组织与成年肝组织的差异表达基因EST文库中发现的一株未注册序列，Northern 杂交表明其mRNA约2.2 kb,经筛选人胎肝cDNA文库获1.9 kb的片段，进而利用5′RACE技术获得该基因全长序列，序列分析表明该基因编码的是由309个氨基酸组成的蛋白质，经检索与GeneBank注册序列无同源序列，已在GeneBank注册(注册号bankit316865AF228713)，命名为EDAG-1。初步揭示该基因特异高表达在人胎肝组织及部分肿瘤细胞中，在成人心、肝、脾、肺、脑、胸腺、肌肉等组织均无表达(待发表资料)。鉴于4 月龄人胎肝组织富含细胞增殖、分化相关基因，我们推测该基因可能与血细胞增殖、分化有关。因此我们检测该基因在Hemin诱导分化的人红白血病细胞中的表达，观察是否与红系分化、增殖相关及在红白血病细胞诱导分化中的意义。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 K562细胞培养、诱导分化及联苯胺染色鉴定 K562 细胞由军科院基础医学研究所三所王敦成博士惠赠。按常规将细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640中，37℃、5% CO2条件下培养。取呈指数生长期K562细胞按1×109个*L-1细胞浓度，加含4.0×10-5 mol*L-1 Hemin(Sigma)的上述培养液持续培养5天。取正常K562及氯高铁血红素(Hemin)诱导培养1～5天的细胞滴片，甲醛固定，滴加1%联苯胺染液3 min，滴加7.5%双氧水1 min，蒸馏水冲洗后加瑞氏液染色，水洗，干燥，光镜(10×100)计数染色阳性细胞。其中红系细胞经联苯胺染色后，胞浆呈现黄褐色，胞核为紫蓝色(计为阳性)。
1.2 3H-TdR掺入法检测K562细胞增殖能力 详见参考文献〔1〕。
, 百拇医药
1.3 细胞总RNA的提取 取诱导培养不同时间的K562细胞，用Promege公司RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并紫外光定量。
1.4 EDAG-1 cDNA探针的制备 采用随机引物标记法。DNA模板25 ng，加入10 μl标记5×buffer, 3 mol*L-1 dGTP、dTTP 、dCTP混合液各2 μl, BSA 2 μl, DNA多聚酶5U及α-32P-dATP 5 μl,反应体积50 μl,室温1 h后终止反应并用Sephdex G-50柱纯化探针。
1.5 Northern 杂交 取K562细胞总RNA 30 μg进行1%甲醛变性凝胶电泳，转印硝酸纤维素膜，膜在80℃烘干2 h，加入6×SSC，5×Denhandts, 0.5% SDS, 1.0×10-4 mg*L-1鲑精DNA，在68℃预杂交1 h，加入变性后探针，68℃杂交过夜；以含0.5% SDS的2×SSC室温下洗膜2次，再用含0.5% SDS的0.5%×SSC 50℃洗膜2次,室温干燥后-70℃下放射自显影。
, 百拇医药
1.6 RT-PCR 以Oligo(DT)为起始引物，加入K562细胞总RNA 1 μg ,72℃ 10 min后, 依次加入无RNase水，10×RT buffer, 2.5×10-2 mol*L-1 MgCl2, 2.5×10-4 mol*L-1 dNTPs, RNasin和AMV逆转录酶，反应体系为20 μl, 42℃保温 15 min后,加去离子水至100 μl。并以此为模板进行PCR。 PCR引物如下：
c-fos sense 5′-GAGCTGACAGATACACTCCAAGCG-3′
antisense5′- CAGTCTGCTGCATAGAAGGAACCG-3′
G3PDH sense 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′
, 百拇医药
antisense5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′
取逆转录产物5 μl为模板，依次加入10×buffer, 2.5×10-3 mol*L-1 dNTPs, 上下游引物，去离子水和Taq酶，反应体积为25 μl, 循环条件为94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min，共18或30循环，在同一条件下，每次PCR以G3PDH作内对照，PCR产物经1.5%琼脂糖中电泳，凝胶成像仪扫描成像。
2 结果
2.1 Hemin 诱导K562细胞向红系分化及细胞增殖检测：联苯胺染色发现，经Hemin诱导培养5天，约70% K562细胞胞浆呈黄褐色，而正常培养的K562细胞仅有6%左右呈黄褐色胞浆(图1)；细胞增殖性检测发现经Hemin诱导后，K562细胞3H掺入明显降低(表1)。
, 百拇医药
