中性粒细胞抑制吞噬细胞U937生成TNF-α*
作者：颜亮
单位：暨南大学医学院病理生理教研室(广州，510632)
关键词：人类；中性粒细胞；吞噬细胞；肿瘤坏死因子；一氧化氮
中性粒细胞抑制吞噬细胞U937生成TNF 摘 要 目的：观察免疫活性细胞的相互作用及其对TNF-α生成的影响。方法：分离人中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes, PMN)并与PMA刺激分化为单核细胞样细胞的U937细胞在不同条件下共同培养。结果：在LPS作用下U937细胞可产生大量TNF-α。PMN在相同条件下并不产生TNF-α。将PMN与U937细胞共同培养可抑制U937细胞TNF-α的生成。PMN的抑制作用呈数量依赖性。将两种细胞共处于同一培养体系中并用0.4 μm的滤网分开使其不能直接接触，U937细胞产生TNF-α的能力恢复至无PMN时的85%以上。一氧化氮供体硝普钠可轻微提高U937细胞产生TNF-α的能力。但提高的幅度在有或无PMN存在的条件下均相同，与无硝普钠的对照组比较无明显差异(P>0.05)。经鼠诱导型一氧化氮合酶基因转染的U937细胞表达一氧化氮合酶的活性，所产生的内源性一氧化氮对PMN的抑制作用无影响。结论：提示PMN并非TNF-α生成细胞。PMN对单核细胞TNF-α的生成有抑制性调节作用。这种抑制作用的机制可能与一氧化氮信息传导通路无关。
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Human neutrophils inhibit TNF-α production in phagocytic cell U937
YAN Liang
Department of Pathophysiology, Medical College of Jinan University, Guangzhou (510632)
Abstract AIM:To investigate the interaction between immunoactive cells and TNF-α production.METHODS：phorbol myristate acetate(PMA) differentiated U937 cells were cocultured with human polymorphonuclear leukocytes (PMN) in the presence of LPS. The supernatants of cell culture were collected and TNF-α was assayed with ELISA.RESULTS：U937 cells treated with PMA differentited to monocyte-like cells and produced large amount of TNF-α in the presence of LPS. Human PMN did not produce detectable amount of TNF-α in the same condition. Increasing numbers of PMN decreased U937 cell TNF-α secretion in a dose dependent manner. Separation of PMN from U937 cells by a 0.4 μm filter insert in the co-culture system restored TNF-α release by >85%. Sodium nitroprusside slightly increased TNF-α secretion by PMA differentiated U937 cells to a similar extent whether in the absence or presence of 5×106 PMN but there was no statistic significance when compared to the cells without sodium nitroprusside treatment (P>0.05). U937 cells transfected with mouse macrophage inducible nitric oxide synthase (NOS) gene expressed NOS activity. However, this endogenously produced NO did not affect PMN mediated inhibition of TNF-α secretion in transfected U937 cells.CONCLUSIONS：The results indicated that PMN is not likely a source of TNF-α producing cells. PMN downregulated TNF-α production by human phagocytic cells. The mechanism of PMN inhibition seemed independent to the nitric oxide signaling pathway.
