γ射线照射后造血细胞端粒酶活性变化
作者：李夏新 洪平 程少杰 F.Leteurtre
单位：李夏新 程少杰 (广州，第一军医大学附属南方医院 510515)；洪平 (广州军区第一五七医院儿科)；F.Leteurtre (法国巴黎圣-路易医院血研所)
关键词：γ射线；造血细胞；端粒酶；细胞周期
中华放射医学与防护杂志980604 目的 以KGla和CEM两个白血病细胞株为模型，探讨γ射线照射后造血细胞中端粒酶的变化。方法细胞经照射后用3H-胸腺嘧啶渗入法测定细胞增殖能力，Kim氏TRAP方法分析端粒酶活性，并采用2次胸腺嘧啶使细胞同步化，BrdU渗入法分析细胞同步化结果及照射后细胞周期分布。结果 γ射线照射后造血细胞能增加端粒酶活性，在0～3Gy照射后酶活性逐渐上升，3Gy达高峰，在时间动态变化上，照射后8～24小时酶活性最高，此后开始下降，此时在细胞周期分布上有G2/M期细胞堆积，然而使细胞同步化后端粒酶活性在细胞各期无明显变化。结论 造血细胞的端粒酶活性在照射后的上调反应，可能与DNA的修复、稳定断裂染色体有关。
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Change of telomerase activity in gamma-irradiated hematopoietic cells.
Li Xiaxin, Hong Ping, Cheng Shaojie, et al. Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515, China.
Objective Using two hematopoietic cell lines, KGla and CEM, to investigate the variation of telomerase activity after γ-irradiation.Methods After irradiation, cell proliferation was measured by thymidine incorporation and telomerase activity of cells was analysed by Kim's TRAP assay. Cell synchronization was achieved after two-step thymidine blocks, and cell cycle was examined by BrdU incorporation technique for verifying cell cycle distribution after irradiation and cell synchronization.Results Telomerase activity increased after irradiation of between 0 and 3Gy in a dose-dependent manner, reaching the maximum at 3 Gy. The increase of telomerase activity was nearly to its maximum 8h after irradiation, the peak being observed at around 24h. Although this kinetics partly correlated with cell redistribution into the G2/M phase of the cell cycle, telomerase activity did not show significant variation over the cell cycle.Conclusion The up-regulation of telomerase in hematopoietic cell lines after γ-irradiation may suggest the involvement of telomerase in DNA repair and chromosome healing.
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Key words Gamma-rays Hematopoietic cells Telomerase Cell cycle
染色体端粒(Telomere)具有防止基因组DNA降解、避免其末端相互连接等功能，端粒的长度决定着细胞的有丝分裂能力。随着细胞的分裂、分化，端粒的长度逐渐变短，细胞的有丝分裂能力也随之减低，最后细胞衰老凋亡；肿瘤细胞端粒很短，有无限的有丝分裂能力有赖于端粒酶(Telomerase)的活化，该酶不断的合成端粒[1]。