图1 Hemin诱导对K562细胞分化的影响
A.RPMI 1640+Hemin培养5天的K562；
B.RPMI 1640培养的K562
2.2 EDAG-1在诱导分化的K562细胞中的表达 用α-32P标记EDAG-1cDNA 探针进行Northern Blotting, 结果显示，在Hemin诱导培养而向红系分化的K562细胞中，EDAG-1表达水平明显下调(图2)。
表1 Hemin诱导对K562细胞增殖的影响 (n=5)
Hemin诱导
3H掺入CPM(
±s)
, 百拇医药
联苯胺染色阳性(%)
0天
6 054.3±655.5
6
1天
5 774.8±391.9
14
2天
5 710.3±513.9
17
3天
4 356.3±638.3**
, 百拇医药
19
4天
1 943.5±146.0**
35
5天
1 870.5±831.6**
73
t检验，与0天比较：**P<0.01
图2 EDAG-1在Hemin诱导分化的K562细胞中的表达
上排：18 s RNA 下排:2.2 kb EDAG-1
, 百拇医药
2.3 c-fos在K562细胞中的表达 用正常及经Hemin诱导培养的K562细胞总RNA(各1 μg)反转录产物进行PCR, 结果显示，c-fos在K562细胞组，18或30循环PCR均出现明显阳性扩增，而在Hemin诱导分化K562细胞组，30循环PCR仅出现弱阳性扩增，18循环PCR无明显阳性扩增(图3)。
图3 c-fos在不同处理K562细胞中的表达
A.18循环；B.30循环；C.G3PDH 内对照；D.DL2000 Marker; E.Hemin诱导5天的K562细胞组；F.正常K562细胞组
3 讨论
K562细胞是人红白血病肿瘤细胞，具备恶性肿瘤细胞生物学特征。它也可被不同试剂诱导向正常细胞分化，如维甲酸及DMSO可诱导其向粒系分化； Hemin等可诱导其向红系分化〔2〕。在向红系分化过程中，细胞逐渐表现幼红细胞的某些特征如胞浆中出现血红蛋白等，同时细胞增殖能力下降。本研究用含4.0×10-5 mol*L-1 Hemin的RPMI 1640培养诱导K562细胞，使其向红系分化。实验发现随Hemin 诱导时间增加，3H掺入明显降低，说明K562细胞的增殖能力下降。同时联苯胺染色发现有约70%的胞浆呈黄褐色的细胞，表明有大部分K562细胞已分化成红系细胞，具有产生血红蛋白的能力。
, http://www.100md.com
我们已发现EDAG-1在胚胎及部分肿瘤组织中高丰度表达(待发表资料)。本实验Northern杂交也证实其在K562细胞中高表达，而在经Hemin诱导4～5天 K562细胞中表达明显下调，提示该基因可能与细胞增殖或分化尤其是红系的分化相关，但机制不清。RT-PCR发现c-fos在Hemin诱导5天的K562细胞中表达也明显下调,这类下调在其它肿瘤诱导分化过程中常常见到，被认为是肿瘤诱导分化的机制之一〔3〕。本实验结果中EDAG-1与c-fos表达降低的意义及相互关系有待进一步研究。
Expression of EDAG-1 genes in K562 cells induced by hemin
Wang Dan, Wang Siying, Hu Zhaoping et al
(Dept of Hematology, Anhui Provincial Hosptial,Hefei 230001)
, 百拇医药
Abstract：Objective To study the expression and role of EDAG-1 in erythroleukemia differentiation induced by Hemin. Methods Techniques of cellular biology were used to analyse K562 cells differentiation; Northern blotting and RT-PCR were used to study the expression of EDAG-1 and c-fos gene. Results 70%～80% K562 cells were induced to differentiate to erythrocytes by 4.0×10-5 mol*L-1 Hemin; There was slower proliferation in these cells; the expression of the EDAG-1 and c-fos decreased in differentiated K562 cells. Conclusion K562 cells can be induced to differentiate by Hemin. EDAG-1 and c-fos may be involved in the process.
