实验性中耳积液中耳粘膜中纤维粘连蛋白及层粘连蛋白的免疫组化研究
作者：王秋菊 黄德亮 杨伟炎
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科解放军耳鼻咽喉科研究所
关键词：中耳炎；伴渗出液；；疾病模型；动物；；纤连蛋白类；；层粘连蛋白
中华耳鼻咽喉科杂志980313 【摘要】 目的 探讨细胞外基质成分——纤维粘连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)在中耳积液时中耳粘膜增生中的作用。方法 在内窥镜引导下30只豚鼠行双侧咽鼓管管内烧灼，造成实验性中耳积液动物模型，以过氧化酶标记的链霉卵白素法(streptavidin peroxidase，SP)行中耳粘膜中纤维粘连蛋白、层粘连蛋白的检测。结果 实验性中耳积液动物模型成功28耳。免疫组化染色发现，中耳积液豚鼠纤维粘连蛋白和层粘连蛋白在中耳粘膜的表达比正常豚鼠增强，随着病变时间的延长，纤维粘连蛋白在增生中耳粘膜中的成纤维细胞上表达增多，层粘连蛋白在基底膜及新生血管内皮上表达明显。结论 实验证实纤维粘连蛋白、层粘连蛋白在中耳积液时参与中耳粘膜的增生反应，这可能对解释中耳粘膜增生、中耳粘连的发生机理有一定意义。
, 百拇医药
Expressions of fibronectin and laminin in the middle ear mucosa with experimental middle ear effusions: immunohistochemical study Wang Qiuju, Huang Deliang, Yang Weiyan. Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To understand the role of two components of extracellular matrix: fibronectin (FN) and laminin (LN) in the proliferated mucosa of otitis media with effusions. Methods A model of otitis media with effusions was established by coagulating the orifices of the eustachian tube under an endoscope in 30 guinea pigs. The expressions of FN and LN in the proliferated mucosa from these ears were detected using Streptavidin peroxidase (SP) method. Results In 60 ears with the orifices of the eustachinan tube coagulated, 28 ears showed otitis media with effusions. The increased expressions of FN on the fibroblasts and LN on the basement membranes and neovasculations were noted in the ears with otits media with effusions. Conclusion FN and LN may involve in the proliferated response of middle ear mucosa with otitis media with effusions. It may play a certain role in the occurrence of middle ear mucosa proliferations and adhesions.
, 百拇医药
【Key words】 Otitis media with effusions Disease models,animal Fibronectins Laminin
近些年来的一些研究表明，中耳积液的形成与迁延，中耳粘膜的增生、纤维化，骨吸收，传导性听力下降与细胞因子及细胞间粘附分子的存在密切相关[1,2]。在其它疾病的研究中发现，细胞外基质成分中的纤维粘连蛋白(fibronectin)在增进细胞的粘附，促进细胞的迁移及分化，参与细胞骨架构建及细胞形态的形成中有着活跃的功能；层粘连蛋白(laminin)在参与炎性反应，免疫应答，组织纤维化，肿瘤转移中起重要作用[3]。我们应用实验性中耳积液的动物模型观察了纤维粘连蛋白、层粘连蛋白在中耳增生粘膜中的表达情况。
材料和方法
一、动物模型的建立
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取体重为350～500 g，耳廓反射灵敏，鼓膜完整，光锥清晰，声导抗检查为A型曲线的成熟白色豚鼠35只，随机分为正常对照组(5只动物)及手术后第7、14、30天不同时间实验组，每组10只动物。术前将动物称重，耳显微镜检查鼓膜，并行听力及导抗测听检查。术前1天喂服复方新诺明50 mg/kg，术后连服3天预防感染。手术方法采用1987年Hormann[4]所提供的方法，以1%戊巴比妥钠25 mg/kg行腹腔内注射麻醉，取软腭正中切口，以70°内窥镜看清咽鼓管咽口后，用单极电灼器，将其尖端约2 mm插入双侧咽鼓管内，另一极置于下颌肌肉内，以75 mA电流烧灼咽鼓管咽段，持续约5秒，烧灼后拭净咽内分泌物，软腭切口不缝合，动物侧卧待其自行复苏。
