自身免疫性内耳疾病实验诊断盒研制及初步应用
作者：杨湘宁 叶小平 袁永林 王鹏
单位：510080 广州铁路中心医院耳鼻咽喉科
关键词：
我们 我们[1]曾报道以自制的牛耳蜗抗原及牛蜗神经抗原采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测不明原因感音神经性聋患者体内抗耳蜗及蜗神经相关抗体，以协助自身免疫性内耳疾病的诊断。又以人内耳作底物片作了酶免疫细胞化学检查，以探讨ELISA法与酶免疫细胞法结合诊断自身免疫性内耳病的可行性及使用价值。
一、材料与方法
1.血清：患者组血清：102份不明原因单侧或双侧不明原因感音神经性聋患者血清样本。患者年龄16～65岁；男65例，女37例；病史中排除风湿病、代谢病、药物及噪声等所致的耳聋；平均骨导听阈为42±8 dB HL，平均气导听阈49±9 dB HL。
, 百拇医药
对照组血清：30份18～36岁听力正常者血清样本。男、女样本各15份。
2.抗原：牛耳蜗抗原及牛蜗神经抗原提制及ELISA法见文献[1]。
3.人耳底物片及标记链抗生物素(labelled streptavidin biotin， LSAB)蛋白方法[2]：1～3岁死婴颞骨于死后半小时取出，固定，脱钙及石蜡包埋参考Arnold[2]及Veldman[3]方法，切片厚5 μm。LSAB蛋白方法：切片脱蜡后入3%双氧水孵育5分钟，入蒸馏水及TBS(Tris缓冲生理盐水)液中各5分钟，1∶10小牛血清阻滞背景染色，加入1∶10稀释的患者或对照组血清，室温下孵育30分钟。Tris液洗片3次后加入1∶500稀释的生物素化兔抗人IgG(Dako公司，美国)，室温30分钟，再洗片3次，加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的链抗生物素蛋白(Dako公司，美国)，室温30分钟，PBS液洗浴后加入二氨基联苯胺液5～10分钟，苏木素淡染后封片，镜下观察。阴性对照用PBS代替患者血清。
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二、结果
ELISA法结果：抗牛耳蜗抗原抗体患者组(0.9566±0.2536，
±s,下同) 与对照组(0.3764±0.0625)比较差异有显著性(P<0.01，t检验，下同)，以对照组抗牛耳蜗抗原抗体的+2s判断，患者41%(42/102)显示抗牛耳蜗抗原抗体水平升高；两组间抗牛蜗神经抗原差异无显著性(P>0.05)。基于对照组抗牛蜗神经抗原抗体的+2s判断，11.1%(12 /102)患者显示抗牛蜗神经抗原抗体升高。
, 百拇医药 LSAB蛋白法结果：35%(36/102)患者存在抗人内耳组织抗体，按其阳性率的高低主要位于螺旋神经节及其神经纤维(23例次)、蜗轴动脉壁(18例次)、血管纹(9例次)及Corti器(3例次)，见图1，2。
分析两检测法的关联性，发现29例同时显示ELISA法和LSAB蛋白法阳性，但没有发现阳性程度和听阈之间存在相关联系。
三、讨论
自身免疫性内耳疾病只能通过间接的方法确诊。较好的间接诊断方法应能满足如下条件：①方法简单，能符合大多数医院的检测条件；②准确性较高，并能连续动态地观察；③标准化的操作，以使实验误差减到最小。我们试用的ELISA法与LSAB蛋白法结合，基本能达到上述目的。实际应用中发现有如下优点：①ELISA法简单快捷，可定量分析并连续测定，可做动态观察，一次性制备抗原低温保存时间长，可避免因抗原质量不同而出现的检测误差；②婴幼儿颞骨脱钙容易，一次制备可切片100～150张，低温保存可达两年以上，不影响抗原活性；③试制检测试剂盒，每盒包括1mg/ml的牛耳蜗抗原和牛蜗神经抗原各1支，人耳底物片10张，可测定2、3份备检血清，检测时两法相互印证，以提高准确性。
, 百拇医药
一般情况下，根据该两法的检测结果可提供较可信的诊断参考，但这并不意味着能据此作出最后诊断，也不能由于体液免疫的阳性结果而排除细胞免疫异常的可能性，患者的病史询问及其对免疫抑制剂治疗的效果具有重要性。
参考文献
1 杨湘宁,叶小平,袁永林,等. 酶联免疫吸附试验用于抗耳蜗及蜗神经相关抗体检测.中华耳鼻咽喉科杂志,1996，31:291-293.
2Arnold W. Evidence of serum antibodies against inner ear tissues in the blood of patients with certain sensorineural hearing disorders. Acta Otolaryngol,1985,99:437-444.
3Veldman JE. Cochlear and retrocochlear immune-mediated inner ear disorders.Ann Otol Rhinol Laryngol,1986,95:535-540.
