左手性硝基精氨酸、尼莫地平对新生大鼠缺氧缺血性脑病的防治作用
作者：王静敏 刘立新 刘挨师 冯彩凤 郝翼中 陈连元
单位：王静敏 刘立新 郝翼中 陈连元:山西医科大学第一医院儿科(太原 030001) 刘挨师:内蒙古医学院第一附属医院 冯彩凤:山西医科大学第三医院儿科
关键词：缺氧；局部缺血；尼莫地平；精氨酸
左手性硝基精氨酸 摘 要 目的：采用新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE)模型，探讨药物对HIE脑损伤的防治作用。方法：制作HIE模型，应用药物防治，取脑组织进行病理学检查及生化指标测定。结果：HIE组脑组织钙、MDA及水份含量明显高于假手术组，脑病理改变明显，且脑组织钙、MDA与水份含量呈显著正相关关系。两用药组各项生化指标均明显低于HIE组，脑病理改变明显改善。结论：左手性硝基精氨酸与尼莫地平对新生大鼠HIE有明显的防治作用，可能与一氧化氮增多、钙超载密切相关。
The preventive and therapeutic effect of Nω-nitro-L-arginine
, 百拇医药
and nimodipine on hypoxic-ischemic encephalopathy in neonatal rats
WANG Jing-Min, LIU Li-Xin, LIU Ai-Shi,FENG Cai-Feng, HAO Yi-Zhong, CHEN Lian-Yuan
Department of Pediatrics, the First Clinical Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan(030001)
Abstract AIM:The neonatal rats model with hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) was set up to explore the preventive and therapeutic effect of drugs on brain damage of HIE. METHODS：For all rats, the brain tissus was removed for pathologic examination, and content of calcium, MDA and water were measured, RESULTS：Calcium, water, MDA in the brain tissue of HIE group were higher than that of the sham group (P<0.01). In the HIE group, pathologic changes in the brian were obvious, and water content in the brain tissue was correlated strongly to brain tissue calcium, MDA content. All indexes of the treated groups were remarkedly lower than the HIE group, and pathologic changes in brain were improved. CONCLUSION：L-NNA and NM may prevent and treat the brain damage from HIE. The pathophysiologic process of HIE was closely related to increased calcium, and nitric oxide.
, 百拇医药
MeSH Anoxia; Ischemia; Nimodipine; Arginine
新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是早期新生儿最常见的中枢神经系统疾病，是引起新生儿死亡并致残的重要原因，对其防治除积极进行窒息复苏外尚无有效的方法。近年来认为一氧化氮(nitric oxide, NO)、钙超载及氧自由基(oxide free radical, OFR)均参与缺氧缺血性脑损伤的病理过程[1～3]。提出一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制剂及钙通道阻滞剂可望成为对HIE所致脑损伤具有防治作用的药物[1，4]。本研究旨在通过观察NOS抑制剂左手性硝基精氨酸(Nω-nitro-L-arginine, L-NNA)及钙通道阻滞剂尼莫地平(nimodipine, NM)对新生大鼠HIE脑组织钙、MDA、水份含量及脑组织病理学改变的影响，并探讨其对HIE防治效果。
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材料与方法
(一)实验动物、药品试剂：7 d龄Wistar大鼠24只，雌雄不限，体重(17.5±3.5) g，由山西医科大学实验动物中心提供。L-NNA为Sigma公司产品。NM由武汉市第四医院提供。
(二)实验分组：模型制作及给药方法：24只大鼠随机分为4组：假手术组(sham)、HIE组、NM组(HIE+NM防治组)、L-NNA组(HIE+L-NNA组)。模型制作[1，4，5]：四组大鼠均用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉，取颈正中切口，分离左侧颈总动脉。后三组双线结扎并切断，术后2 h置密闭容器中，8%氧气和92%氮气混合气体通过容器，2 h后取出置大气中自然复苏。给药方法：后三组均于术前30 min及HIE模型制成后即刻分别腹腔注射生理盐水(1 mL/kg)、NM(1 mg/kg)及L-NNA(2 mg/kg)各一次。