二、组织标本的制作
对术后动物密切观察，每日测体重，检查鼓膜情况。术后第7、14、30天将动物行开胸活体灌注固定。取下双侧颞骨，剪开听泡，解剖显微镜观察积液情况。双侧颞骨以10%甲酸脱钙，脱钙满意后行梯度酒精脱水，石蜡包埋。所有的颞骨切片均为与蜗轴平行的水平切片，取与蜗轴对应之中耳腔粘膜区域做为观察区域。对照组及实验组均取同样的观察区域。
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三、免疫组化染色
本实验采用过氧化酶标记的链霉卵白素方法(streptavidin peroxidase，SP法)检测纤维粘连蛋白、层粘连蛋白的表达。Ⅰ抗包括：抗纤维粘连蛋白抗体为兔抗鼠多抗(Chemicon，美国)，抗层粘连蛋白抗体为兔抗人多抗(中山生物公司)，Ⅱ抗为生物素标记的羊抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化酶标记链霉亲合素(中山生物公司)。
颞骨石蜡切片(5 μm)脱蜡至水，3%过氧化氢去底物，0.2%胃蛋白酶消化；10%山羊血清封闭，加入适当稀释的Ⅰ抗，抗纤维粘连蛋白抗体为1∶100，抗层粘连蛋白抗体为1∶200。4℃冰箱孵育48小时；冲洗后加入Ⅱ抗(1∶100)，37℃孵育1小时；冲洗后加入Ⅲ抗(1∶100)，37℃孵育1小时。3’3-二氨基苯联胺(diaminobenzidine, DAB)显色，Mayer苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。Olympus PD-10显微镜观察。
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结果
一、中耳积液形成情况
所有对照组动物在观察期间，鼓膜均完整，光锥清晰，听力及导抗测听正常。实验组动物中耳积液的发生率为66.7%(28耳/42耳)，其中以手术后第7天时中耳积液的发生率最高(85.0%,17/20),第14天和30天分别为41.7%(5/12)和60.0%(6/10)；另外18耳，有8耳因麻醉过度及测听时脑出血死亡，有10耳因术后咽喉水肿窒息及术后进食不佳死亡。
二、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫组化染色结果
应用免疫组化SP法染色显示纤维粘连蛋白和层粘连蛋白在正常豚鼠(6耳)中耳粘膜下呈极弱阳性即浅棕黄色颗粒(图1，2)。实验各组分别做了10、12、10耳中耳积液的免疫组化染色观察，结果趋向一致：中耳粘膜增厚，成纤维细胞增多及新生血管增多，并可见粘膜下积液。免疫组化染色结果显示纤维粘连蛋白免疫阳性产物在成纤维细胞中大量表达，而层粘连蛋白阳性产物主要沉积于粘膜下基底膜及新生血管周围，表现为棕黄色或深棕黄色。在中耳粘膜的增生过程中，随着粘膜的增生及新生血管的增多，纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的表达明显增多(图3，4 )。没有中耳积液未做免疫组化染色。
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讨论
纤维粘连蛋白及层粘连蛋白均为细胞外基质成分，在体内外具有活跃的生物学功能。在对实验性中耳积液时中耳增生粘膜的检测发现，纤维粘连蛋白在成纤维细胞上随着成纤维细胞的活跃增生而表达增多；层粘连蛋白在新生血管的内皮及基底膜上亦有明显的表达。这些现象说明纤维粘连蛋白、层粘连蛋白参与了中耳粘膜的增生反应。
正常的中耳粘膜下存在少量的纤维粘连蛋白、层粘连蛋白，其作为结构支持蛋白，维持组织结构的稳定性及完整性[5]。而在病理状态下，由于各种细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子，白介素-1、6、8，肿瘤坏死因子等的刺激作用下，中耳粘膜出现一个极度增生的表现[6]。在病变的早期基底膜就被破坏，这种损害一方面使其中的纤维粘连蛋白、层粘连蛋白降解，另一方面又激活了其下的胶原酶使组织的损坏进一步加重[5]，同时又刺激了粘膜下成纤维细胞的活化与增殖。活化的成纤维细胞合成及分泌纤维粘连蛋白的功能均明显增强，纤维粘连蛋白做为纤维丝网样结构为其它细胞外基质成分的沉积和胶原原纤维的形成提供一个支架[7]。另外，层粘连蛋白也存在对成纤维细胞有刺激作用的片段，此片段与上皮生长因子有同源序列，参与组织重建和伤口修复，并刺激与之接触的成纤维细胞的增殖[8]。受刺激的成纤维细胞还吸引大量的炎细胞浸润，聚集并产生大量的细胞因子，这些细胞因子反过来又刺激成纤维细胞的增生与分化，并分泌一些细胞外基质成分，由此产生恶性循环。可以认为，中耳积液后中耳粘膜中细胞外基质成分的产生与沉积，似可解释临床上一些病例在咽鼓管功能恢复，中耳积液清除后仍发生粘连性中耳炎的原因。而寻找阻断其过度产生及沉积的方法，可能会为临床治疗提供一个新的线索。
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参考文献
1Jonhnson MD , John E. Cytokines in experimental otitis media with effusion. Laryngoscope, 1994,104:191-196.