广东省科委资助课题(94-76)
(收稿：1997-10-23 修回：1998-03-20), 百拇医药
单位：510080 广州铁路中心医院耳鼻咽喉科
关键词：
我们 我们[1]曾报道以自制的牛耳蜗抗原及牛蜗神经抗原采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测不明原因感音神经性聋患者体内抗耳蜗及蜗神经相关抗体，以协助自身免疫性内耳疾病的诊断。又以人内耳作底物片作了酶免疫细胞化学检查，以探讨ELISA法与酶免疫细胞法结合诊断自身免疫性内耳病的可行性及使用价值。
一、材料与方法
1.血清：患者组血清：102份不明原因单侧或双侧不明原因感音神经性聋患者血清样本。患者年龄16～65岁；男65例，女37例；病史中排除风湿病、代谢病、药物及噪声等所致的耳聋；平均骨导听阈为42±8 dB HL，平均气导听阈49±9 dB HL。
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对照组血清：30份18～36岁听力正常者血清样本。男、女样本各15份。
2.抗原：牛耳蜗抗原及牛蜗神经抗原提制及ELISA法见文献[1]。
3.人耳底物片及标记链抗生物素(labelled streptavidin biotin， LSAB)蛋白方法[2]：1～3岁死婴颞骨于死后半小时取出，固定，脱钙及石蜡包埋参考Arnold[2]及Veldman[3]方法，切片厚5 μm。LSAB蛋白方法：切片脱蜡后入3%双氧水孵育5分钟，入蒸馏水及TBS(Tris缓冲生理盐水)液中各5分钟，1∶10小牛血清阻滞背景染色，加入1∶10稀释的患者或对照组血清，室温下孵育30分钟。Tris液洗片3次后加入1∶500稀释的生物素化兔抗人IgG(Dako公司，美国)，室温30分钟，再洗片3次，加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的链抗生物素蛋白(Dako公司，美国)，室温30分钟，PBS液洗浴后加入二氨基联苯胺液5～10分钟，苏木素淡染后封片，镜下观察。阴性对照用PBS代替患者血清。
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二、结果
ELISA法结果：抗牛耳蜗抗原抗体患者组(0.9566±0.2536，
±s,下同) 与对照组(0.3764±0.0625)比较差异有显著性(P<0.01，t检验，下同)，以对照组抗牛耳蜗抗原抗体的+2s判断，患者41%(42/102)显示抗牛耳蜗抗原抗体水平升高；两组间抗牛蜗神经抗原差异无显著性(P>0.05)。基于对照组抗牛蜗神经抗原抗体的+2s判断，11.1%(12 /102)患者显示抗牛蜗神经抗原抗体升高。, 百拇医药 LSAB蛋白法结果：35%(36/102)患者存在抗人内耳组织抗体，按其阳性率的高低主要位于螺旋神经节及其神经纤维(23例次)、蜗轴动脉壁(18例次)、血管纹(9例次)及Corti器(3例次)，见图1，2。
分析两检测法的关联性，发现29例同时显示ELISA法和LSAB蛋白法阳性，但没有发现阳性程度和听阈之间存在相关联系。
三、讨论
自身免疫性内耳疾病只能通过间接的方法确诊。较好的间接诊断方法应能满足如下条件：①方法简单，能符合大多数医院的检测条件；②准确性较高，并能连续动态地观察；③标准化的操作，以使实验误差减到最小。我们试用的ELISA法与LSAB蛋白法结合，基本能达到上述目的。实际应用中发现有如下优点：①ELISA法简单快捷，可定量分析并连续测定，可做动态观察，一次性制备抗原低温保存时间长，可避免因抗原质量不同而出现的检测误差；②婴幼儿颞骨脱钙容易，一次制备可切片100～150张，低温保存可达两年以上，不影响抗原活性；③试制检测试剂盒，每盒包括1mg/ml的牛耳蜗抗原和牛蜗神经抗原各1支，人耳底物片10张，可测定2、3份备检血清，检测时两法相互印证，以提高准确性。
, 百拇医药
一般情况下，根据该两法的检测结果可提供较可信的诊断参考，但这并不意味着能据此作出最后诊断，也不能由于体液免疫的阳性结果而排除细胞免疫异常的可能性，患者的病史询问及其对免疫抑制剂治疗的效果具有重要性。
参考文献
1 杨湘宁,叶小平,袁永林,等. 酶联免疫吸附试验用于抗耳蜗及蜗神经相关抗体检测.中华耳鼻咽喉科杂志,1996，31:291-293.
2Arnold W. Evidence of serum antibodies against inner ear tissues in the blood of patients with certain sensorineural hearing disorders. Acta Otolaryngol,1985,99:437-444.
3Veldman JE. Cochlear and retrocochlear immune-mediated inner ear disorders.Ann Otol Rhinol Laryngol,1986,95:535-540.
广东省科委资助课题(94-76)
(收稿：1997-10-23 修回：1998-03-20), 百拇医药