骨髓移植后的免疫治疗
作者：江浩 陆道培 郭乃榄 卢锡京 童春荣 耿彦彪
单位：北京医科大学人民医院血液病研究所，北京 100044
关键词：骨髓移植；免疫疗法；肿瘤复发；局部；预防和控制；白血病；治疗
北京医科大学学报990504 摘 要 目的：研究免疫治疗用于治疗及预防骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)后的白血病复发。方法：A组为异基因骨髓移植(Allo-BMT)后白血病复发患者10例，接受供者白细胞治疗。B组为自身外周血干细胞移植(autogenous peripheral blood stem cells transplantation, APBSCT)或BMT后共10例患者输注免疫杀伤细胞(cytokine-induced killer， CIK)细胞治疗。结果：A组患者中血液学复发的6例，1例Ph1染色体100%转阴，无病存活至今已超过18个月，4例达暂时缓解；1例未缓解；微小残留及中枢神经系统复发共4例，均完全缓解，其中Ph1染色体全部转阴。B组10例中1例患者带有的白血病融合基因转阴。结论：(1)供者白细胞的输注能使某些BMT后慢性粒细胞性白血病遗传学及血液学复发患者完全缓解。(2)CIK细胞输注是安全的，对某些白血病复发患者的治疗是有效的。
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中国图书资料分类法分类号 R733.7
Immunotherapy after bone marrow transplantation
JIANG Hao, LU Dao-Pei, GUO Nai-Lan, LU Xi-Jing, TONG Chun-Rong， GENG Yan-Biao
(Institute of Hematology， People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Bone marrow transplant Immunotherapy Neoplasm recurrence, local/prev Leukemia/ther
ABSTRACT Objective: To study immunotherapy for leukemia relapse and prophylaxis after bone marrow transplantation(BMT). Methods: In group A, 10 cases of leukemia relapse after Allo-BMT were treated with concentrated mononuclear cells from the marrow donor. In group B, 10 cases of leukemia after APBSCT (autogenous peripheral blood stem cells transplantation) or BMT were treated with CIK (cytokine induced killer) cells. Results: Among 6 patients with hematological relapse in group A, one patient has being living well for 18 months with disappearance of the Ph1 chromosome. 4 patients showed temporary remission and then relapsed again. One patient showed no response. The other 4 patients (2 with CNS relapse and 2 patients with relapse of minimal residual disease) showed remission, and remained Ph1 chromosome negative. In group B, a patient treated with CIK cells with a special leukemia infused gene (AML/ETO) turned negative after one treatment of CIK cells. Conclusion: (1) Donor derived leukocyte infusion can induce CML post-BMT to cytogenetic and hematological CR. It has also therapeutic effects on acute leukemia relapse but is less sustained. (2) CIK cells can be safely infused into patients and is effective in the therapy of leukemia relapse at least in some patients.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:395-399)
骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)给白血病患者带来根治疾病、长期存活的机会,但无论是异基因还是自体骨髓移植，都存在一定的复发率。自体骨髓由于移植缺乏异基因骨髓移植(Allo-BMT)所具有的移植物抗白血病(GVL)作用，所以Auto-BMT后白血病复发更是影响患者长期存活的主要原因。复发提示BMT后患者体内仍存在着少量的肿瘤细胞。由于BMT前患者所处的疾病状态，对移植相关毒副作用的耐受力及对化疗药物的耐药情况不同，复发后患者很难再次缓解。近年来，BMT后免疫治疗给这部分患者带来希望，Allo-BMT后给白血病复发患者输注供者白细胞进行过继免疫治疗，国外已有诸多报道[1～4]，其中部分患者达到缓解并长期存活。在我们所的临床研究中，也得到同样疗效。免疫杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)是多种因子激活的杀伤细胞，在体外具有明显的增殖及高杀伤活性。美国斯坦福大学介绍了CIK细胞的培养程序,在动物体内应用发现这种细胞的体内抗肿瘤效果远高于LAK细胞[5]。我们在现有实验室条件下培养出一定量的CIK细胞，主要用于临床自体BMT后复发的预防或治疗。本文观察了BMT后患者输注供者白细胞或各种细胞因子和抗CD3单抗共同激活的CIK细胞的反应。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病例选择
本文观察两组患者为1991～1997年间在我院接受骨髓移植后复发就诊于本所的患者。A组：Allo-BMT后白血病复发患者10例，接受供者白细胞治疗;平均年龄31.4岁(18～45)；男6例，女4例；诊断为CML-CP 5例、AML-CR1 3例、AML-CR2 1例、ALL-CR1 1例。供者均为患者同胞，HLA配型和MLC(混合淋巴培养)均与患者相合。10例患者于Allo-BMT后+60至+1 277天白血病复发，复发状态为2例遗传学复发，2例脑膜白血病复发，5例血液学复发，1例表现为髓外复发，全身广泛皮下结节。其中2例脑膜白血病复发患者予鞘内注射(阿糖胞苷30 mg/次或甲氨喋呤10 mg/次)后完全缓解。7例患者予以联合化疗，1例未化疗。化疗结果：3例达完全缓解，1例部分缓解，3例患者未缓解。详见表1、2。B组：观察1995～1997年造血干细胞移植后接受CIK细胞治疗的患者10例，平均年龄为33岁(14～44)；男6例，女4例；诊断为AML-CR1 3例、AML-CR2 2例、ALL-CR1 5例；分别为接受自体PBSCT 8例、同基因BMT 1例和异基因BMT者1例。
, 百拇医药
表1 A组血液学复发患者输注供者白细胞前后情况及结果
Table 1 Donor derived leukocyte (DDL) for gross hematological relapse in group A UPN
Relapse
Chemotherapy
Infusion of DDL
Outcome
t(post
-BMT)
/d
Status
, 百拇医药
Yes
(No)
Result
t(post-
relapse)
/d
No. of
treatments
t(interval)
/d
MNC
(×108/kg)
, 百拇医药
GVHD
t(alive and
well)
/months
t(relapse
from
therapy)/
months
t(post-
relapse)
/d
Grade
, 百拇医药
47
80
AML
Yes
CR
12
4
13-28
14.76
-
10
89
62
, http://www.100md.com APL
Yes
PR
56
3
10-15
2.72
49
Ⅳ
Disappearance of subcutaneous node; died of IP.