造血细胞是辐射损伤的靶细胞之一，辐射损伤造成DNA双链断裂，导致细胞死亡。研究辐射损伤后DNA的自我修复机理，是辐射保护研究中极为重要的课题。本研究以KGla和CEM两个白血病细胞株为模型，γ射线照射后观察其端粒酶和细胞周期分布的变化，探讨端粒酶在DNA修复中的意义。
1 材料和方法
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1.1 细胞培养：KGla(髓系白血病细胞株)和CEM(T淋巴性白血病细胞株)分别用含10%～20%小牛血清的改良ISCOVE培养基和1640培养基、37℃、饱和湿度5%CO2培养，维持细胞于指数增长浓度。
1.2 辐射处理：γ射线照射时细胞浓度为1×106/ml，放射源为137Cs(IBL 437铯源，氟化锂结晶测定放射同源均一性达95%以上)，吸收剂量率为0.80Gy/min，细胞受照射剂量为0～4Gy。
1.3 3H-胸腺嘧啶测定细胞增殖能力：照射后细胞在96孔板以浓度为0.25×105/ml(0～1Gy)，0.5×105(2Gy),1×105(3Gy)和2×105(4Gy)培养5天，尔后每孔加入3.7×106Bq甲基3H胸腺嘧啶(活性25Ci/mmol,Amersham, Les Ulis, France)孵育4小时， 常规方法收集细胞、测定3H-胸腺嘧啶掺入率，计算细胞增殖能力。
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1.4 端粒酶活性测定：按Kim氏TRAP方法测定细胞端粒酶活性。端粒酶提取是用106细胞经PBS洗涤一次，经冷裂解细胞缓冲液(0.5% CHAPS、10mmol/L Tris-HCl pH7.5,1mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA,10%甘油、5mmol/L β-乙巯基乙醇和1mmol/L PMS)于冰上裂解细胞30分钟，15 000g4℃下离心30分钟，收集上清冻存于-80℃。用相当于10～104细胞的提取液和TRAP-eze端粒酶试剂盒(Oncor, F67402 Ilkirch, France)检测端粒酶活性。其过程简要如下：首先与TS引物在30℃条件下孵育30分钟，然后经PCR反应25～26周期(KGla26周期、CEM25周期)，以α-32PdCTP为放射掺入物，PCR条件为94℃40秒、50℃40秒、72℃90秒。产物在12%聚丙酰胺胶上电泳。放射活性于分子映像系统(Biorad, Herculers, CA)测定信号强度，端粒酶活性定量是端粒酶的产物条带与内参标准带(底部条带)的放射强度之比。
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1.5 细胞同步化与细胞周期分析：指数增长期细胞用2次胸腺嘧啶(0.1mmol/L)使其同步于G1/S期，每次16小时，其间正常培养10小时，第2次同步化阻断完成时间为T0。BrdU掺入技术分析细胞周期[3]，每个检测点提取106细胞与BrdU 30μg/ml孵育15分钟，4℃下固定于70%冰乙醇18小时以上，兔抗BrdU抗体(Seralab, Asnieres, France)和Propidium iodide标记染色细胞核，流式细胞仪检测、Lysis II 和Cellfit软件(Beckton Dickinson)分析结果。
2 结果
2.1 照射后细胞存活率。3H-胸腺嘧啶掺入法测得的KGla细胞经照射0.5，1，2，3，4Gy后的存活率分别为(91.6±8.7)%、(87.6±15)%、(50.0±9.8)%,(16.5±5.0)%和(5.2±3.9)%。CEM照射1，2，3，4Gy后的存活率分别为(97.5±11)%,(35.9±10.2)%,(14.8±4.8)%和(3.2±3.0)%。台盼蓝染色法观察活细胞率，结果是KGla细胞除经2～4Gy照射后48小时的活细胞率分别为92.4%、87.8%和88.8%外，其余各检测点均在95%以上，而CEM细胞存活率均在95%以上，可见照射后48小时内对细胞的死亡率影响不大。
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2.2 照射后KGla和CEM细胞端粒酶活性。常规Kim氏TRAP方法由于细胞数的增加和端粒酶活性增加缺乏线性关系，定量分析非常困难，本实验采用Oncor TRAP-eze试剂盒，加入内参标准，大大改善了细胞数与端粒酶活性的线性关系[4]。
照射后48小时内几次检测细胞端粒酶活性，KGla和CEM细胞该酶活性明显增加(P<0.05)，增加程度与剂量有关，0～3Gy照射后逐渐增加，4Gy照射后开始减低，增加幅度于照射后24小时增加3倍以上，这种上调活性反应于照射后4小时开始(资料未显示)，8小时近高峰、24小时达高峰，此后逐渐下降(见图1)。
图1 0～4Gy照射48小时，KGla细胞端粒酶活性显示照射后端普酶活性增加