2Himi T,Kamimura M,Kataura A, et al. Quantitative analysis of soluble cell adhesion molecules in otitis media with effusion. Acta Otolaryngol, 1994,114:285-288.
3Von der Mark K, Von der Mark H,Goodmans S, et al.Cellular responses to extracellular matrix. Kidney Int, 1992, 41:632-640.
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4Hormann K. Pathogenesis and pathophysiology of middle ear effusions. Acta Otolaryngol, 1987,440(suppl): 7-55.
5Salonen EM, Vaheri A, Meri S.et al.Plasmin and fibronectin degradation in chronic secretory otitis media.Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1989,115:48-53.
6Ryan AF,Bairl A. Growth factors during proliferation of the middle ear mucosa. Acta Otolaryngol, 1993,113: 68-74.
7Mauch C, Krieg T,Bauer EA. Role of the extracellular matrix in the degradation of connective tissue. Arch Dermatol Res, 1994, 287:107-114.
8Stetefeld J, Mayer U, Timple R, et al. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factory-like (LE) modules of laminin gammal 1 chain harboring the nidogen binding site. J Mol Biol, 1996,257:644-657.
(收稿：1998-01-07 修回：1998-03-14), 百拇医药
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科解放军耳鼻咽喉科研究所
关键词：中耳炎；伴渗出液；；疾病模型；动物；；纤连蛋白类；；层粘连蛋白
中华耳鼻咽喉科杂志980313 【摘要】 目的 探讨细胞外基质成分——纤维粘连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)在中耳积液时中耳粘膜增生中的作用。方法 在内窥镜引导下30只豚鼠行双侧咽鼓管管内烧灼，造成实验性中耳积液动物模型，以过氧化酶标记的链霉卵白素法(streptavidin peroxidase，SP)行中耳粘膜中纤维粘连蛋白、层粘连蛋白的检测。结果 实验性中耳积液动物模型成功28耳。免疫组化染色发现，中耳积液豚鼠纤维粘连蛋白和层粘连蛋白在中耳粘膜的表达比正常豚鼠增强，随着病变时间的延长，纤维粘连蛋白在增生中耳粘膜中的成纤维细胞上表达增多，层粘连蛋白在基底膜及新生血管内皮上表达明显。结论 实验证实纤维粘连蛋白、层粘连蛋白在中耳积液时参与中耳粘膜的增生反应，这可能对解释中耳粘膜增生、中耳粘连的发生机理有一定意义。
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【Abstract】 Objective To understand the role of two components of extracellular matrix: fibronectin (FN) and laminin (LN) in the proliferated mucosa of otitis media with effusions. Methods A model of otitis media with effusions was established by coagulating the orifices of the eustachian tube under an endoscope in 30 guinea pigs. The expressions of FN and LN in the proliferated mucosa from these ears were detected using Streptavidin peroxidase (SP) method. Results In 60 ears with the orifices of the eustachinan tube coagulated, 28 ears showed otitis media with effusions. The increased expressions of FN on the fibroblasts and LN on the basement membranes and neovasculations were noted in the ears with otits media with effusions. Conclusion FN and LN may involve in the proliferated response of middle ear mucosa with otitis media with effusions. It may play a certain role in the occurrence of middle ear mucosa proliferations and adhesions.