(subcutaneous node)
85
, http://www.100md.com
1030
APL
Yes
CR
20
2
15
4.0
90
Ⅱ，S
7
228
89
CML/Ph1+
, 百拇医药
Yes
NR
38
2
14
3.52
3
Ⅱ
3
247
165
CML/Ph1+
Yes
, http://www.100md.com
NR
3
2
27
2.43
-
NR
104
1277
CML/Ph1+
Yes
CR
10
, 百拇医药
6
7-15
5.23
30
Ⅱ
>18
UPN, unique patient number; MNC， mononuclear cells； GVHD， graft versus host disease； IP， interstitial pneumonia； S, system; CR, complete remission; PR, partly remission; NR, no response; APL, acute promyelocytic leukemia.表2 A组遗传学及中枢神经系统白血病复发患者输注供者白细胞治疗情况
, 百拇医药
Table 2 Donor derived leukocyte (DDL) for cytogenetic or CNS relapse in group A
UPN
Relapse
Chemotherapy
Infusion of DDL
Outcome
t(post
-BMT)
/d
Status
, 百拇医药 Yes
(No)
Result
t(post-
relapse)
/d
No. of
treatments
t(interval)
/d
MNC
(×108/kg)
, 百拇医药
GVHD
t(alive and
well)
/months
t(post-
relapse)
/d
Grade
54
61
CNS(APL)
Yes
CR
, 百拇医药
41
1
2.29
15
Ⅰ,S
>76
50
268
CNS(ALL)
Yes
CR
23
2
, http://www.100md.com 60
0.68
-
>72
137
214
Ph1+5%(CML)
Yes
NR
56
2
7
3.92
, 百拇医药
22
Ⅰ,S
>19**
179
97
Ph1+5%(CML)
No
133
2
7
173
88
Ⅰ
, 百拇医药
>30
UPN, unique patient number; CNS， central nervous system； **， died later of acute pancreatitis; S,system.1.2 BMT预处理方案
两种方案分别为：(1)全身照射+环磷酰胺(TBI)方案：环磷酰胺1.8 g.m-2×2 d静脉滴注，甲环亚硝脲250 mg.m-2×1 d口服，单次全身照射770～800 cGy。剂量率为2.5～5.0 cGy.min-1。(2)改良马利兰+环磷酰胺方案(BUCY)：羟基脲每千克体重40 mg，口服×2次，阿糖胞苷1～2 g.m-2×2 d，马利兰每千克体重4 mg×3 d，环磷酰胺1.8 g.m-2静脉滴注×2 d，甲环亚硝脲：250 mg.m-2×1 d口服。A组除1例CML患者应用BUCY方案外，其余均应用环磷酰胺/全身照射(CY/TBI)方案。B组除1例Allo-BMT患者应用CY/TBI方案外，其它9例患者均应用BUCY方案。
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1.3 移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)预防方案
所有Allo-BMT患者采用环孢菌素A(CsA)加短程的甲氨喋呤(MTX)方案预防GVHD。于Allo-BMT 后第1天予MTX15 mg.m-2静脉滴注，术后第3、6、11天予MTX 10 mg.m-2静脉滴注。CsA自Allo-BMT前1天开始，每天每千克体重2.5 mg, 分2次静脉滴注。待预处理胃肠反应消失后改为口服，起始剂量每千克体重每天6 mg，3个月后逐渐减量。总用药时间半年左右。其中4例患者加用过小剂量皮质激素治疗。
1.4 输注供者白细胞的免疫治疗
(1)治疗方法：A组均为Allo-BMT后白血病复发者，对于临床复发者先化疗，之后输注取自同一供者、用Cs3000血细胞分离机分离的白细胞，化疗及输注白细胞情况详见表1、2。(2)治疗后监测：A组患者输注供者白细胞后观察出现的GVHD症状和体征，记录出现GVHD的详细过程及治疗。并于输白细胞后定期复查血常规、血白细胞分类、骨髓形态学及遗传学检测。(3)诱发GVHD的处理：急性GVHD，Ⅰ度不加处理，Ⅱ度以上加用甲基强的松龙20～40 mg.d-1。必要时与CsA合用。
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1.5 CIK细胞的制备方法
(1)配制RPMI1640培养液。(2)严格无菌操作下配制10 g.L-1的白蛋白生理盐水。(3)培养操作程序：用Cs3000血细胞分离机分离患者外周血单个核细胞。得到的外周血单个核细胞用RPMI1640培养液洗涤两遍，离心速度1 700 r.min-1，共30 min。配制完全培养液(含AB血清50～80 g.L-1)。将细胞置于培养袋中，加入完全培养液使细胞浓度为2×106 ml-1。培养第1天加入γ-IFN，使浓度为1 000 U.ml-1。培养第2天加入抗CD3单抗每毫升50 mg，IL-2 1 000 U.ml-1，IL-1 500 U.ml-1。以后每3天更换新的培养液及添加IL-2，在37 ℃饱和湿度的CO2孵箱内培养10～14 d。培养结束前进行细菌培养检测及细胞杀伤活性检测。将培养袋内的细胞悬液分装入血液分浆袋。离心速度1 700 r.min-1，30 min，用分浆夹挤出上清，加入含10 g.L-1人血白蛋白的生理盐水洗两遍。将最后得到的细胞悬液加入10 g.L-1白蛋白生理盐水并加入IL-2 2×104 U。