C1为提取物热失活，C2为无提取物
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2.3 照射后细胞周期的变化。辐射引起细胞周期变化G1或G2期延长，本实验两种细胞照射后细胞周期的分布如附表。KGla细胞于照射后24小时细胞堆积于G2期，与端粒酶活性高峰一致，然而照射后8小时端粒酶活性明显升高，而细胞周期G2期细胞并不增加。CEM细胞最大G2期细胞堆积时间早于KGla，在照射后24小时以前，可见端粒酶上调和G2期细胞堆积均发生于照射后8～24小时。
附表 细胞受照射后不同时间细胞周期的变化 剂量
(Gy)
8小时
24小时
48小时
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G1
S
G2/M
G1
S
G2/M
G1
S
G2/M(%)
KGla细胞
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CEM细胞
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图2 细胞受照射后上调KGla和CEM端粒酶活性的动态变化
2.4 细胞周期中端粒酶活性。由于照射后细胞堆积于G2期，促使我们观察经胸腺嘧啶同步化后各期细胞的端粒酶活性。因KGla不能用化学方法使其同步化，故仅观察CEM细胞，经第二次胸腺嘧啶阻断后，细胞同步于G1期，头6～7小时为S期，8小时左右为G2/M期，12小时后大部分细胞重新进入G1期，此时于第二次胸腺嘧啶阻断后0，4，8和12小时检测端粒酶活性，并无明显变化(P>0.05)，显示细胞各期端粒酶活性是稳定的。
3 讨论
除生殖细胞和干细胞外，正常人体组织细胞在出生后端粒酶含量甚微[2]，然而造血细胞却是表达该酶的细胞，故本研究选用端粒酶活性稳定，具有造血干/祖细胞特性的KGla和CEM细胞株，来观察γ射线照射后细胞端粒酶的变化。细胞内端粒酶受多种因素的调节，尤其是细胞的增殖分化状态[5～7]。本研究首次报道γ射线照射造血细胞能诱导端粒酶活性增加(上调反应)。
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这种上调反应见于KGla和CEM细胞经γ射线照射0～3Gy后逐渐发生，呈剂量依赖性，4Gy照射后其增加幅度减低，并与细胞凋亡无关[9]。其理由如下：①经台盼蓝染色，细胞存活率在照射后24小时内无变化，此时端粒酶活性达到高峰；②用3H胸腺嘧啶掺入法测定细胞增殖能力，结果显示小剂量的照射对细胞增殖能力影响极少，但仍有端粒酶活性上调；③KGla细胞在照射后24小时内的细胞死亡不形成DNA片断(细胞凋亡的标志之一)，仅发生于48小时后[10]。
上调该酶活性反应发生于照射后4小时，8～24小时达高峰，此后逐渐减低，同时在细胞周期分布上有G2/M期细胞堆积，提示该现象可能与细胞周期有关。为此本研究用二次胸腺嘧啶阻断法使细胞同步化，检测各期细胞端粒酶活性，结果显示该酶活性有细胞周期不同时相无明显变化，当然这一现象仍有争议[11，12]，但多数报道与我们的结果一致。
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放射线常引起细胞DNA双链断裂，这种损伤极难修复，是最严重的细胞毒效应，单个的不能修复的DNA双链断裂中足以导致细胞死亡。然而众所周知，端粒具有防止DNA降解、稳定染色体的功能，端粒的形成有利于稳定断裂的染色体[13]。在缺乏基因组DNA双链断裂端同源或随机相互连接修复方式的酵母菌株的研究发现，DNA的修复是通过形成新的端断而完成[14]；缺乏端粒酶活性的细胞其端粒缩短的速度10倍于有端粒酶活性的细胞[15]。提示端粒酶可能与DNA的修复有关，其可能的机理是γ射线所致的基因组DNA断裂处往往是类似于端粒序列的区段[16]，此时该结构区段激活端粒酶，连接该类结构区段，修复基因组DNA，防止其降解、稳定染色体，防止细胞死亡。但是确切的机制有待于进一步深入研究。
本课题受军队“八*五”青年基金资助
参考文献
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1 Harley CB, Villeponteau B.Telomeres and telomerase in aging and cancer. Curr Opin Genet Dev, 1995, 5:249.
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13 Kramer KM, Haber JE. New telomeres in yeast are initiated with a highly selected subset of TG1-3 repeats. Genet Dev, 1993, 7:2345.