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【Key words】 Otitis media with effusions Disease models,animal Fibronectins Laminin
近些年来的一些研究表明，中耳积液的形成与迁延，中耳粘膜的增生、纤维化，骨吸收，传导性听力下降与细胞因子及细胞间粘附分子的存在密切相关[1,2]。在其它疾病的研究中发现，细胞外基质成分中的纤维粘连蛋白(fibronectin)在增进细胞的粘附，促进细胞的迁移及分化，参与细胞骨架构建及细胞形态的形成中有着活跃的功能；层粘连蛋白(laminin)在参与炎性反应，免疫应答，组织纤维化，肿瘤转移中起重要作用[3]。我们应用实验性中耳积液的动物模型观察了纤维粘连蛋白、层粘连蛋白在中耳增生粘膜中的表达情况。
材料和方法
一、动物模型的建立
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取体重为350～500 g，耳廓反射灵敏，鼓膜完整，光锥清晰，声导抗检查为A型曲线的成熟白色豚鼠35只，随机分为正常对照组(5只动物)及手术后第7、14、30天不同时间实验组，每组10只动物。术前将动物称重，耳显微镜检查鼓膜，并行听力及导抗测听检查。术前1天喂服复方新诺明50 mg/kg，术后连服3天预防感染。手术方法采用1987年Hormann[4]所提供的方法，以1%戊巴比妥钠25 mg/kg行腹腔内注射麻醉，取软腭正中切口，以70°内窥镜看清咽鼓管咽口后，用单极电灼器，将其尖端约2 mm插入双侧咽鼓管内，另一极置于下颌肌肉内，以75 mA电流烧灼咽鼓管咽段，持续约5秒，烧灼后拭净咽内分泌物，软腭切口不缝合，动物侧卧待其自行复苏。
二、组织标本的制作
对术后动物密切观察，每日测体重，检查鼓膜情况。术后第7、14、30天将动物行开胸活体灌注固定。取下双侧颞骨，剪开听泡，解剖显微镜观察积液情况。双侧颞骨以10%甲酸脱钙，脱钙满意后行梯度酒精脱水，石蜡包埋。所有的颞骨切片均为与蜗轴平行的水平切片，取与蜗轴对应之中耳腔粘膜区域做为观察区域。对照组及实验组均取同样的观察区域。
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三、免疫组化染色
本实验采用过氧化酶标记的链霉卵白素方法(streptavidin peroxidase，SP法)检测纤维粘连蛋白、层粘连蛋白的表达。Ⅰ抗包括：抗纤维粘连蛋白抗体为兔抗鼠多抗(Chemicon，美国)，抗层粘连蛋白抗体为兔抗人多抗(中山生物公司)，Ⅱ抗为生物素标记的羊抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化酶标记链霉亲合素(中山生物公司)。
颞骨石蜡切片(5 μm)脱蜡至水，3%过氧化氢去底物，0.2%胃蛋白酶消化；10%山羊血清封闭，加入适当稀释的Ⅰ抗，抗纤维粘连蛋白抗体为1∶100，抗层粘连蛋白抗体为1∶200。4℃冰箱孵育48小时；冲洗后加入Ⅱ抗(1∶100)，37℃孵育1小时；冲洗后加入Ⅲ抗(1∶100)，37℃孵育1小时。3’3-二氨基苯联胺(diaminobenzidine, DAB)显色，Mayer苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。Olympus PD-10显微镜观察。
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结果
一、中耳积液形成情况
所有对照组动物在观察期间，鼓膜均完整，光锥清晰，听力及导抗测听正常。实验组动物中耳积液的发生率为66.7%(28耳/42耳)，其中以手术后第7天时中耳积液的发生率最高(85.0%,17/20),第14天和30天分别为41.7%(5/12)和60.0%(6/10)；另外18耳，有8耳因麻醉过度及测听时脑出血死亡，有10耳因术后咽喉水肿窒息及术后进食不佳死亡。
二、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫组化染色结果
应用免疫组化SP法染色显示纤维粘连蛋白和层粘连蛋白在正常豚鼠(6耳)中耳粘膜下呈极弱阳性即浅棕黄色颗粒(图1，2)。实验各组分别做了10、12、10耳中耳积液的免疫组化染色观察，结果趋向一致：中耳粘膜增厚，成纤维细胞增多及新生血管增多，并可见粘膜下积液。免疫组化染色结果显示纤维粘连蛋白免疫阳性产物在成纤维细胞中大量表达，而层粘连蛋白阳性产物主要沉积于粘膜下基底膜及新生血管周围，表现为棕黄色或深棕黄色。在中耳粘膜的增生过程中，随着粘膜的增生及新生血管的增多，纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的表达明显增多(图3，4 )。没有中耳积液未做免疫组化染色。