, 百拇医药
1.6 输注CIK细胞的治疗
(1)方法：将培养10 d后的CIK细胞输给患者，并给予IL-2。每次输注CIK细胞时间、次数及细胞总数详见表3。(2)治疗后监测：观察输注CIK细胞前后2周内血常规、血生化的变化。血常规每周2次，血生化每周1次。记录每次输注CIK细胞后有无寒战、发热、过敏及心肺功能变化。每两周进行骨髓形态学及遗传学检测。(3)统计学处理采用配对t检验。
表3 B组10例患者接受CIK细胞治疗情况及结果
Table 3 Patients receiving CIK cells for prophylaxis/treatment of relapse in group B UPN
Diagnosis
Relapse
, 百拇医药
Other
therapy
Infusion of CIK cells
Outcome
t(post
BMT/
PBSCT)
/months
Status
t(post
BMT/PBSCT)
/months
, 百拇医药
MNC
(×109 cells)
No. of
treatment
t(alive and well)
/months
t(relapse)/
months
2
AML
13
AML1/ETO(+)
, 百拇医药
No
15
14.3
1
>27 AML1/ETO(-)
.HCV.NA(+)
HCV.RNA(-)
4
AML
No
IFN
2
, 百拇医药
9.7
1
>23
6
AML
No
No
3*
8.7
1
3
7
ALL
, http://www.100md.com
No
No
3*
9.4
1
1
8
AML
No
No
2
43.78
3
, http://www.100md.com
>17
9
ALL
No
No
2
32.9
2
>13
11
ALL
No
No
4
, 百拇医药
12
1
>2
12
ALL
No
No
5
27.5
1
>8
13
ALL
No
, 百拇医药
No
8
16.72
1
>6
14
AML
No
No
3
8.7
1
1
UPN, unique patient number; *， 5% blast cells in bone marrow.
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2 结果
2.1 输注供者白细胞治疗组
患者于白血病复发后3～133 d开始输注供者白细胞 ，输注次数、间隔及有核细胞数见表1及表2。根据复发状态分为遗传学和中枢神经系统白血病复发组及血液学复发组，在遗传学和中枢神经系统白血病复发组中(2例遗传学复发及2例脑膜白血病复发)，输注供者白细胞后3例出现Ⅰ度GVHD，其中2例合并慢性GVHD，白血病均得到控制。其中1例CML患者，复发时Ph1阳性染色体占5%，干扰素治疗后升至44%，免疫治疗后Ph1染色体全部阴转。另1例患者复发时Ph1阳性染色体占5%，未经化疗，输注供者白细胞后，未查染色体，存活至今超过30个月，见表2。血液学复发组6例患者中，4例患者出现急性GVHD(Ⅱ～Ⅳ度)。1例合并慢性GVHD。6例患者中3例分别于治疗后3、7、10个月复发。1例皮下结节患者皮下结节消退，但因合并间质性肺炎，于治疗后2个月死亡。1例患者治疗后无反应，死于亚急性重型肝炎。仅1例患者Ph1阳性染色体由70%降为0，并持续Ph1阴性，至今已存活18个月，见表1。
, 百拇医药
2.2 CIK细胞治疗
2.2.1 对生理功能的影响
B组10例患者应用CIK细胞/IL-2治疗，其中1例患者应用3个疗程，1例患者应用2个疗程，其他患者均应用1个疗程。全部患者在输注CIK细胞过程中没有明显的不适，无1例出现发热、寒战，对心血管系统影响不大。仅1例患者输注时出现室性早搏，减慢输注速度后，心律恢复正常。无1例出现气促、气喘。
对血液生化的影响：由于许多血液病患者都合并有肝炎，故可能在输CIK细胞前肝功能已异常。但本观察发现，10例患者治疗前、后肝、肾功能各项指标经配对t检验，统计学差异无显著性(P>0.05)。CIK细胞的输注对患者肝、肾功能无明显影响(见表4)。
表4 B组患者输注CIK细胞前后血生化参数(
±s)
, 百拇医药
Table 4 Index of blood biochemistry pre-
and post-infusing CIK cells in group B (±s)
Pre-
Post-
±Sd
c(ALT)/nmol.s-1.L-1
797±705
707±600
, 百拇医药
-90±390
c(AST)/nmol.s-1.L-1
680±421
502±322
-247±190
c(T-BIL)/μmol.L-1
14.5±6.7
15.2±4.7
0.7±4.3
c(BUN)/mmol.L-1
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3.7±1.6
3.8±1.1
-0.4±1.1
c(UA)/μmol.L-1
203±76
198±95
4±98
UPN, unique patient number; ALT， alanine aminotransferase； AST， aspartate aminotransferase； T-BIL， total bilirubin； BUN， blood urea nitrogen； UA， urea acid； P>0.05 , compared with pre-infusing.
