CK19 RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中肿瘤细胞
作者：赖娟 李蔚范 钱和年 冯捷 李海玲
单位：北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京 100044
关键词：
北京医科大学学报990523 近年来，大剂量化疗辅以外周血干细胞移植来缓解化疗后骨髓抑制已经成为上皮性卵巢癌病人很有前途的一种治疗方法。虽然这一方法使许多病人获得了较长的无瘤生存期，但仍有部分病人最终复发，其中可能的原因之一即为回输的干细胞中含有肿瘤细胞。另外，外周血中含有肿瘤细胞的病人远处转移可能性大，预后可能不好。所以，建立一种高度灵敏的检测方法来检测病人外周血干细胞及外周血中肿瘤细胞具有重要的临床意义。我中心尝试了将细胞角蛋白19(CK19)反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法应用于上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中肿瘤细胞的检测，报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
选用CK19免疫细胞化学染色阳性的SKOV3卵巢癌细胞株检测CK19 RT-PCR方法的灵敏度。设计一组梯度模型：将SKOV3细胞倍比稀释加入到CK19阴性的107个正常人血单个核细胞中形成1∶10～1∶106梯度。取阴性对照29例检测此方法的特异性。包括外周血干细胞3例4份标本：多发性骨髓瘤1例，非霍奇金病1例，急性粒细胞性白血病1例；外周血26例26份标本：健康女性志愿者7例，卵巢良性上皮肿瘤11例，卵巢非上皮来源肿瘤4例，子宫良性病变4例。
根据CK19核酸序列[1]设计CK19套式引物，用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照。
每份样品用淋巴细胞分层液(密度1.077 2 kg.L-1)梯度离心提取单个核细胞，Tris-NH4Cl溶红缓冲液溶解其中的红细胞，台盼蓝活细胞染色液计数后Trizol试剂(美国，Gibco)提取细胞总RNA，紫外分光光度计进行RNA定量。取1 μg RNA完成cDNA第一链的合成。1 μl反转录产物加入少量GAPDH及CK19外引物进行第一步PCR反应，体系25 μl，95℃变性1 min，70℃退火、延伸2 min，35个循环。第一步PCR产物稀释50倍，加少量CK19内引物，体系25 μl，95℃变性1 min，64℃退火、延伸1 min，35个循环。5 μl PCR产物60 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色。306 bp为GAPDH mRNA特异扩增片段，438 bp为CK19 mRNA特异扩增片段。
, 百拇医药
2 结果
卵巢癌细胞株SKOV3倍比稀释法制成的1∶10～1∶106梯度模型经过套式PCR后在4次1∶106模型中均可见到CK19mRNA特异带438 bp，灵敏度至少为1∶106，相当于1 ml全血中含有一个肿瘤细胞。
对照组中3例非上皮性恶性肿瘤患者的4份外周血干细胞CK19RT-PCR检测均阴性。26例良性肿瘤病人及健康志愿者的静脉血中24(92.3%)例CK19RT-PCR阴性，2(7.7%)例阳性，2例阳性为健康女性志愿者。
3 讨论
目前国内、外报道的肿瘤细胞检测方法有：HE染色、免疫细胞化学、细胞培养、流式细胞计、PCR等。一般认为PCR是灵敏度最高的一种方法。RT-PCR法已被运用于实体瘤肿瘤细胞的检测，这种方法要求肿瘤细胞必须特异地表达某种可以提示肿瘤来源的基因，而这种基因在肿瘤转移处的正常组织中却不表达，灵敏度可达1∶105～1∶107。目前报道的RT-PCR已有用前列腺特异抗原(PSA)检测前列腺癌细胞[2]；用EWS/FLI1或ERG检测Ewing's肉瘤细胞[3]；用神经内分泌蛋白基因产物9.5(PG 9.5)或酪氨酸羟化酶检测神经母细胞瘤细胞[4，5]；用CK19检测乳腺癌等上皮来源肿瘤细胞[6，7]等。有关外周血干细胞和外周血中肿瘤细胞检测在卵巢癌中研究很少，仅见Ross[8]所研究的免疫细胞化学法，RT-PCR法未见有报道。CK19是酸性角蛋白中的一种，根据Traweek等[9]的研究，CK19不在正常淋巴结、外周血和骨髓中表达，因此CK19RT-PCR方法可用于上皮来源肿瘤在这些部位的微小转移病灶的检测。另外，Van Niekerk等[10]认为CK19在上皮性卵巢癌中阳性表达率为98.4%。所以，CK19 RT-PCR法可能用来检测上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中的肿瘤细胞。
, http://www.100md.com
本实验用CK19套式RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌细胞，灵敏度至少为1∶106，明显高于目前报道的免疫细胞化学法1∶5×105[8]。实验中CK19RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌细胞特异性为92.3%(24/26)。有关CK19RT-PCR方法检测上皮来源肿瘤细胞的假阳性问题文献报道不一，Datta[6]和Moscinski[7]两个小组分别用CK19套式RT-PCR检测乳腺癌病人的肿瘤细胞，假阳性3.4%～3.8%；而Krismann[12]，Burchill[13]，Mapara[11]等小组实验得到CK19RT-PCR方法假阳性为38%～50%。产生假阳性的原因各学者认为可能有：提取RNA过程中污染有DNA或化疗所致细胞DNA碎片的扩增；CK19假基因的干扰；非上皮细胞低水平CK19mRNA；抽血过程中不小心带入少量表皮下上皮细胞等。
CK19RT-PCR方法的建立，可在临床实践中检测上皮性卵巢癌患者的外周血干细胞或外周血中的肿瘤细胞，以便净化回输的外周血干细胞，并可指导治疗，帮助判断预后。此方法还可用来检测上皮性卵巢癌患者淋巴结中的微小转移灶，提高手术分期的准确性，并且可推广应用于乳腺癌、胃癌、结直肠癌等上皮来源恶性肿瘤细胞的检测，为癌症患者的治疗、判断预后提供依据。
, 百拇医药
参考文献