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讨论
纤维粘连蛋白及层粘连蛋白均为细胞外基质成分，在体内外具有活跃的生物学功能。在对实验性中耳积液时中耳增生粘膜的检测发现，纤维粘连蛋白在成纤维细胞上随着成纤维细胞的活跃增生而表达增多；层粘连蛋白在新生血管的内皮及基底膜上亦有明显的表达。这些现象说明纤维粘连蛋白、层粘连蛋白参与了中耳粘膜的增生反应。
正常的中耳粘膜下存在少量的纤维粘连蛋白、层粘连蛋白，其作为结构支持蛋白，维持组织结构的稳定性及完整性[5]。而在病理状态下，由于各种细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子，白介素-1、6、8，肿瘤坏死因子等的刺激作用下，中耳粘膜出现一个极度增生的表现[6]。在病变的早期基底膜就被破坏，这种损害一方面使其中的纤维粘连蛋白、层粘连蛋白降解，另一方面又激活了其下的胶原酶使组织的损坏进一步加重[5]，同时又刺激了粘膜下成纤维细胞的活化与增殖。活化的成纤维细胞合成及分泌纤维粘连蛋白的功能均明显增强，纤维粘连蛋白做为纤维丝网样结构为其它细胞外基质成分的沉积和胶原原纤维的形成提供一个支架[7]。另外，层粘连蛋白也存在对成纤维细胞有刺激作用的片段，此片段与上皮生长因子有同源序列，参与组织重建和伤口修复，并刺激与之接触的成纤维细胞的增殖[8]。受刺激的成纤维细胞还吸引大量的炎细胞浸润，聚集并产生大量的细胞因子，这些细胞因子反过来又刺激成纤维细胞的增生与分化，并分泌一些细胞外基质成分，由此产生恶性循环。可以认为，中耳积液后中耳粘膜中细胞外基质成分的产生与沉积，似可解释临床上一些病例在咽鼓管功能恢复，中耳积液清除后仍发生粘连性中耳炎的原因。而寻找阻断其过度产生及沉积的方法，可能会为临床治疗提供一个新的线索。
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参考文献
1Jonhnson MD , John E. Cytokines in experimental otitis media with effusion. Laryngoscope, 1994,104:191-196.
2Himi T,Kamimura M,Kataura A, et al. Quantitative analysis of soluble cell adhesion molecules in otitis media with effusion. Acta Otolaryngol, 1994,114:285-288.
3Von der Mark K, Von der Mark H,Goodmans S, et al.Cellular responses to extracellular matrix. Kidney Int, 1992, 41:632-640.
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4Hormann K. Pathogenesis and pathophysiology of middle ear effusions. Acta Otolaryngol, 1987,440(suppl): 7-55.
5Salonen EM, Vaheri A, Meri S.et al.Plasmin and fibronectin degradation in chronic secretory otitis media.Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1989,115:48-53.
6Ryan AF,Bairl A. Growth factors during proliferation of the middle ear mucosa. Acta Otolaryngol, 1993,113: 68-74.
7Mauch C, Krieg T,Bauer EA. Role of the extracellular matrix in the degradation of connective tissue. Arch Dermatol Res, 1994, 287:107-114.
8Stetefeld J, Mayer U, Timple R, et al. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factory-like (LE) modules of laminin gammal 1 chain harboring the nidogen binding site. J Mol Biol, 1996,257:644-657.
(收稿：1998-01-07 修回：1998-03-14), 百拇医药