, 百拇医药
MeSH：hemotologic neoplasms;hemin
Free words：EDAG-1
基金项目：国家自然科学基金资助课题(编号：39670366)
作者简介：王丹，女，35岁，检验师；杨晓明，男，38岁，博士，副研究员
参考文献
1，邓松华，汪思应，程 洁 等.己烯雌酚对肿瘤生长、转移的影响及机制探讨.临床与实验病理学杂志，1998;14(3)：279～281
2，程惠黎.肿瘤逆转.见：汤钊猷主编.现代肿瘤学, 上海:上海医科大学出版社，1993：157～167
2000-08-11收稿
2000-08-29修回, 百拇医药
单位：王丹(安徽省立医院输血科，合肥 230001)；汪思应(安徽医科大学病理生理学教研室，合肥 230032)；胡兆平(安徽省立医院输血科，合肥 230001)；许望翔 杨晓明(北京军事医学科学院二所十室，北京 100051)
关键词：血液肿瘤；氯化血红素
安徽医科大学学报报000503 摘要：目的 研究胚胎肝发育相关基因-1(EDAG-1)在红系肿瘤分化中的表达及意义。方法 用细胞生物学、RT-PCR及Northern杂交法。结果 含4.0×10-5 mol*L-1氯高铁血红素(Hemin)的RPMI 1640培养K562细胞5天，可使70%～80%细胞呈现正常红系特征； EDAG-1 、c-fos表达降低。结论 Hemin可诱导红白血病细胞分化； EDAG-1、 c-fos表达下调可能与其有关。
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自由词：胚胎肝发育相关基因-1
中图书类号：R733.7 文献标识码：A
文章编号：1000-1492(2000)05-0336-03
肿瘤的诱导分化是目前临床及基础研究的热门课题，已发现大多数肿瘤尤其是血液系统肿瘤可被诱导向正常细胞转化，但分化的机制却不明了。胚胎肝发育相关基因-1(EDAG-1)是我们在用RDA技术建立的4月龄人胎肝组织与成年肝组织的差异表达基因EST文库中发现的一株未注册序列，Northern 杂交表明其mRNA约2.2 kb,经筛选人胎肝cDNA文库获1.9 kb的片段，进而利用5′RACE技术获得该基因全长序列，序列分析表明该基因编码的是由309个氨基酸组成的蛋白质，经检索与GeneBank注册序列无同源序列，已在GeneBank注册(注册号bankit316865AF228713)，命名为EDAG-1。初步揭示该基因特异高表达在人胎肝组织及部分肿瘤细胞中，在成人心、肝、脾、肺、脑、胸腺、肌肉等组织均无表达(待发表资料)。鉴于4 月龄人胎肝组织富含细胞增殖、分化相关基因，我们推测该基因可能与血细胞增殖、分化有关。因此我们检测该基因在Hemin诱导分化的人红白血病细胞中的表达，观察是否与红系分化、增殖相关及在红白血病细胞诱导分化中的意义。
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1 材料与方法
1.1 K562细胞培养、诱导分化及联苯胺染色鉴定 K562 细胞由军科院基础医学研究所三所王敦成博士惠赠。按常规将细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640中，37℃、5% CO2条件下培养。取呈指数生长期K562细胞按1×109个*L-1细胞浓度，加含4.0×10-5 mol*L-1 Hemin(Sigma)的上述培养液持续培养5天。取正常K562及氯高铁血红素(Hemin)诱导培养1～5天的细胞滴片，甲醛固定，滴加1%联苯胺染液3 min，滴加7.5%双氧水1 min，蒸馏水冲洗后加瑞氏液染色，水洗，干燥，光镜(10×100)计数染色阳性细胞。其中红系细胞经联苯胺染色后，胞浆呈现黄褐色，胞核为紫蓝色(计为阳性)。
1.2 3H-TdR掺入法检测K562细胞增殖能力 详见参考文献〔1〕。
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1.3 细胞总RNA的提取 取诱导培养不同时间的K562细胞，用Promege公司RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并紫外光定量。