(三)指标测定：四组动物均于模型制成后24 h断头取脑组织进行病理学检查并测定脑组织中钙、丙二醛(MDA)及水分含量。
, 百拇医药
1.脑组织水及钙含量测定：取左内侧脑组织一定量精确称重(W)后置110℃烤箱中烘干24 h至恒重(D)，用干湿重法(H2O)%=[(W-D)/W×100%]计算每份脑组织水含量，结果用%表示。在烘干脑组织中加酸消化液进行湿式灰化，用原子吸收分光光度计(SHIMADIU AA-670/GU-5型)测吸光度值，以标准曲线法求脑钙含量，结果以μg/g(brain dry weight, BDW)表示。
2.脑组织MDA测定：取左外侧一定量脑组织用生理盐水制成10%匀浆，用硫代巴比妥酸法测定MDA，结果以nmol/g(brain wet weight, BWW)表示。
3.病理学检查：取小块脑组织，以10%甲醛固定，常规切片，染色，光镜下观察。
(四)统计学处理：所有数据均以
±s表示，多样本均数比较用方差分析。HIE组各指标间比较用相关分析，相关系数的假设检验用t检验。本文中统计结果均借助Ver6.03 SAS软件进行。
, 百拇医药
结 果
(一)脑组织钙、水及MDA含量的变化：HIE组脑组织钙、水及MDA含量明显高于假手术组(P<0.01)，两用药组脑钙含量显著低于HIE组(P<0.01)，水含量明显低于HIE组(P<0.05)，L-NNA组MDA显著低于HIE组(P<0.01)，NM组MDA较HIE组低，但无显著差异(P>0.05)。L-NNA组与NM组相比，L-NNA组脑组织钙及MDA略低，但各项指标均无显著差异(P>0.05)，见表1。
表1 L-NNA\,NM对新生大鼠HIE防治作用的比较
Tab 1 The comparison of the preventive and treatmenteffect of L-NNA and NM on HIE in the neonatal rats (±s,n=6)
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Treatment
BCaC
(μg/g BDW)
BWC
(%)
MDA
(nmol/g BWW)
Sham
1.94±0.97
83.98±1.15
121.4±41.4
HIE
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8.71±2.42* *
88.72±1.48* *
299.9±165.6* *
NM
5.43±2.24△△
86.18±1.08△
184.6±59.5
L-NNA
3.75±1.43△△
86.34±2.06△
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123.7±52.7△△
**P<0.01, vs sham; △P<0.05, △△P<0.01, vs HIE； BCaC=brain tissue calcium content; BWC=brain tissue water content
(二)相关分析：HIE组脑组织钙、MDA含量呈与脑水份含量显著正相关关系，脑组织钙与水含量的相关系数r=0.8627，脑组织MDA与水含量的相关系数r=0.8769，P<0.05。
(三)脑组织病理改变：HIE组脑组织在光镜下可见神经细胞水肿、变性、坏死、细胞间距增大，假手术组无类似改变，两用药组上述改变明显减轻。 讨 论
一、L-NNA对新生大鼠HIE的防治作用：
本实验中L-NNA组脑组织钙、MDA及水含量均明显低于HIE组，脑组织病理检查明显减轻。说明L-NNA对HIE脑损伤有明显的防治作用，可能由于L-NNA是NOS的竟争性抑制剂，从而抑制NO的大量产生，而减轻了缺氧缺血脑组织损伤。目前认为HIE时，NO过量产生，可激活鸟苷酸环化酶而使环一磷酸鸟苷大量生成，使N-甲基-D-天门冬氨酸受体激活，电压敏感钙通道开放[6]，细胞外大量钙离子内流，导致细胞内钙超载，使氧自由基产生增多，引起神经细胞功能和结构的损害[7]。本研究表明L-NNA可能通过抑制NO的产生，而使细胞内钙超载减轻，OFR产生减少，对HIE脑组织起了明显的保护作用。
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二、NM对新生大鼠HIE的防治作用：
本实验结果表明NM组脑组织钙、水含量较HIE组低，脑病理改变明显改善。提示NM可减轻细胞内钙超载，减轻脑水肿，对缺氧缺血脑组织起保护作用。许多实验表明在缺氧缺血的病理过程中，钙超载在HIE病理过程中起着重要作用[2，7]，而NM是钙离子通道阻滞剂，可选择性扩张脑血管，缩小梗塞面积，对缺氧缺血脑组织起保护作用[4,8,9]。我科前期工作已证实，本品对窒息幼兔脑组织有保护作用[8]。本研究结果也进一步证实了这一点。
本实验还测定了MDA含量，结果表明NM组低于HIE组，但无明显差异，这与文献报道有关NM可通过抑制钙内流而减少自由基产生的报道有差异[4]，可能与本实验的条件、方法、手段及动物的选择、模型制作不同有关。
三、L-NNA、NM对新生大鼠HIE防治作用的比较：
, 百拇医药
本实验结果表明：L-NNA组脑组织钙、MDA含量似较NM组低，但各项指标均无明显差异，说明单独使用NOS抑制剂L-NNA与钙通道阻滞剂NM对HIE脑组织保护作用相似。但是，在改变药物剂量条件下L-NNA的防治作用是否会优于NM，以及二者是否具有协同作用还有待于进一步研究。
参考文献
1 Hamada Y, Hahyakawa T, Haffori H, et al. Inhibitor of nitric oxide synthase reduce hypoxic-ischemic brain damage in the neonatal rat. Pediatr Res, 1994, 35:10.