, 百拇医药
MeSH Human; Neutrophils; Phagocytes, Tumor necrosis factor; Nitric oxide
TNF-α是机体免疫系统的重要细胞因子，具有抑制和杀灭致病原和肿瘤细胞的功能。TNF-α能激活多种免疫活性细胞，引发广泛的生物学效应[1]。给实验动物注射大剂量的TNF-α可复制感染性休克的大部分临床症状，在感染性休克病人也可观察到体液中TNF-α升高，推测机体过量产生TNF-α，其毒性作用在感染性休克发病机制中起重要作用[2，3]。
TNF-α主要由激活的单核巨噬细胞产生。近年来有文献报道人中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes, PMN)也是TNF-α生成的来源[4，5]。由于中性粒细胞数量巨大，分布广泛，一般认为感染性休克时的组织损伤与此有关。
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最近我们报道了一种可获得高纯度PMN的方法[6]。我们发现高纯度的PMN体外培养并不产生TNF-α。相反，PMN能抑制人单核细胞生成TNF-α。本文报道PMN对人吞噬细胞U937生成TNF-α的抑制作用。
材料与方法
一、人中性粒细胞的分离：
按照文献[6]的方法，从健康成年人静脉血分离PMN。单个核细胞污染率<1.2%，单核细胞污染率<0.2%。细胞成活率>99%，培养24 h后，细胞成活率>95%。
二、细胞培养和TNF-α测定：
人吞噬细胞U937购自ATCC。细胞用RPMI 1640(含25 mmol/L HEPES)+10%胎牛血清培养。细胞经佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate, PMA)刺激后分化为单核细胞样细胞，在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作用下可产生大量TNF-α。调细胞浓度为5×105/孔于24孔培养板，每孔置1.5 mL含有100 nmol/L PMA 的RPMI 1640 培养48 h，用无钙、镁的Hank液洗两次，重新置于1 mL无PMA的新鲜培养基(内含LPS，浓度为1μg/mL)中继续培养24 h，离心取上清测定TNF-α含量。所用的ELISA测定试剂盒为美国R&D SYSTEM产品，检测下限为15 pg/mL。为了观察PMN对U937产生TNF-α的影响，按实验要求分别加入(0～5)×106个细胞的PMN于U937细胞中共同培养。24 h后离心取上清测定TNF-α含量。以上实验均同时设置相同细胞数的单纯PMN对照组。
, 百拇医药
三、插入式嵌套滤网共培养体系：
实验用12孔插入式嵌套滤网培养板。0.4 μm的滤网使培养孔分为上下两层，U937细胞置于下层，PMN置于上层，两种细胞不能直接接触，但培养液和可溶性成分可通过滤网互相连通。细胞处理同方法二。共培养24 h后，弃去PMN离心取无细胞上清液测定TNF-α含量。
四、一氧化氮(nitric oxide, NO)对PMN抑制作用的影响：
细胞按方法二处理测定TNF-α。在培养液中加入500 μmol/L NO供体亚硝基铁氰化钠(硝普钠，sodium nitroprusside, SNP)，观察外源性NO对两种细胞相互作用的影响。铁氰化钾(potassium ferricyanide, PFe)是与硝普钠分子结构相似但缺少亚硝基基团的化合物，设置500 μmol/L PFe为对照。用鼠巨噬细胞RAW 264.7诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) cDNA构建真核细胞表达质粒载体，用电钻孔方法将iNOS基因导入U937细胞，经Hygromycin抗性标记选择后获得稳定表达iNOS活性，产生内源性NO的U937细胞。PMA分化刺激不影响iNOS活性的表达。同法用载体DNA建立对照细胞。按方法二处理iNOS基因转染细胞测定TNF-α，观察内源性NO的作用。实验同时设置载体DNA(Vector)转染细胞及单纯PMN对照组。
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五、统计学处理：
所有数据均用均数±标准差(x±s)表示，各组内均数差异显著性用双侧t检验比较，各组间的均数差异显著性用Bonferroni校正的双侧t检验比较。
结果
一、PMN对U937细胞TNF-α生成的抑制作用：