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15 Levy M,Allsopp R, Futcher A, et al. Telomere end-replication problem and cell aging. J Mol Biol, 1992, 255:951.
16 Melek M, Shippen DE. Chromosome healing——spontaneous and programmed de novo telomere formation by telomerase. Bioassays, 1996, 18:301.
(收稿：1997-04-23 修回：1997-11-24), http://www.100md.com
单位：李夏新 程少杰 (广州，第一军医大学附属南方医院 510515)；洪平 (广州军区第一五七医院儿科)；F.Leteurtre (法国巴黎圣-路易医院血研所)
关键词：γ射线；造血细胞；端粒酶；细胞周期
中华放射医学与防护杂志980604 目的 以KGla和CEM两个白血病细胞株为模型，探讨γ射线照射后造血细胞中端粒酶的变化。方法细胞经照射后用3H-胸腺嘧啶渗入法测定细胞增殖能力，Kim氏TRAP方法分析端粒酶活性，并采用2次胸腺嘧啶使细胞同步化，BrdU渗入法分析细胞同步化结果及照射后细胞周期分布。结果 γ射线照射后造血细胞能增加端粒酶活性，在0～3Gy照射后酶活性逐渐上升，3Gy达高峰，在时间动态变化上，照射后8～24小时酶活性最高，此后开始下降，此时在细胞周期分布上有G2/M期细胞堆积，然而使细胞同步化后端粒酶活性在细胞各期无明显变化。结论 造血细胞的端粒酶活性在照射后的上调反应，可能与DNA的修复、稳定断裂染色体有关。
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Change of telomerase activity in gamma-irradiated hematopoietic cells.
Li Xiaxin, Hong Ping, Cheng Shaojie, et al. Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515, China.
Objective Using two hematopoietic cell lines, KGla and CEM, to investigate the variation of telomerase activity after γ-irradiation.Methods After irradiation, cell proliferation was measured by thymidine incorporation and telomerase activity of cells was analysed by Kim's TRAP assay. Cell synchronization was achieved after two-step thymidine blocks, and cell cycle was examined by BrdU incorporation technique for verifying cell cycle distribution after irradiation and cell synchronization.Results Telomerase activity increased after irradiation of between 0 and 3Gy in a dose-dependent manner, reaching the maximum at 3 Gy. The increase of telomerase activity was nearly to its maximum 8h after irradiation, the peak being observed at around 24h. Although this kinetics partly correlated with cell redistribution into the G2/M phase of the cell cycle, telomerase activity did not show significant variation over the cell cycle.Conclusion The up-regulation of telomerase in hematopoietic cell lines after γ-irradiation may suggest the involvement of telomerase in DNA repair and chromosome healing.