2 徐放生.钙与新生大鼠缺氧缺血性脑病.中华儿科杂志，1994，32：203.
3 Pellegrimi DG. Excitatory amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia-induced neonatal damage. J Neurosci, 1990, 10:1035.
, http://www.100md.com
4 Roda JM. Reduction of infarct size by intra-arterial nimodipine administrered at reperfusion in a rat model of partially reversible brain focal ischemia. Stroke, 1995, 26:1888.
5 Dennis JM, Javad T, Diane S, et al. Mannitol therapy in pernatal hypoxic-ischemic brain damage in rats. Stroke, 1990, 21:1210.
6 Mayhan WG. Glutamate-induced disruption of the blood-brain barrier in rats: role of nitric oxide. Stroke, 1996, 27:965.
7 赵卫国.脑缺血脑水肿的实验研究—钙在脑缺血损伤中的作用.中华神经精神科杂志，1991，24：27.
8 郝翼中，刘立新.SOD与尼莫地平对窒息幼兔脑组织的保护作用.中国病理生理杂志，1994，10：537.
9 Whitfield PC. Nimodipine. Br J Hosp Med, 1994, 52:539.
(1998年2月25日收稿，1998年8月28日修回), 百拇医药
单位：王静敏 刘立新 郝翼中 陈连元:山西医科大学第一医院儿科(太原 030001) 刘挨师:内蒙古医学院第一附属医院 冯彩凤:山西医科大学第三医院儿科
关键词：缺氧；局部缺血；尼莫地平；精氨酸
左手性硝基精氨酸 摘 要 目的：采用新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE)模型，探讨药物对HIE脑损伤的防治作用。方法：制作HIE模型，应用药物防治，取脑组织进行病理学检查及生化指标测定。结果：HIE组脑组织钙、MDA及水份含量明显高于假手术组，脑病理改变明显，且脑组织钙、MDA与水份含量呈显著正相关关系。两用药组各项生化指标均明显低于HIE组，脑病理改变明显改善。结论：左手性硝基精氨酸与尼莫地平对新生大鼠HIE有明显的防治作用，可能与一氧化氮增多、钙超载密切相关。
The preventive and therapeutic effect of Nω-nitro-L-arginine
, 百拇医药
and nimodipine on hypoxic-ischemic encephalopathy in neonatal rats
WANG Jing-Min, LIU Li-Xin, LIU Ai-Shi,FENG Cai-Feng, HAO Yi-Zhong, CHEN Lian-Yuan
Department of Pediatrics, the First Clinical Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan(030001)
Abstract AIM:The neonatal rats model with hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) was set up to explore the preventive and therapeutic effect of drugs on brain damage of HIE. METHODS：For all rats, the brain tissus was removed for pathologic examination, and content of calcium, MDA and water were measured, RESULTS：Calcium, water, MDA in the brain tissue of HIE group were higher than that of the sham group (P<0.01). In the HIE group, pathologic changes in the brian were obvious, and water content in the brain tissue was correlated strongly to brain tissue calcium, MDA content. All indexes of the treated groups were remarkedly lower than the HIE group, and pathologic changes in brain were improved. CONCLUSION：L-NNA and NM may prevent and treat the brain damage from HIE. The pathophysiologic process of HIE was closely related to increased calcium, and nitric oxide.