1 Bader BL, Jahn L, Franke WW, et al. Low level expression of cytokeratins 8, 18 and 19 in vascular smooth muscle cells of human umbilical cord and in cultured cells derived therefrom, with an analysis of the chromosomal locus containing the cytokeratin 19 gene. Eur J Cell Biol, 1988,47:300-319
2 Wood DP, Banks ER, Humphreys S, et al. Identification of bone marrow micrometastases in patients with prostate cancer. Cancer, 1994,74(9):2533-2540
, 百拇医药
3 Peter M, Magdelenat H, Michon J, et al. Sensitive detection of occult Ewing's cells by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995,72:96-100
4 Miyajima Y, Horibe K, Fukude M, et al. Sequential detection of tumor cells in the peripheral blood and bone marrow of patients with stage IV neuroblastoma by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mRNA. Cancer, 1996,77(6):1214-1219
, http://www.100md.com
5 Mattano LA, Moss TJ, Emerson SG, et al. Sensitive detection of rare circulating neuroblastoma cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer Res, 1992,52(9):4701-4705
6 Datta YH, Adams PT, Drobyski PT, et al. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse-transcriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol, 1994,12(3):475-482
7 Moscinski LC, Thudeau WL, Fields KK, et al. High-sensitivity detection of minimal residual breast carcinoma using the polymerase chain reaction and primers for cytokeratin 19. Diagno Mol Pathol, 1996,5(3):173-180
, http://www.100md.com
8 Ross AA, Miller GW, Moss TJ, et al. Immunocytochemical detection of tumor cells in bone marrow and peripheral blood stem cell collections from patients with ovarian cancer.Bone Marrow Transplant, 1995,15:929-933
9 Traweek ST, Liu J, Battifora H, et al. Keratin gene expression in non-epithelial tissues, detection with polymerase chain reaction. Am J Pathol,1993,142(4):1111-1118
10 Van Niekerk CC, Ramaekers FCS, Hanselaar AGJM, et al. Changes in expression of differentiation markers between normal ovarian cells and derived tumors. Am J Pathol,1993, 142(1):157-177
, http://www.100md.com
11 Mapara MY, Krner IJ, Hildebrandt M, et al. Monitoring of tumor cell purging after highly efficient immunomagnetic selection of CD34 cells from leukapheresis products in breast cancer patients: comparison of immunocytochemical tumor cell staining and reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Blood,1997,89(1):337-344
12 Krismann M, Todt B, Schrder J, et al. Low specificity of cytokeratin 19 reverse transcriptase-polymerase chain reaction analyses for detection of hematogenous lung cancer dissemination. J Clin Oncol,1995,13(11):2769-2775
13 Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, et al. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995,71:278-281