在LPS作用下，PMN本身并不产生TNF-α，5×106 PMN培养24 h测得TNF-α仅为(8±3) pg/mL，为本实验使用的ELISA试剂盒的检出下限水平(15 pg/mL)以下。U937细胞经PMA刺激分化后，在LPS作用下，产生大量TNF-α(17.36±2.38 ng/mL)，为相同数量PMN所产生的TNF-α的2000倍以上。加入PMN共培养，U937细胞的TNF-α生成受到明显抑制，抑制作用呈PMN数量依赖性(P<0.001)。当PMN与U937细胞之比为1∶1时，TNF-α生成减少至8.81±2.9 ng/mL;当PMN与U937细胞之比为10∶1时，TNF-α减少至1.4±0.53 ng/mL(图1)。
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Fig 1 Inhibitory effect of PMN on TNF-α production in PMA differentiated U937 cells (n=7) 图1 PMN对经PMA刺激分化的U937细胞产生TNF-α的抑制作用
二、PMN与U937共同培养但用滤网隔开失去直接接触后，其抑制TNF-α生成的作用基本消失，U937细胞产生TNF-α的能力恢复至无PMN时的85%以上(5×106 PMN，图2)。加入不同数量PMN对U937细胞产生的TNF-α影响无明显差异(P>0.05)。
, 百拇医药
Fig 2 Effect of filter insert seperation on the PMN inhibition of TNF-α production by U937 cells (n=3) 图2 插入式嵌套滤网共培养对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响
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Fig 3 Effect of exogenous NO on the PMN inhibition of TNF-α production by U937 cells (n=7)
SNP: Sodium nitroprusside (sodium nitroferricyanide, NO donor, 500 μmol/L)
PFe:potassium ferricyanide, of which the chemical structure is similar to nitroferricyanide but lacks a nitrosol group, used as control (500 μmol/L) 图3 外源性NO对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响
, 百拇医药
Fig 4 Effect of endogenous NO on the PMN inhibition of TNF-α production by U937 cells (n=5)
iNOS: Cells transfected with iNOS gene
Vector: Cells transfected with vector DNA as control 图4 内源性NO对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响
三、NO对两种细胞相互作用的影响：
外源性NO供体硝普钠(500 μmol/L)轻微提高U937细胞产生TNF-α的能力，但提高的幅度在有或无PMN存在的条件下均相同，且与PFe对照组相比无明显差异(P>0.05，图3)。外源性NO并不增加PMN生成TNF-α(图3)。内源性NO对PMN的抑制作用无明显影响(P>0.05，图4)。
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讨论
本研究在观察PMN与人吞噬细胞U937相互作用时发现，PMN并不产生TNF-α。相反，PMN抑制U937细胞TNF-α的生成。PMN的抑制作用呈数量依赖性。PMN必须与U937细胞直接接触才能产生抑制作用。用滤网将两种细胞隔开，虽然处于同一培养体系中，可溶性物质可自由通透，但抑制作用消失。进一步观察表明，此抑制作用与NO信息传导无关，内外源性NO对PMN的抑制作用均无影响。
一般认为，TNF-α主要由体内激活的单核巨噬细胞产生[7]。本实验所用的U937细胞是人吞噬细胞，经PMA刺激分化表现出单核细胞的特征[8]，在LPS作用下，可产生大量TNF-α。近年来有人报道人中性粒细胞也能产生TNF-α[4，5]，并推测由PMN产生的TNF-α在某些组织病理损伤中起重要作用。
我们的实验证实高纯度的人PMN并不产生TNF-α，所测得的数值在检测方法下限以下。以往关于PMN能产生TNF-α的文献报道所测得的TNF-α数值一般都在100 pg/mL以下，不到相同数量单个核细胞在相同条件下的百分之一。加上常规分离PMN的方法不可避免污染相当数量的单个核细胞。我们有理由推测，这些报道关于PMN产生的TNF-α不能排除其来源于污染的单个核细胞的可能性。