, 百拇医药
MeSH Anoxia; Ischemia; Nimodipine; Arginine
新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是早期新生儿最常见的中枢神经系统疾病，是引起新生儿死亡并致残的重要原因，对其防治除积极进行窒息复苏外尚无有效的方法。近年来认为一氧化氮(nitric oxide, NO)、钙超载及氧自由基(oxide free radical, OFR)均参与缺氧缺血性脑损伤的病理过程[1～3]。提出一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制剂及钙通道阻滞剂可望成为对HIE所致脑损伤具有防治作用的药物[1，4]。本研究旨在通过观察NOS抑制剂左手性硝基精氨酸(Nω-nitro-L-arginine, L-NNA)及钙通道阻滞剂尼莫地平(nimodipine, NM)对新生大鼠HIE脑组织钙、MDA、水份含量及脑组织病理学改变的影响，并探讨其对HIE防治效果。
, http://www.100md.com
材料与方法
(一)实验动物、药品试剂：7 d龄Wistar大鼠24只，雌雄不限，体重(17.5±3.5) g，由山西医科大学实验动物中心提供。L-NNA为Sigma公司产品。NM由武汉市第四医院提供。
(二)实验分组：模型制作及给药方法：24只大鼠随机分为4组：假手术组(sham)、HIE组、NM组(HIE+NM防治组)、L-NNA组(HIE+L-NNA组)。模型制作[1，4，5]：四组大鼠均用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉，取颈正中切口，分离左侧颈总动脉。后三组双线结扎并切断，术后2 h置密闭容器中，8%氧气和92%氮气混合气体通过容器，2 h后取出置大气中自然复苏。给药方法：后三组均于术前30 min及HIE模型制成后即刻分别腹腔注射生理盐水(1 mL/kg)、NM(1 mg/kg)及L-NNA(2 mg/kg)各一次。
(三)指标测定：四组动物均于模型制成后24 h断头取脑组织进行病理学检查并测定脑组织中钙、丙二醛(MDA)及水分含量。
, 百拇医药
1.脑组织水及钙含量测定：取左内侧脑组织一定量精确称重(W)后置110℃烤箱中烘干24 h至恒重(D)，用干湿重法(H2O)%=[(W-D)/W×100%]计算每份脑组织水含量，结果用%表示。在烘干脑组织中加酸消化液进行湿式灰化，用原子吸收分光光度计(SHIMADIU AA-670/GU-5型)测吸光度值，以标准曲线法求脑钙含量，结果以μg/g(brain dry weight, BDW)表示。
2.脑组织MDA测定：取左外侧一定量脑组织用生理盐水制成10%匀浆，用硫代巴比妥酸法测定MDA，结果以nmol/g(brain wet weight, BWW)表示。
3.病理学检查：取小块脑组织，以10%甲醛固定，常规切片，染色，光镜下观察。
(四)统计学处理：所有数据均以
±s表示，多样本均数比较用方差分析。HIE组各指标间比较用相关分析，相关系数的假设检验用t检验。本文中统计结果均借助Ver6.03 SAS软件进行。, 百拇医药
结 果
(一)脑组织钙、水及MDA含量的变化：HIE组脑组织钙、水及MDA含量明显高于假手术组(P<0.01)，两用药组脑钙含量显著低于HIE组(P<0.01)，水含量明显低于HIE组(P<0.05)，L-NNA组MDA显著低于HIE组(P<0.01)，NM组MDA较HIE组低，但无显著差异(P>0.05)。L-NNA组与NM组相比，L-NNA组脑组织钙及MDA略低，但各项指标均无显著差异(P>0.05)，见表1。
表1 L-NNA\,NM对新生大鼠HIE防治作用的比较
Tab 1 The comparison of the preventive and treatmenteffect of L-NNA and NM on HIE in the neonatal rats (
±s,n=6), http://www.100md.com
Treatment
BCaC
(μg/g BDW)
BWC
(%)
MDA
(nmol/g BWW)
Sham
1.94±0.97
83.98±1.15
121.4±41.4
HIE
, http://www.100md.com
8.71±2.42* *
88.72±1.48* *
299.9±165.6* *
NM
5.43±2.24△△
86.18±1.08△
184.6±59.5
L-NNA
3.75±1.43△△
86.34±2.06△
, http://www.100md.com
123.7±52.7△△