(1998-08-26收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京 100044
关键词：
北京医科大学学报990523 近年来，大剂量化疗辅以外周血干细胞移植来缓解化疗后骨髓抑制已经成为上皮性卵巢癌病人很有前途的一种治疗方法。虽然这一方法使许多病人获得了较长的无瘤生存期，但仍有部分病人最终复发，其中可能的原因之一即为回输的干细胞中含有肿瘤细胞。另外，外周血中含有肿瘤细胞的病人远处转移可能性大，预后可能不好。所以，建立一种高度灵敏的检测方法来检测病人外周血干细胞及外周血中肿瘤细胞具有重要的临床意义。我中心尝试了将细胞角蛋白19(CK19)反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法应用于上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中肿瘤细胞的检测，报告如下。
1 材料与方法
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选用CK19免疫细胞化学染色阳性的SKOV3卵巢癌细胞株检测CK19 RT-PCR方法的灵敏度。设计一组梯度模型：将SKOV3细胞倍比稀释加入到CK19阴性的107个正常人血单个核细胞中形成1∶10～1∶106梯度。取阴性对照29例检测此方法的特异性。包括外周血干细胞3例4份标本：多发性骨髓瘤1例，非霍奇金病1例，急性粒细胞性白血病1例；外周血26例26份标本：健康女性志愿者7例，卵巢良性上皮肿瘤11例，卵巢非上皮来源肿瘤4例，子宫良性病变4例。
根据CK19核酸序列[1]设计CK19套式引物，用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照。
每份样品用淋巴细胞分层液(密度1.077 2 kg.L-1)梯度离心提取单个核细胞，Tris-NH4Cl溶红缓冲液溶解其中的红细胞，台盼蓝活细胞染色液计数后Trizol试剂(美国，Gibco)提取细胞总RNA，紫外分光光度计进行RNA定量。取1 μg RNA完成cDNA第一链的合成。1 μl反转录产物加入少量GAPDH及CK19外引物进行第一步PCR反应，体系25 μl，95℃变性1 min，70℃退火、延伸2 min，35个循环。第一步PCR产物稀释50倍，加少量CK19内引物，体系25 μl，95℃变性1 min，64℃退火、延伸1 min，35个循环。5 μl PCR产物60 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色。306 bp为GAPDH mRNA特异扩增片段，438 bp为CK19 mRNA特异扩增片段。
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2 结果
卵巢癌细胞株SKOV3倍比稀释法制成的1∶10～1∶106梯度模型经过套式PCR后在4次1∶106模型中均可见到CK19mRNA特异带438 bp，灵敏度至少为1∶106，相当于1 ml全血中含有一个肿瘤细胞。
对照组中3例非上皮性恶性肿瘤患者的4份外周血干细胞CK19RT-PCR检测均阴性。26例良性肿瘤病人及健康志愿者的静脉血中24(92.3%)例CK19RT-PCR阴性，2(7.7%)例阳性，2例阳性为健康女性志愿者。
3 讨论
目前国内、外报道的肿瘤细胞检测方法有：HE染色、免疫细胞化学、细胞培养、流式细胞计、PCR等。一般认为PCR是灵敏度最高的一种方法。RT-PCR法已被运用于实体瘤肿瘤细胞的检测，这种方法要求肿瘤细胞必须特异地表达某种可以提示肿瘤来源的基因，而这种基因在肿瘤转移处的正常组织中却不表达，灵敏度可达1∶105～1∶107。目前报道的RT-PCR已有用前列腺特异抗原(PSA)检测前列腺癌细胞[2]；用EWS/FLI1或ERG检测Ewing's肉瘤细胞[3]；用神经内分泌蛋白基因产物9.5(PG 9.5)或酪氨酸羟化酶检测神经母细胞瘤细胞[4，5]；用CK19检测乳腺癌等上皮来源肿瘤细胞[6，7]等。有关外周血干细胞和外周血中肿瘤细胞检测在卵巢癌中研究很少，仅见Ross[8]所研究的免疫细胞化学法，RT-PCR法未见有报道。CK19是酸性角蛋白中的一种，根据Traweek等[9]的研究，CK19不在正常淋巴结、外周血和骨髓中表达，因此CK19RT-PCR方法可用于上皮来源肿瘤在这些部位的微小转移病灶的检测。另外，Van Niekerk等[10]认为CK19在上皮性卵巢癌中阳性表达率为98.4%。所以，CK19 RT-PCR法可能用来检测上皮性卵巢癌病人外周血干细胞或外周血中的肿瘤细胞。
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本实验用CK19套式RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌细胞，灵敏度至少为1∶106，明显高于目前报道的免疫细胞化学法1∶5×105[8]。实验中CK19RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌细胞特异性为92.3%(24/26)。有关CK19RT-PCR方法检测上皮来源肿瘤细胞的假阳性问题文献报道不一，Datta[6]和Moscinski[7]两个小组分别用CK19套式RT-PCR检测乳腺癌病人的肿瘤细胞，假阳性3.4%～3.8%；而Krismann[12]，Burchill[13]，Mapara[11]等小组实验得到CK19RT-PCR方法假阳性为38%～50%。产生假阳性的原因各学者认为可能有：提取RNA过程中污染有DNA或化疗所致细胞DNA碎片的扩增；CK19假基因的干扰；非上皮细胞低水平CK19mRNA；抽血过程中不小心带入少量表皮下上皮细胞等。
CK19RT-PCR方法的建立，可在临床实践中检测上皮性卵巢癌患者的外周血干细胞或外周血中的肿瘤细胞，以便净化回输的外周血干细胞，并可指导治疗，帮助判断预后。此方法还可用来检测上皮性卵巢癌患者淋巴结中的微小转移灶，提高手术分期的准确性，并且可推广应用于乳腺癌、胃癌、结直肠癌等上皮来源恶性肿瘤细胞的检测，为癌症患者的治疗、判断预后提供依据。
, 百拇医药
参考文献