, 百拇医药
PMN不但不产生TNF-α，而且抑制单核细胞产生TNF-α。本实验证实，PMN对U937细胞产生TNF-α的抑制作用呈数量依赖性，而且有赖于细胞之间的直接接触。用滤网将PMN与U937细胞隔开，虽然共处同一培养体系，可溶性物质可通过滤网，但抑制作用基本消失。以上结果说明，PMN不单是机体重要的防御细胞，负责吞噬和清除致病原及感染物，而且是机体重要的免疫调节细胞。通过细胞与细胞间的相互作用，对机体产生的TNF-α这一重要细胞因子起负调节作用。
van Dervort等曾报道NO供体SNP可增加PMN产生TNF-α，但对人单核细胞TNF-α生成无明显影响[9]。我们的实验结果关于NO对人单核细胞TNF-α生成的影响与van Derivort等的结果相似。但我们的结果表明，PMN并不产生TNF-α。由于van Derivort等的实验用常规方法分离PMN，其单核细胞污染率平均为1.4%[9]，几乎是本文所用方法的10倍，因此，他们所示PMN产生的TNF-α，有可能来源于污染的单核细胞，而NO增加其实验体系TNF-α的生成，很可能在于NO解除了PMN对单核细胞TNF-α生成的抑制作用。基于这样的假设，我们观察了内外源性NO对PMN抑制作用的影响。从我们的实验结果可见，NO并不增加PMN生成TNF-α，这进一步证实PMN并非TNF-α生成细胞。但是，内外源性NO对PMN抑制U937细胞生成TNF-α均无影响，其机理尚待深入探讨。
, http://www.100md.com
既然机体过量产生TNF-α可引发感染性休克等严重的毒性作用，而PMN可随数量增加抑制单核细胞生成TNF-α，应有降低TNF-α所致毒性作用的可能。同时，PMN又能有效清除致病菌及其产生的毒素，因此，提高机体PMN数量可能对感染性休克的治疗产生有益的影响，这将为感染性休克的临床治疗提供新的思路。
(本研究得到美国国家卫生研究院 Robert L. Danner 教授的帮助和指导，特此致谢!)
* 国家自然科学基金(39670309)和卫生部科学基金资助
参考文献
1 Fong Y, Lowry SF. Tumor necrosis factor in the pathophysiology of infection and sepsis. Clin Immunol Immunopathol, 1990， 55:157.
, 百拇医药
2 Glauser MP, Zanetti G, Baumgartner JD. et al. Septic shock pathogenesis. Lancet, 1991, 338:732.
3 Mohler KM, Sleath PR, Fitzner JN, et al. Protection against a lethal dose of endotoxin by an inhibitor of tumor necrosis factor processing. Nature, 1994, 370:218.
4 Dubravek DB, Spriggs DR, Mannick JA, et al. Circulating human peripheral blood, granulocytes synthesize and secrete tumor necrosis factor-α. Proc Nalt Acad Sci USA, 1990, 87:6758.
, 百拇医药
5 Djeu JY, Serbousek D, Bloanchard DK. Release of tumor necrosis factor by human polymorphonuclear leukocytes. Blood 1990， 76:1405.
6 颜 亮.高纯度人中性粒细胞分离方法.中国病理生理杂志，1997，13：770.
7 vassalli P. The pathophysiology of tumor necrosis factor. Annu Rev Immunol, 1992, 10:441.
8 Hass R, Lonnemann G, Mannel D, et al. Regulation of TNF-α, IL-1 and IL-6 synthesis in differentiating human monoblastoid leukemic cells. Leukemia Res, 1991, 15:327.
9 Van Dervort AL, Yan L, Madara PJ, et al. Nitric oxide regulates endotoxin-induced TNF-α production by human neutrophils. J Immunol, 1994, 152:4102.