, 百拇医药
对血液系统的影响：10例患者输注CIK细胞后白细胞计数升高，但升高程度不大，尚在正常范围内，对红细胞、血小板系统影响不大。治疗前、后外周血白细胞、血红蛋白、血小板各项指标经配对t检验，差异无显著性(P>0.05，表5)。
表5 B组患者输注CIK细胞前后血常规参数(±s)
Table 5 Index of blood routine pre- and post-infusing CIK
cells in group B (±s)
Pre-
Post-±Sd
, 百拇医药
N(WBC)/×109 L-1
4.4±1.3
5.3±1.8
0.9±1.3
N(RBC)/×1012 L-1
3.5±1.0
3.5±0.9
0.1±0.3
ρ(Hb)/g.L-1
120±29
, 百拇医药
122±29
2±9
N(PLT)/×109 L-1
113±73
120±78
8±13
WBC， white blood cells； RBC， red blood cells； Hb， hemoglobin； PLT， platelet； *P>0.05, compared with pre-infusing.
2.2.2 CIK细胞/IL-2的疗效 患者输注CIK细胞的时间、有核细胞数及次数详见表3。1例Allo-BMT后白血病复发患者于复发后2个月输注CIK细胞治疗。治疗后白血病融合基因(AML1/ETO)转阴，同时HCV-RNA也由阳性转为阴性，至今无病存活>27个月，且复查AML1/ETO持续阴性。其他8例自体PBSCT后及1例同基因BMT后患者为预防复发治疗。其中6例自治疗后至今无病生存分别为2、6、8、13、17、23个月。另3例分别于治疗后1个月、1个月和3个月白血病复发(表3)。
, 百拇医药
3 讨论
异基因细胞治疗是通过移植物抗白血病的作用达到杀灭体内残留白血病的目的。供者白细胞输注首先被成功地应用于CML Allo-BMT后遗传学或血液学复发患者[6，7]，多数患者诱发出GVHD。本文A组10例患者输注供者白细胞后，7例诱发出急性GVHD。血液学复发组6例，4例诱发出急性GVHD。其中1例CML患者曾达到完全缓解，Ph1染色体100%转阴，至今无病存活超过18个月。另1例皮下浸润患者，诱发出Ⅳ度GVHD，皮下结节消退，2个月后死于间质性肺炎。其他4例均再次复发。遗传学及中枢神经系统白血病复发组4例，3例诱发出急性GVHD。所有患者均达缓解。其中1例存活19个月，死于急性胰腺炎，另3例分别存活至今超过30、72、76个月。1例脑膜白血病复发患者输注供者白细胞后，未诱发出GVHD，未再化疗，至今缓解并存活超过72个月。提示GVL作用并非依赖于GVHD。A组10例患者在白血病复发后，9例患者于免疫治疗前，先接受了常规化疗或鞘内注射。在血液学复发组中，经化疗达完全缓解(complete remission, CR)或部分缓解(partly remission, PR)者，免疫治疗后，生存期大于经化疗未缓解(no response, NR)者。在遗传学及中枢神经系统白血病复发组中，化疗后获CR、NR及未化疗者，经异基因细胞治疗后，3例患者至今无病生存至少30个月；1例无病生存19个月后，死于急性胰腺炎。从我们的观察来看，遗传学及中枢神经系统白血病复发患者应用异基因细胞治疗的疗效，无论先期化疗与否，结果如何，均能获得较好疗效。从以上两组患者治疗结果来看，在输注供者白细胞治疗中遗传学及中枢神经系统白血病复发组疗效比血液学复发组要好。
, 百拇医药
在我国，异基因BMT由于受到供者的限制，开展自体BMT或外周血干细胞移植(PBSCT)越来越重要。而自体BMT或自体PBSCT没有GVL作用，可能为其复发率高的一个原因。所以自体BMT及自体PBSCT后免疫治疗尤为重要。CIK细胞已被用于ABMT的骨髓净化[8]。我们将CIK细胞用于预防或治疗自体PBSCT及Allo-BMT后的白血病复发。本文观察的10例患者，应用CIK细胞后对血液生化影响较少，对肝、肾功能无明显影响，对造血系统无明显影响。在疗效观察中，我们治疗的10例患者中，1例Allo-BMT患者，治疗前白血病融合基因(AML1/ETO)阳性，治疗后转阴，同时，原HCV-RNA也由阳性转为阴性，以后未经治疗，持续转阴，至今存活超过27个月；其他9例(1例同基因BMT，8例APBSCT)均为预防复发治疗，治疗后6例无病存活至今，为2～23个月。3例再次复发，其中2例在应用CIK细胞治疗前，骨髓幼稚细胞已达5%(表3)，已相当于血液学复发，且其中1例BMT前为第2次完全缓解状态，故其疗效较差。我们认为CIK细胞治疗是安全的，对BMT后遗传学复发患者的微小病变有杀灭作用，但总体疗效待进一步观察。
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参考文献
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(1998-07-20收稿), http://www.100md.com
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(Institute of Hematology， People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Bone marrow transplant Immunotherapy Neoplasm recurrence, local/prev Leukemia/ther