**P<0.01, vs sham; △P<0.05, △△P<0.01, vs HIE； BCaC=brain tissue calcium content; BWC=brain tissue water content
(二)相关分析：HIE组脑组织钙、MDA含量呈与脑水份含量显著正相关关系，脑组织钙与水含量的相关系数r=0.8627，脑组织MDA与水含量的相关系数r=0.8769，P<0.05。
(三)脑组织病理改变：HIE组脑组织在光镜下可见神经细胞水肿、变性、坏死、细胞间距增大，假手术组无类似改变，两用药组上述改变明显减轻。 讨 论
一、L-NNA对新生大鼠HIE的防治作用：
本实验中L-NNA组脑组织钙、MDA及水含量均明显低于HIE组，脑组织病理检查明显减轻。说明L-NNA对HIE脑损伤有明显的防治作用，可能由于L-NNA是NOS的竟争性抑制剂，从而抑制NO的大量产生，而减轻了缺氧缺血脑组织损伤。目前认为HIE时，NO过量产生，可激活鸟苷酸环化酶而使环一磷酸鸟苷大量生成，使N-甲基-D-天门冬氨酸受体激活，电压敏感钙通道开放[6]，细胞外大量钙离子内流，导致细胞内钙超载，使氧自由基产生增多，引起神经细胞功能和结构的损害[7]。本研究表明L-NNA可能通过抑制NO的产生，而使细胞内钙超载减轻，OFR产生减少，对HIE脑组织起了明显的保护作用。
, http://www.100md.com
二、NM对新生大鼠HIE的防治作用：
本实验结果表明NM组脑组织钙、水含量较HIE组低，脑病理改变明显改善。提示NM可减轻细胞内钙超载，减轻脑水肿，对缺氧缺血脑组织起保护作用。许多实验表明在缺氧缺血的病理过程中，钙超载在HIE病理过程中起着重要作用[2，7]，而NM是钙离子通道阻滞剂，可选择性扩张脑血管，缩小梗塞面积，对缺氧缺血脑组织起保护作用[4,8,9]。我科前期工作已证实，本品对窒息幼兔脑组织有保护作用[8]。本研究结果也进一步证实了这一点。
本实验还测定了MDA含量，结果表明NM组低于HIE组，但无明显差异，这与文献报道有关NM可通过抑制钙内流而减少自由基产生的报道有差异[4]，可能与本实验的条件、方法、手段及动物的选择、模型制作不同有关。
三、L-NNA、NM对新生大鼠HIE防治作用的比较：
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本实验结果表明：L-NNA组脑组织钙、MDA含量似较NM组低，但各项指标均无明显差异，说明单独使用NOS抑制剂L-NNA与钙通道阻滞剂NM对HIE脑组织保护作用相似。但是，在改变药物剂量条件下L-NNA的防治作用是否会优于NM，以及二者是否具有协同作用还有待于进一步研究。
参考文献
1 Hamada Y, Hahyakawa T, Haffori H, et al. Inhibitor of nitric oxide synthase reduce hypoxic-ischemic brain damage in the neonatal rat. Pediatr Res, 1994, 35:10.
2 徐放生.钙与新生大鼠缺氧缺血性脑病.中华儿科杂志，1994，32：203.
3 Pellegrimi DG. Excitatory amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia-induced neonatal damage. J Neurosci, 1990, 10:1035.
, http://www.100md.com
4 Roda JM. Reduction of infarct size by intra-arterial nimodipine administrered at reperfusion in a rat model of partially reversible brain focal ischemia. Stroke, 1995, 26:1888.
5 Dennis JM, Javad T, Diane S, et al. Mannitol therapy in pernatal hypoxic-ischemic brain damage in rats. Stroke, 1990, 21:1210.
6 Mayhan WG. Glutamate-induced disruption of the blood-brain barrier in rats: role of nitric oxide. Stroke, 1996, 27:965.
7 赵卫国.脑缺血脑水肿的实验研究—钙在脑缺血损伤中的作用.中华神经精神科杂志，1991，24：27.
8 郝翼中，刘立新.SOD与尼莫地平对窒息幼兔脑组织的保护作用.中国病理生理杂志，1994，10：537.
9 Whitfield PC. Nimodipine. Br J Hosp Med, 1994, 52:539.
(1998年2月25日收稿，1998年8月28日修回), 百拇医药