1 Bader BL, Jahn L, Franke WW, et al. Low level expression of cytokeratins 8, 18 and 19 in vascular smooth muscle cells of human umbilical cord and in cultured cells derived therefrom, with an analysis of the chromosomal locus containing the cytokeratin 19 gene. Eur J Cell Biol, 1988,47:300-319
2 Wood DP, Banks ER, Humphreys S, et al. Identification of bone marrow micrometastases in patients with prostate cancer. Cancer, 1994,74(9):2533-2540
, 百拇医药
3 Peter M, Magdelenat H, Michon J, et al. Sensitive detection of occult Ewing's cells by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995,72:96-100
4 Miyajima Y, Horibe K, Fukude M, et al. Sequential detection of tumor cells in the peripheral blood and bone marrow of patients with stage IV neuroblastoma by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mRNA. Cancer, 1996,77(6):1214-1219
, http://www.100md.com
5 Mattano LA, Moss TJ, Emerson SG, et al. Sensitive detection of rare circulating neuroblastoma cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer Res, 1992,52(9):4701-4705
6 Datta YH, Adams PT, Drobyski PT, et al. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse-transcriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol, 1994,12(3):475-482
7 Moscinski LC, Thudeau WL, Fields KK, et al. High-sensitivity detection of minimal residual breast carcinoma using the polymerase chain reaction and primers for cytokeratin 19. Diagno Mol Pathol, 1996,5(3):173-180
, http://www.100md.com
8 Ross AA, Miller GW, Moss TJ, et al. Immunocytochemical detection of tumor cells in bone marrow and peripheral blood stem cell collections from patients with ovarian cancer.Bone Marrow Transplant, 1995,15:929-933
9 Traweek ST, Liu J, Battifora H, et al. Keratin gene expression in non-epithelial tissues, detection with polymerase chain reaction. Am J Pathol,1993,142(4):1111-1118
10 Van Niekerk CC, Ramaekers FCS, Hanselaar AGJM, et al. Changes in expression of differentiation markers between normal ovarian cells and derived tumors. Am J Pathol,1993, 142(1):157-177
, http://www.100md.com
11 Mapara MY, Krner IJ, Hildebrandt M, et al. Monitoring of tumor cell purging after highly efficient immunomagnetic selection of CD34 cells from leukapheresis products in breast cancer patients: comparison of immunocytochemical tumor cell staining and reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Blood,1997,89(1):337-344
12 Krismann M, Todt B, Schrder J, et al. Low specificity of cytokeratin 19 reverse transcriptase-polymerase chain reaction analyses for detection of hematogenous lung cancer dissemination. J Clin Oncol,1995,13(11):2769-2775
13 Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, et al. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995,71:278-281
(1998-08-26收稿), http://www.100md.com