(1999年元月5日收稿，1999年3月24日修回), 百拇医药
单位：暨南大学医学院病理生理教研室(广州，510632)
关键词：人类；中性粒细胞；吞噬细胞；肿瘤坏死因子；一氧化氮
中性粒细胞抑制吞噬细胞U937生成TNF 摘 要 目的：观察免疫活性细胞的相互作用及其对TNF-α生成的影响。方法：分离人中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes, PMN)并与PMA刺激分化为单核细胞样细胞的U937细胞在不同条件下共同培养。结果：在LPS作用下U937细胞可产生大量TNF-α。PMN在相同条件下并不产生TNF-α。将PMN与U937细胞共同培养可抑制U937细胞TNF-α的生成。PMN的抑制作用呈数量依赖性。将两种细胞共处于同一培养体系中并用0.4 μm的滤网分开使其不能直接接触，U937细胞产生TNF-α的能力恢复至无PMN时的85%以上。一氧化氮供体硝普钠可轻微提高U937细胞产生TNF-α的能力。但提高的幅度在有或无PMN存在的条件下均相同，与无硝普钠的对照组比较无明显差异(P>0.05)。经鼠诱导型一氧化氮合酶基因转染的U937细胞表达一氧化氮合酶的活性，所产生的内源性一氧化氮对PMN的抑制作用无影响。结论：提示PMN并非TNF-α生成细胞。PMN对单核细胞TNF-α的生成有抑制性调节作用。这种抑制作用的机制可能与一氧化氮信息传导通路无关。
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Human neutrophils inhibit TNF-α production in phagocytic cell U937
YAN Liang
Department of Pathophysiology, Medical College of Jinan University, Guangzhou (510632)
Abstract AIM:To investigate the interaction between immunoactive cells and TNF-α production.METHODS：phorbol myristate acetate(PMA) differentiated U937 cells were cocultured with human polymorphonuclear leukocytes (PMN) in the presence of LPS. The supernatants of cell culture were collected and TNF-α was assayed with ELISA.RESULTS：U937 cells treated with PMA differentited to monocyte-like cells and produced large amount of TNF-α in the presence of LPS. Human PMN did not produce detectable amount of TNF-α in the same condition. Increasing numbers of PMN decreased U937 cell TNF-α secretion in a dose dependent manner. Separation of PMN from U937 cells by a 0.4 μm filter insert in the co-culture system restored TNF-α release by >85%. Sodium nitroprusside slightly increased TNF-α secretion by PMA differentiated U937 cells to a similar extent whether in the absence or presence of 5×106 PMN but there was no statistic significance when compared to the cells without sodium nitroprusside treatment (P>0.05). U937 cells transfected with mouse macrophage inducible nitric oxide synthase (NOS) gene expressed NOS activity. However, this endogenously produced NO did not affect PMN mediated inhibition of TNF-α secretion in transfected U937 cells.CONCLUSIONS：The results indicated that PMN is not likely a source of TNF-α producing cells. PMN downregulated TNF-α production by human phagocytic cells. The mechanism of PMN inhibition seemed independent to the nitric oxide signaling pathway.
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MeSH Human; Neutrophils; Phagocytes, Tumor necrosis factor; Nitric oxide