ABSTRACT Objective: To study immunotherapy for leukemia relapse and prophylaxis after bone marrow transplantation(BMT). Methods: In group A, 10 cases of leukemia relapse after Allo-BMT were treated with concentrated mononuclear cells from the marrow donor. In group B, 10 cases of leukemia after APBSCT (autogenous peripheral blood stem cells transplantation) or BMT were treated with CIK (cytokine induced killer) cells. Results: Among 6 patients with hematological relapse in group A, one patient has being living well for 18 months with disappearance of the Ph1 chromosome. 4 patients showed temporary remission and then relapsed again. One patient showed no response. The other 4 patients (2 with CNS relapse and 2 patients with relapse of minimal residual disease) showed remission, and remained Ph1 chromosome negative. In group B, a patient treated with CIK cells with a special leukemia infused gene (AML/ETO) turned negative after one treatment of CIK cells. Conclusion: (1) Donor derived leukocyte infusion can induce CML post-BMT to cytogenetic and hematological CR. It has also therapeutic effects on acute leukemia relapse but is less sustained. (2) CIK cells can be safely infused into patients and is effective in the therapy of leukemia relapse at least in some patients.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:395-399)
骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)给白血病患者带来根治疾病、长期存活的机会,但无论是异基因还是自体骨髓移植，都存在一定的复发率。自体骨髓由于移植缺乏异基因骨髓移植(Allo-BMT)所具有的移植物抗白血病(GVL)作用，所以Auto-BMT后白血病复发更是影响患者长期存活的主要原因。复发提示BMT后患者体内仍存在着少量的肿瘤细胞。由于BMT前患者所处的疾病状态，对移植相关毒副作用的耐受力及对化疗药物的耐药情况不同，复发后患者很难再次缓解。近年来，BMT后免疫治疗给这部分患者带来希望，Allo-BMT后给白血病复发患者输注供者白细胞进行过继免疫治疗，国外已有诸多报道[1～4]，其中部分患者达到缓解并长期存活。在我们所的临床研究中，也得到同样疗效。免疫杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)是多种因子激活的杀伤细胞，在体外具有明显的增殖及高杀伤活性。美国斯坦福大学介绍了CIK细胞的培养程序,在动物体内应用发现这种细胞的体内抗肿瘤效果远高于LAK细胞[5]。我们在现有实验室条件下培养出一定量的CIK细胞，主要用于临床自体BMT后复发的预防或治疗。本文观察了BMT后患者输注供者白细胞或各种细胞因子和抗CD3单抗共同激活的CIK细胞的反应。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病例选择
本文观察两组患者为1991～1997年间在我院接受骨髓移植后复发就诊于本所的患者。A组：Allo-BMT后白血病复发患者10例，接受供者白细胞治疗;平均年龄31.4岁(18～45)；男6例，女4例；诊断为CML-CP 5例、AML-CR1 3例、AML-CR2 1例、ALL-CR1 1例。供者均为患者同胞，HLA配型和MLC(混合淋巴培养)均与患者相合。10例患者于Allo-BMT后+60至+1 277天白血病复发，复发状态为2例遗传学复发，2例脑膜白血病复发，5例血液学复发，1例表现为髓外复发，全身广泛皮下结节。其中2例脑膜白血病复发患者予鞘内注射(阿糖胞苷30 mg/次或甲氨喋呤10 mg/次)后完全缓解。7例患者予以联合化疗，1例未化疗。化疗结果：3例达完全缓解，1例部分缓解，3例患者未缓解。详见表1、2。B组：观察1995～1997年造血干细胞移植后接受CIK细胞治疗的患者10例，平均年龄为33岁(14～44)；男6例，女4例；诊断为AML-CR1 3例、AML-CR2 2例、ALL-CR1 5例；分别为接受自体PBSCT 8例、同基因BMT 1例和异基因BMT者1例。
, 百拇医药
表1 A组血液学复发患者输注供者白细胞前后情况及结果
Table 1 Donor derived leukocyte (DDL) for gross hematological relapse in group A UPN
Relapse
Chemotherapy
Infusion of DDL
Outcome
t(post
-BMT)
/d
Status
, 百拇医药
Yes
(No)
Result
t(post-
relapse)
/d
No. of
treatments
t(interval)
/d
MNC
(×108/kg)
, 百拇医药
GVHD
t(alive and
well)
/months
t(relapse
from
therapy)/
months
t(post-
relapse)
/d
Grade
, 百拇医药
47
80
AML
Yes
CR
12
4
13-28
14.76
-
10
89
62
, http://www.100md.com APL
Yes
PR
56
3
10-15
2.72
49
Ⅳ
Disappearance of subcutaneous node; died of IP.