1.4 EDAG-1 cDNA探针的制备 采用随机引物标记法。DNA模板25 ng，加入10 μl标记5×buffer, 3 mol*L-1 dGTP、dTTP 、dCTP混合液各2 μl, BSA 2 μl, DNA多聚酶5U及α-32P-dATP 5 μl,反应体积50 μl,室温1 h后终止反应并用Sephdex G-50柱纯化探针。
1.5 Northern 杂交 取K562细胞总RNA 30 μg进行1%甲醛变性凝胶电泳，转印硝酸纤维素膜，膜在80℃烘干2 h，加入6×SSC，5×Denhandts, 0.5% SDS, 1.0×10-4 mg*L-1鲑精DNA，在68℃预杂交1 h，加入变性后探针，68℃杂交过夜；以含0.5% SDS的2×SSC室温下洗膜2次，再用含0.5% SDS的0.5%×SSC 50℃洗膜2次,室温干燥后-70℃下放射自显影。
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1.6 RT-PCR 以Oligo(DT)为起始引物，加入K562细胞总RNA 1 μg ,72℃ 10 min后, 依次加入无RNase水，10×RT buffer, 2.5×10-2 mol*L-1 MgCl2, 2.5×10-4 mol*L-1 dNTPs, RNasin和AMV逆转录酶，反应体系为20 μl, 42℃保温 15 min后,加去离子水至100 μl。并以此为模板进行PCR。 PCR引物如下：
c-fos sense 5′-GAGCTGACAGATACACTCCAAGCG-3′
antisense5′- CAGTCTGCTGCATAGAAGGAACCG-3′
G3PDH sense 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′
, 百拇医药
antisense5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′
取逆转录产物5 μl为模板，依次加入10×buffer, 2.5×10-3 mol*L-1 dNTPs, 上下游引物，去离子水和Taq酶，反应体积为25 μl, 循环条件为94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min，共18或30循环，在同一条件下，每次PCR以G3PDH作内对照，PCR产物经1.5%琼脂糖中电泳，凝胶成像仪扫描成像。
2 结果
2.1 Hemin 诱导K562细胞向红系分化及细胞增殖检测：联苯胺染色发现，经Hemin诱导培养5天，约70% K562细胞胞浆呈黄褐色，而正常培养的K562细胞仅有6%左右呈黄褐色胞浆(图1)；细胞增殖性检测发现经Hemin诱导后，K562细胞3H掺入明显降低(表1)。
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图1 Hemin诱导对K562细胞分化的影响
A.RPMI 1640+Hemin培养5天的K562；
B.RPMI 1640培养的K562
2.2 EDAG-1在诱导分化的K562细胞中的表达 用α-32P标记EDAG-1cDNA 探针进行Northern Blotting, 结果显示，在Hemin诱导培养而向红系分化的K562细胞中，EDAG-1表达水平明显下调(图2)。
表1 Hemin诱导对K562细胞增殖的影响 (n=5)
Hemin诱导
3H掺入CPM(
±s), 百拇医药
联苯胺染色阳性(%)
0天
6 054.3±655.5
6
1天
5 774.8±391.9
14
2天
5 710.3±513.9
17
3天
4 356.3±638.3**
, 百拇医药
19
4天
1 943.5±146.0**
35
5天
1 870.5±831.6**
73
t检验，与0天比较：**P<0.01
图2 EDAG-1在Hemin诱导分化的K562细胞中的表达
上排：18 s RNA 下排:2.2 kb EDAG-1
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2.3 c-fos在K562细胞中的表达 用正常及经Hemin诱导培养的K562细胞总RNA(各1 μg)反转录产物进行PCR, 结果显示，c-fos在K562细胞组，18或30循环PCR均出现明显阳性扩增，而在Hemin诱导分化K562细胞组，30循环PCR仅出现弱阳性扩增，18循环PCR无明显阳性扩增(图3)。