TNF-α是机体免疫系统的重要细胞因子，具有抑制和杀灭致病原和肿瘤细胞的功能。TNF-α能激活多种免疫活性细胞，引发广泛的生物学效应[1]。给实验动物注射大剂量的TNF-α可复制感染性休克的大部分临床症状，在感染性休克病人也可观察到体液中TNF-α升高，推测机体过量产生TNF-α，其毒性作用在感染性休克发病机制中起重要作用[2，3]。
TNF-α主要由激活的单核巨噬细胞产生。近年来有文献报道人中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes, PMN)也是TNF-α生成的来源[4，5]。由于中性粒细胞数量巨大，分布广泛，一般认为感染性休克时的组织损伤与此有关。
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最近我们报道了一种可获得高纯度PMN的方法[6]。我们发现高纯度的PMN体外培养并不产生TNF-α。相反，PMN能抑制人单核细胞生成TNF-α。本文报道PMN对人吞噬细胞U937生成TNF-α的抑制作用。
材料与方法
一、人中性粒细胞的分离：
按照文献[6]的方法，从健康成年人静脉血分离PMN。单个核细胞污染率<1.2%，单核细胞污染率<0.2%。细胞成活率>99%，培养24 h后，细胞成活率>95%。
二、细胞培养和TNF-α测定：
人吞噬细胞U937购自ATCC。细胞用RPMI 1640(含25 mmol/L HEPES)+10%胎牛血清培养。细胞经佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate, PMA)刺激后分化为单核细胞样细胞，在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作用下可产生大量TNF-α。调细胞浓度为5×105/孔于24孔培养板，每孔置1.5 mL含有100 nmol/L PMA 的RPMI 1640 培养48 h，用无钙、镁的Hank液洗两次，重新置于1 mL无PMA的新鲜培养基(内含LPS，浓度为1μg/mL)中继续培养24 h，离心取上清测定TNF-α含量。所用的ELISA测定试剂盒为美国R&D SYSTEM产品，检测下限为15 pg/mL。为了观察PMN对U937产生TNF-α的影响，按实验要求分别加入(0～5)×106个细胞的PMN于U937细胞中共同培养。24 h后离心取上清测定TNF-α含量。以上实验均同时设置相同细胞数的单纯PMN对照组。
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三、插入式嵌套滤网共培养体系：
实验用12孔插入式嵌套滤网培养板。0.4 μm的滤网使培养孔分为上下两层，U937细胞置于下层，PMN置于上层，两种细胞不能直接接触，但培养液和可溶性成分可通过滤网互相连通。细胞处理同方法二。共培养24 h后，弃去PMN离心取无细胞上清液测定TNF-α含量。
四、一氧化氮(nitric oxide, NO)对PMN抑制作用的影响：
细胞按方法二处理测定TNF-α。在培养液中加入500 μmol/L NO供体亚硝基铁氰化钠(硝普钠，sodium nitroprusside, SNP)，观察外源性NO对两种细胞相互作用的影响。铁氰化钾(potassium ferricyanide, PFe)是与硝普钠分子结构相似但缺少亚硝基基团的化合物，设置500 μmol/L PFe为对照。用鼠巨噬细胞RAW 264.7诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) cDNA构建真核细胞表达质粒载体，用电钻孔方法将iNOS基因导入U937细胞，经Hygromycin抗性标记选择后获得稳定表达iNOS活性，产生内源性NO的U937细胞。PMA分化刺激不影响iNOS活性的表达。同法用载体DNA建立对照细胞。按方法二处理iNOS基因转染细胞测定TNF-α，观察内源性NO的作用。实验同时设置载体DNA(Vector)转染细胞及单纯PMN对照组。
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五、统计学处理：
所有数据均用均数±标准差(x±s)表示，各组内均数差异显著性用双侧t检验比较，各组间的均数差异显著性用Bonferroni校正的双侧t检验比较。
结果
一、PMN对U937细胞TNF-α生成的抑制作用：
在LPS作用下，PMN本身并不产生TNF-α，5×106 PMN培养24 h测得TNF-α仅为(8±3) pg/mL，为本实验使用的ELISA试剂盒的检出下限水平(15 pg/mL)以下。U937细胞经PMA刺激分化后，在LPS作用下，产生大量TNF-α(17.36±2.38 ng/mL)，为相同数量PMN所产生的TNF-α的2000倍以上。加入PMN共培养，U937细胞的TNF-α生成受到明显抑制，抑制作用呈PMN数量依赖性(P<0.001)。当PMN与U937细胞之比为1∶1时，TNF-α生成减少至8.81±2.9 ng/mL;当PMN与U937细胞之比为10∶1时，TNF-α减少至1.4±0.53 ng/mL(图1)。
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Fig 1 Inhibitory effect of PMN on TNF-α production in PMA differentiated U937 cells (n=7) 图1 PMN对经PMA刺激分化的U937细胞产生TNF-α的抑制作用
二、PMN与U937共同培养但用滤网隔开失去直接接触后，其抑制TNF-α生成的作用基本消失，U937细胞产生TNF-α的能力恢复至无PMN时的85%以上(5×106 PMN，图2)。加入不同数量PMN对U937细胞产生的TNF-α影响无明显差异(P>0.05)。