(subcutaneous node)
85
, http://www.100md.com
1030
APL
Yes
CR
20
2
15
4.0
90
Ⅱ，S
7
228
89
CML/Ph1+
, 百拇医药
Yes
NR
38
2
14
3.52
3
Ⅱ
3
247
165
CML/Ph1+
Yes
, http://www.100md.com
NR
3
2
27
2.43
-
NR
104
1277
CML/Ph1+
Yes
CR
10
, 百拇医药
6
7-15
5.23
30
Ⅱ
>18
UPN, unique patient number; MNC， mononuclear cells； GVHD， graft versus host disease； IP， interstitial pneumonia； S, system; CR, complete remission; PR, partly remission; NR, no response; APL, acute promyelocytic leukemia.表2 A组遗传学及中枢神经系统白血病复发患者输注供者白细胞治疗情况
, 百拇医药
Table 2 Donor derived leukocyte (DDL) for cytogenetic or CNS relapse in group A
UPN
Relapse
Chemotherapy
Infusion of DDL
Outcome
t(post
-BMT)
/d
Status
, 百拇医药 Yes
(No)
Result
t(post-
relapse)
/d
No. of
treatments
t(interval)
/d
MNC
(×108/kg)
, 百拇医药
GVHD
t(alive and
well)
/months
t(post-
relapse)
/d
Grade
54
61
CNS(APL)
Yes
CR
, 百拇医药
41
1
2.29
15
Ⅰ,S
>76
50
268
CNS(ALL)
Yes
CR
23
2
, http://www.100md.com 60
0.68
-
>72
137
214
Ph1+5%(CML)
Yes
NR
56
2
7
3.92
, 百拇医药
22
Ⅰ,S
>19**
179
97
Ph1+5%(CML)
No
133
2
7
173
88
Ⅰ
, 百拇医药
>30
UPN, unique patient number; CNS， central nervous system； **， died later of acute pancreatitis; S,system.1.2 BMT预处理方案
两种方案分别为：(1)全身照射+环磷酰胺(TBI)方案：环磷酰胺1.8 g.m-2×2 d静脉滴注，甲环亚硝脲250 mg.m-2×1 d口服，单次全身照射770～800 cGy。剂量率为2.5～5.0 cGy.min-1。(2)改良马利兰+环磷酰胺方案(BUCY)：羟基脲每千克体重40 mg，口服×2次，阿糖胞苷1～2 g.m-2×2 d，马利兰每千克体重4 mg×3 d，环磷酰胺1.8 g.m-2静脉滴注×2 d，甲环亚硝脲：250 mg.m-2×1 d口服。A组除1例CML患者应用BUCY方案外，其余均应用环磷酰胺/全身照射(CY/TBI)方案。B组除1例Allo-BMT患者应用CY/TBI方案外，其它9例患者均应用BUCY方案。
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1.3 移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)预防方案
所有Allo-BMT患者采用环孢菌素A(CsA)加短程的甲氨喋呤(MTX)方案预防GVHD。于Allo-BMT 后第1天予MTX15 mg.m-2静脉滴注，术后第3、6、11天予MTX 10 mg.m-2静脉滴注。CsA自Allo-BMT前1天开始，每天每千克体重2.5 mg, 分2次静脉滴注。待预处理胃肠反应消失后改为口服，起始剂量每千克体重每天6 mg，3个月后逐渐减量。总用药时间半年左右。其中4例患者加用过小剂量皮质激素治疗。
1.4 输注供者白细胞的免疫治疗
(1)治疗方法：A组均为Allo-BMT后白血病复发者，对于临床复发者先化疗，之后输注取自同一供者、用Cs3000血细胞分离机分离的白细胞，化疗及输注白细胞情况详见表1、2。(2)治疗后监测：A组患者输注供者白细胞后观察出现的GVHD症状和体征，记录出现GVHD的详细过程及治疗。并于输白细胞后定期复查血常规、血白细胞分类、骨髓形态学及遗传学检测。(3)诱发GVHD的处理：急性GVHD，Ⅰ度不加处理，Ⅱ度以上加用甲基强的松龙20～40 mg.d-1。必要时与CsA合用。
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1.5 CIK细胞的制备方法
(1)配制RPMI1640培养液。(2)严格无菌操作下配制10 g.L-1的白蛋白生理盐水。(3)培养操作程序：用Cs3000血细胞分离机分离患者外周血单个核细胞。得到的外周血单个核细胞用RPMI1640培养液洗涤两遍，离心速度1 700 r.min-1，共30 min。配制完全培养液(含AB血清50～80 g.L-1)。将细胞置于培养袋中，加入完全培养液使细胞浓度为2×106 ml-1。培养第1天加入γ-IFN，使浓度为1 000 U.ml-1。培养第2天加入抗CD3单抗每毫升50 mg，IL-2 1 000 U.ml-1，IL-1 500 U.ml-1。以后每3天更换新的培养液及添加IL-2，在37 ℃饱和湿度的CO2孵箱内培养10～14 d。培养结束前进行细菌培养检测及细胞杀伤活性检测。将培养袋内的细胞悬液分装入血液分浆袋。离心速度1 700 r.min-1，30 min，用分浆夹挤出上清，加入含10 g.L-1人血白蛋白的生理盐水洗两遍。将最后得到的细胞悬液加入10 g.L-1白蛋白生理盐水并加入IL-2 2×104 U。