图3 c-fos在不同处理K562细胞中的表达
A.18循环；B.30循环；C.G3PDH 内对照；D.DL2000 Marker; E.Hemin诱导5天的K562细胞组；F.正常K562细胞组
3 讨论
K562细胞是人红白血病肿瘤细胞，具备恶性肿瘤细胞生物学特征。它也可被不同试剂诱导向正常细胞分化，如维甲酸及DMSO可诱导其向粒系分化； Hemin等可诱导其向红系分化〔2〕。在向红系分化过程中，细胞逐渐表现幼红细胞的某些特征如胞浆中出现血红蛋白等，同时细胞增殖能力下降。本研究用含4.0×10-5 mol*L-1 Hemin的RPMI 1640培养诱导K562细胞，使其向红系分化。实验发现随Hemin 诱导时间增加，3H掺入明显降低，说明K562细胞的增殖能力下降。同时联苯胺染色发现有约70%的胞浆呈黄褐色的细胞，表明有大部分K562细胞已分化成红系细胞，具有产生血红蛋白的能力。
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我们已发现EDAG-1在胚胎及部分肿瘤组织中高丰度表达(待发表资料)。本实验Northern杂交也证实其在K562细胞中高表达，而在经Hemin诱导4～5天 K562细胞中表达明显下调，提示该基因可能与细胞增殖或分化尤其是红系的分化相关，但机制不清。RT-PCR发现c-fos在Hemin诱导5天的K562细胞中表达也明显下调,这类下调在其它肿瘤诱导分化过程中常常见到，被认为是肿瘤诱导分化的机制之一〔3〕。本实验结果中EDAG-1与c-fos表达降低的意义及相互关系有待进一步研究。
Expression of EDAG-1 genes in K562 cells induced by hemin
Wang Dan, Wang Siying, Hu Zhaoping et al
(Dept of Hematology, Anhui Provincial Hosptial,Hefei 230001)
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Abstract：Objective To study the expression and role of EDAG-1 in erythroleukemia differentiation induced by Hemin. Methods Techniques of cellular biology were used to analyse K562 cells differentiation; Northern blotting and RT-PCR were used to study the expression of EDAG-1 and c-fos gene. Results 70%～80% K562 cells were induced to differentiate to erythrocytes by 4.0×10-5 mol*L-1 Hemin; There was slower proliferation in these cells; the expression of the EDAG-1 and c-fos decreased in differentiated K562 cells. Conclusion K562 cells can be induced to differentiate by Hemin. EDAG-1 and c-fos may be involved in the process.
, 百拇医药
MeSH：hemotologic neoplasms;hemin
Free words：EDAG-1
基金项目：国家自然科学基金资助课题(编号：39670366)
作者简介：王丹，女，35岁，检验师；杨晓明，男，38岁，博士，副研究员
参考文献
1，邓松华，汪思应，程 洁 等.己烯雌酚对肿瘤生长、转移的影响及机制探讨.临床与实验病理学杂志，1998;14(3)：279～281
2，程惠黎.肿瘤逆转.见：汤钊猷主编.现代肿瘤学, 上海:上海医科大学出版社，1993：157～167
2000-08-11收稿
2000-08-29修回, 百拇医药