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Key words Gamma-rays Hematopoietic cells Telomerase Cell cycle
染色体端粒(Telomere)具有防止基因组DNA降解、避免其末端相互连接等功能，端粒的长度决定着细胞的有丝分裂能力。随着细胞的分裂、分化，端粒的长度逐渐变短，细胞的有丝分裂能力也随之减低，最后细胞衰老凋亡；肿瘤细胞端粒很短，有无限的有丝分裂能力有赖于端粒酶(Telomerase)的活化，该酶不断的合成端粒[1]。
造血细胞是辐射损伤的靶细胞之一，辐射损伤造成DNA双链断裂，导致细胞死亡。研究辐射损伤后DNA的自我修复机理，是辐射保护研究中极为重要的课题。本研究以KGla和CEM两个白血病细胞株为模型，γ射线照射后观察其端粒酶和细胞周期分布的变化，探讨端粒酶在DNA修复中的意义。
1 材料和方法
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1.1 细胞培养：KGla(髓系白血病细胞株)和CEM(T淋巴性白血病细胞株)分别用含10%～20%小牛血清的改良ISCOVE培养基和1640培养基、37℃、饱和湿度5%CO2培养，维持细胞于指数增长浓度。
1.2 辐射处理：γ射线照射时细胞浓度为1×106/ml，放射源为137Cs(IBL 437铯源，氟化锂结晶测定放射同源均一性达95%以上)，吸收剂量率为0.80Gy/min，细胞受照射剂量为0～4Gy。
1.3 3H-胸腺嘧啶测定细胞增殖能力：照射后细胞在96孔板以浓度为0.25×105/ml(0～1Gy)，0.5×105(2Gy),1×105(3Gy)和2×105(4Gy)培养5天，尔后每孔加入3.7×106Bq甲基3H胸腺嘧啶(活性25Ci/mmol,Amersham, Les Ulis, France)孵育4小时， 常规方法收集细胞、测定3H-胸腺嘧啶掺入率，计算细胞增殖能力。
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1.4 端粒酶活性测定：按Kim氏TRAP方法测定细胞端粒酶活性。端粒酶提取是用106细胞经PBS洗涤一次，经冷裂解细胞缓冲液(0.5% CHAPS、10mmol/L Tris-HCl pH7.5,1mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA,10%甘油、5mmol/L β-乙巯基乙醇和1mmol/L PMS)于冰上裂解细胞30分钟，15 000g4℃下离心30分钟，收集上清冻存于-80℃。用相当于10～104细胞的提取液和TRAP-eze端粒酶试剂盒(Oncor, F67402 Ilkirch, France)检测端粒酶活性。其过程简要如下：首先与TS引物在30℃条件下孵育30分钟，然后经PCR反应25～26周期(KGla26周期、CEM25周期)，以α-32PdCTP为放射掺入物，PCR条件为94℃40秒、50℃40秒、72℃90秒。产物在12%聚丙酰胺胶上电泳。放射活性于分子映像系统(Biorad, Herculers, CA)测定信号强度，端粒酶活性定量是端粒酶的产物条带与内参标准带(底部条带)的放射强度之比。
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1.5 细胞同步化与细胞周期分析：指数增长期细胞用2次胸腺嘧啶(0.1mmol/L)使其同步于G1/S期，每次16小时，其间正常培养10小时，第2次同步化阻断完成时间为T0。BrdU掺入技术分析细胞周期[3]，每个检测点提取106细胞与BrdU 30μg/ml孵育15分钟，4℃下固定于70%冰乙醇18小时以上，兔抗BrdU抗体(Seralab, Asnieres, France)和Propidium iodide标记染色细胞核，流式细胞仪检测、Lysis II 和Cellfit软件(Beckton Dickinson)分析结果。
2 结果
2.1 照射后细胞存活率。3H-胸腺嘧啶掺入法测得的KGla细胞经照射0.5，1，2，3，4Gy后的存活率分别为(91.6±8.7)%、(87.6±15)%、(50.0±9.8)%,(16.5±5.0)%和(5.2±3.9)%。CEM照射1，2，3，4Gy后的存活率分别为(97.5±11)%,(35.9±10.2)%,(14.8±4.8)%和(3.2±3.0)%。台盼蓝染色法观察活细胞率，结果是KGla细胞除经2～4Gy照射后48小时的活细胞率分别为92.4%、87.8%和88.8%外，其余各检测点均在95%以上，而CEM细胞存活率均在95%以上，可见照射后48小时内对细胞的死亡率影响不大。