, 百拇医药
1.6 输注CIK细胞的治疗
(1)方法：将培养10 d后的CIK细胞输给患者，并给予IL-2。每次输注CIK细胞时间、次数及细胞总数详见表3。(2)治疗后监测：观察输注CIK细胞前后2周内血常规、血生化的变化。血常规每周2次，血生化每周1次。记录每次输注CIK细胞后有无寒战、发热、过敏及心肺功能变化。每两周进行骨髓形态学及遗传学检测。(3)统计学处理采用配对t检验。
表3 B组10例患者接受CIK细胞治疗情况及结果
Table 3 Patients receiving CIK cells for prophylaxis/treatment of relapse in group B UPN
Diagnosis
Relapse
, 百拇医药
Other
therapy
Infusion of CIK cells
Outcome
t(post
BMT/
PBSCT)
/months
Status
t(post
BMT/PBSCT)
/months
, 百拇医药
MNC
(×109 cells)
No. of
treatment
t(alive and well)
/months
t(relapse)/
months
2
AML
13
AML1/ETO(+)
, 百拇医药
No
15
14.3
1
>27 AML1/ETO(-)
.HCV.NA(+)
HCV.RNA(-)
4
AML
No
IFN
2
, 百拇医药
9.7
1
>23
6
AML
No
No
3*
8.7
1
3
7
ALL
, http://www.100md.com
No
No
3*
9.4
1
1
8
AML
No
No
2
43.78
3
, http://www.100md.com
>17
9
ALL
No
No
2
32.9
2
>13
11
ALL
No
No
4
, 百拇医药
12
1
>2
12
ALL
No
No
5
27.5
1
>8
13
ALL
No
, 百拇医药
No
8
16.72
1
>6
14
AML
No
No
3
8.7
1
1
UPN, unique patient number; *， 5% blast cells in bone marrow.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 输注供者白细胞治疗组
患者于白血病复发后3～133 d开始输注供者白细胞 ，输注次数、间隔及有核细胞数见表1及表2。根据复发状态分为遗传学和中枢神经系统白血病复发组及血液学复发组，在遗传学和中枢神经系统白血病复发组中(2例遗传学复发及2例脑膜白血病复发)，输注供者白细胞后3例出现Ⅰ度GVHD，其中2例合并慢性GVHD，白血病均得到控制。其中1例CML患者，复发时Ph1阳性染色体占5%，干扰素治疗后升至44%，免疫治疗后Ph1染色体全部阴转。另1例患者复发时Ph1阳性染色体占5%，未经化疗，输注供者白细胞后，未查染色体，存活至今超过30个月，见表2。血液学复发组6例患者中，4例患者出现急性GVHD(Ⅱ～Ⅳ度)。1例合并慢性GVHD。6例患者中3例分别于治疗后3、7、10个月复发。1例皮下结节患者皮下结节消退，但因合并间质性肺炎，于治疗后2个月死亡。1例患者治疗后无反应，死于亚急性重型肝炎。仅1例患者Ph1阳性染色体由70%降为0，并持续Ph1阴性，至今已存活18个月，见表1。
, 百拇医药
2.2 CIK细胞治疗
2.2.1 对生理功能的影响
B组10例患者应用CIK细胞/IL-2治疗，其中1例患者应用3个疗程，1例患者应用2个疗程，其他患者均应用1个疗程。全部患者在输注CIK细胞过程中没有明显的不适，无1例出现发热、寒战，对心血管系统影响不大。仅1例患者输注时出现室性早搏，减慢输注速度后，心律恢复正常。无1例出现气促、气喘。
对血液生化的影响：由于许多血液病患者都合并有肝炎，故可能在输CIK细胞前肝功能已异常。但本观察发现，10例患者治疗前、后肝、肾功能各项指标经配对t检验，统计学差异无显著性(P>0.05)。CIK细胞的输注对患者肝、肾功能无明显影响(见表4)。
表4 B组患者输注CIK细胞前后血生化参数(
±s), 百拇医药
Table 4 Index of blood biochemistry pre-
and post-infusing CIK cells in group B (
±s)Pre-
Post-
±Sdc(ALT)/nmol.s-1.L-1
797±705
707±600
, 百拇医药
-90±390
c(AST)/nmol.s-1.L-1
680±421
502±322
-247±190
c(T-BIL)/μmol.L-1
14.5±6.7
15.2±4.7
0.7±4.3
c(BUN)/mmol.L-1
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3.7±1.6
3.8±1.1
-0.4±1.1
c(UA)/μmol.L-1
203±76
198±95
4±98
UPN, unique patient number; ALT， alanine aminotransferase； AST， aspartate aminotransferase； T-BIL， total bilirubin； BUN， blood urea nitrogen； UA， urea acid； P>0.05 , compared with pre-infusing.
, 百拇医药
对血液系统的影响：10例患者输注CIK细胞后白细胞计数升高，但升高程度不大，尚在正常范围内，对红细胞、血小板系统影响不大。治疗前、后外周血白细胞、血红蛋白、血小板各项指标经配对t检验，差异无显著性(P>0.05，表5)。
表5 B组患者输注CIK细胞前后血常规参数(
±s)Table 5 Index of blood routine pre- and post-infusing CIK
cells in group B (
±s)Pre-
Post-
±Sd, 百拇医药
N(WBC)/×109 L-1
4.4±1.3
5.3±1.8
0.9±1.3
N(RBC)/×1012 L-1
3.5±1.0
3.5±0.9
0.1±0.3
ρ(Hb)/g.L-1
120±29
, 百拇医药
122±29
2±9
N(PLT)/×109 L-1
113±73
120±78
8±13
WBC， white blood cells； RBC， red blood cells； Hb， hemoglobin； PLT， platelet； *P>0.05, compared with pre-infusing.
2.2.2 CIK细胞/IL-2的疗效 患者输注CIK细胞的时间、有核细胞数及次数详见表3。1例Allo-BMT后白血病复发患者于复发后2个月输注CIK细胞治疗。治疗后白血病融合基因(AML1/ETO)转阴，同时HCV-RNA也由阳性转为阴性，至今无病存活>27个月，且复查AML1/ETO持续阴性。其他8例自体PBSCT后及1例同基因BMT后患者为预防复发治疗。其中6例自治疗后至今无病生存分别为2、6、8、13、17、23个月。另3例分别于治疗后1个月、1个月和3个月白血病复发(表3)。
, 百拇医药
3 讨论
异基因细胞治疗是通过移植物抗白血病的作用达到杀灭体内残留白血病的目的。供者白细胞输注首先被成功地应用于CML Allo-BMT后遗传学或血液学复发患者[6，7]，多数患者诱发出GVHD。本文A组10例患者输注供者白细胞后，7例诱发出急性GVHD。血液学复发组6例，4例诱发出急性GVHD。其中1例CML患者曾达到完全缓解，Ph1染色体100%转阴，至今无病存活超过18个月。另1例皮下浸润患者，诱发出Ⅳ度GVHD，皮下结节消退，2个月后死于间质性肺炎。其他4例均再次复发。遗传学及中枢神经系统白血病复发组4例，3例诱发出急性GVHD。所有患者均达缓解。其中1例存活19个月，死于急性胰腺炎，另3例分别存活至今超过30、72、76个月。1例脑膜白血病复发患者输注供者白细胞后，未诱发出GVHD，未再化疗，至今缓解并存活超过72个月。提示GVL作用并非依赖于GVHD。A组10例患者在白血病复发后，9例患者于免疫治疗前，先接受了常规化疗或鞘内注射。在血液学复发组中，经化疗达完全缓解(complete remission, CR)或部分缓解(partly remission, PR)者，免疫治疗后，生存期大于经化疗未缓解(no response, NR)者。在遗传学及中枢神经系统白血病复发组中，化疗后获CR、NR及未化疗者，经异基因细胞治疗后，3例患者至今无病生存至少30个月；1例无病生存19个月后，死于急性胰腺炎。从我们的观察来看，遗传学及中枢神经系统白血病复发患者应用异基因细胞治疗的疗效，无论先期化疗与否，结果如何，均能获得较好疗效。从以上两组患者治疗结果来看，在输注供者白细胞治疗中遗传学及中枢神经系统白血病复发组疗效比血液学复发组要好。
, 百拇医药
在我国，异基因BMT由于受到供者的限制，开展自体BMT或外周血干细胞移植(PBSCT)越来越重要。而自体BMT或自体PBSCT没有GVL作用，可能为其复发率高的一个原因。所以自体BMT及自体PBSCT后免疫治疗尤为重要。CIK细胞已被用于ABMT的骨髓净化[8]。我们将CIK细胞用于预防或治疗自体PBSCT及Allo-BMT后的白血病复发。本文观察的10例患者，应用CIK细胞后对血液生化影响较少，对肝、肾功能无明显影响，对造血系统无明显影响。在疗效观察中，我们治疗的10例患者中，1例Allo-BMT患者，治疗前白血病融合基因(AML1/ETO)阳性，治疗后转阴，同时，原HCV-RNA也由阳性转为阴性，以后未经治疗，持续转阴，至今存活超过27个月；其他9例(1例同基因BMT，8例APBSCT)均为预防复发治疗，治疗后6例无病存活至今，为2～23个月。3例再次复发，其中2例在应用CIK细胞治疗前，骨髓幼稚细胞已达5%(表3)，已相当于血液学复发，且其中1例BMT前为第2次完全缓解状态，故其疗效较差。我们认为CIK细胞治疗是安全的，对BMT后遗传学复发患者的微小病变有杀灭作用，但总体疗效待进一步观察。
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, http://www.100md.com
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(1998-07-20收稿), http://www.100md.com