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2.2 照射后KGla和CEM细胞端粒酶活性。常规Kim氏TRAP方法由于细胞数的增加和端粒酶活性增加缺乏线性关系，定量分析非常困难，本实验采用Oncor TRAP-eze试剂盒，加入内参标准，大大改善了细胞数与端粒酶活性的线性关系[4]。
照射后48小时内几次检测细胞端粒酶活性，KGla和CEM细胞该酶活性明显增加(P<0.05)，增加程度与剂量有关，0～3Gy照射后逐渐增加，4Gy照射后开始减低，增加幅度于照射后24小时增加3倍以上，这种上调活性反应于照射后4小时开始(资料未显示)，8小时近高峰、24小时达高峰，此后逐渐下降(见图1)。
图1 0～4Gy照射48小时，KGla细胞端粒酶活性显示照射后端普酶活性增加
C1为提取物热失活，C2为无提取物
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2.3 照射后细胞周期的变化。辐射引起细胞周期变化G1或G2期延长，本实验两种细胞照射后细胞周期的分布如附表。KGla细胞于照射后24小时细胞堆积于G2期，与端粒酶活性高峰一致，然而照射后8小时端粒酶活性明显升高，而细胞周期G2期细胞并不增加。CEM细胞最大G2期细胞堆积时间早于KGla，在照射后24小时以前，可见端粒酶上调和G2期细胞堆积均发生于照射后8～24小时。
附表 细胞受照射后不同时间细胞周期的变化 剂量
(Gy)
8小时
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图2 细胞受照射后上调KGla和CEM端粒酶活性的动态变化
2.4 细胞周期中端粒酶活性。由于照射后细胞堆积于G2期，促使我们观察经胸腺嘧啶同步化后各期细胞的端粒酶活性。因KGla不能用化学方法使其同步化，故仅观察CEM细胞，经第二次胸腺嘧啶阻断后，细胞同步于G1期，头6～7小时为S期，8小时左右为G2/M期，12小时后大部分细胞重新进入G1期，此时于第二次胸腺嘧啶阻断后0，4，8和12小时检测端粒酶活性，并无明显变化(P>0.05)，显示细胞各期端粒酶活性是稳定的。
3 讨论
除生殖细胞和干细胞外，正常人体组织细胞在出生后端粒酶含量甚微[2]，然而造血细胞却是表达该酶的细胞，故本研究选用端粒酶活性稳定，具有造血干/祖细胞特性的KGla和CEM细胞株，来观察γ射线照射后细胞端粒酶的变化。细胞内端粒酶受多种因素的调节，尤其是细胞的增殖分化状态[5～7]。本研究首次报道γ射线照射造血细胞能诱导端粒酶活性增加(上调反应)。
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这种上调反应见于KGla和CEM细胞经γ射线照射0～3Gy后逐渐发生，呈剂量依赖性，4Gy照射后其增加幅度减低，并与细胞凋亡无关[9]。其理由如下：①经台盼蓝染色，细胞存活率在照射后24小时内无变化，此时端粒酶活性达到高峰；②用3H胸腺嘧啶掺入法测定细胞增殖能力，结果显示小剂量的照射对细胞增殖能力影响极少，但仍有端粒酶活性上调；③KGla细胞在照射后24小时内的细胞死亡不形成DNA片断(细胞凋亡的标志之一)，仅发生于48小时后[10]。
上调该酶活性反应发生于照射后4小时，8～24小时达高峰，此后逐渐减低，同时在细胞周期分布上有G2/M期细胞堆积，提示该现象可能与细胞周期有关。为此本研究用二次胸腺嘧啶阻断法使细胞同步化，检测各期细胞端粒酶活性，结果显示该酶活性有细胞周期不同时相无明显变化，当然这一现象仍有争议[11，12]，但多数报道与我们的结果一致。
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放射线常引起细胞DNA双链断裂，这种损伤极难修复，是最严重的细胞毒效应，单个的不能修复的DNA双链断裂中足以导致细胞死亡。然而众所周知，端粒具有防止DNA降解、稳定染色体的功能，端粒的形成有利于稳定断裂的染色体[13]。在缺乏基因组DNA双链断裂端同源或随机相互连接修复方式的酵母菌株的研究发现，DNA的修复是通过形成新的端断而完成[14]；缺乏端粒酶活性的细胞其端粒缩短的速度10倍于有端粒酶活性的细胞[15]。提示端粒酶可能与DNA的修复有关，其可能的机理是γ射线所致的基因组DNA断裂处往往是类似于端粒序列的区段[16]，此时该结构区段激活端粒酶，连接该类结构区段，修复基因组DNA，防止其降解、稳定染色体，防止细胞死亡。但是确切的机制有待于进一步深入研究。
本课题受军队“八*五”青年基金资助
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(收稿：1997-04-23 修回：1997-11-24), http://www.100md.com