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Fig 2 Effect of filter insert seperation on the PMN inhibition of TNF-α production by U937 cells (n=3) 图2 插入式嵌套滤网共培养对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响
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Fig 3 Effect of exogenous NO on the PMN inhibition of TNF-α production by U937 cells (n=7)
SNP: Sodium nitroprusside (sodium nitroferricyanide, NO donor, 500 μmol/L)
PFe:potassium ferricyanide, of which the chemical structure is similar to nitroferricyanide but lacks a nitrosol group, used as control (500 μmol/L) 图3 外源性NO对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响
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Fig 4 Effect of endogenous NO on the PMN inhibition of TNF-α production by U937 cells (n=5)
iNOS: Cells transfected with iNOS gene
Vector: Cells transfected with vector DNA as control 图4 内源性NO对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响
三、NO对两种细胞相互作用的影响：
外源性NO供体硝普钠(500 μmol/L)轻微提高U937细胞产生TNF-α的能力，但提高的幅度在有或无PMN存在的条件下均相同，且与PFe对照组相比无明显差异(P>0.05，图3)。外源性NO并不增加PMN生成TNF-α(图3)。内源性NO对PMN的抑制作用无明显影响(P>0.05，图4)。
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讨论
本研究在观察PMN与人吞噬细胞U937相互作用时发现，PMN并不产生TNF-α。相反，PMN抑制U937细胞TNF-α的生成。PMN的抑制作用呈数量依赖性。PMN必须与U937细胞直接接触才能产生抑制作用。用滤网将两种细胞隔开，虽然处于同一培养体系中，可溶性物质可自由通透，但抑制作用消失。进一步观察表明，此抑制作用与NO信息传导无关，内外源性NO对PMN的抑制作用均无影响。
一般认为，TNF-α主要由体内激活的单核巨噬细胞产生[7]。本实验所用的U937细胞是人吞噬细胞，经PMA刺激分化表现出单核细胞的特征[8]，在LPS作用下，可产生大量TNF-α。近年来有人报道人中性粒细胞也能产生TNF-α[4，5]，并推测由PMN产生的TNF-α在某些组织病理损伤中起重要作用。
我们的实验证实高纯度的人PMN并不产生TNF-α，所测得的数值在检测方法下限以下。以往关于PMN能产生TNF-α的文献报道所测得的TNF-α数值一般都在100 pg/mL以下，不到相同数量单个核细胞在相同条件下的百分之一。加上常规分离PMN的方法不可避免污染相当数量的单个核细胞。我们有理由推测，这些报道关于PMN产生的TNF-α不能排除其来源于污染的单个核细胞的可能性。
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PMN不但不产生TNF-α，而且抑制单核细胞产生TNF-α。本实验证实，PMN对U937细胞产生TNF-α的抑制作用呈数量依赖性，而且有赖于细胞之间的直接接触。用滤网将PMN与U937细胞隔开，虽然共处同一培养体系，可溶性物质可通过滤网，但抑制作用基本消失。以上结果说明，PMN不单是机体重要的防御细胞，负责吞噬和清除致病原及感染物，而且是机体重要的免疫调节细胞。通过细胞与细胞间的相互作用，对机体产生的TNF-α这一重要细胞因子起负调节作用。
van Dervort等曾报道NO供体SNP可增加PMN产生TNF-α，但对人单核细胞TNF-α生成无明显影响[9]。我们的实验结果关于NO对人单核细胞TNF-α生成的影响与van Derivort等的结果相似。但我们的结果表明，PMN并不产生TNF-α。由于van Derivort等的实验用常规方法分离PMN，其单核细胞污染率平均为1.4%[9]，几乎是本文所用方法的10倍，因此，他们所示PMN产生的TNF-α，有可能来源于污染的单核细胞，而NO增加其实验体系TNF-α的生成，很可能在于NO解除了PMN对单核细胞TNF-α生成的抑制作用。基于这样的假设，我们观察了内外源性NO对PMN抑制作用的影响。从我们的实验结果可见，NO并不增加PMN生成TNF-α，这进一步证实PMN并非TNF-α生成细胞。但是，内外源性NO对PMN抑制U937细胞生成TNF-α均无影响，其机理尚待深入探讨。
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既然机体过量产生TNF-α可引发感染性休克等严重的毒性作用，而PMN可随数量增加抑制单核细胞生成TNF-α，应有降低TNF-α所致毒性作用的可能。同时，PMN又能有效清除致病菌及其产生的毒素，因此，提高机体PMN数量可能对感染性休克的治疗产生有益的影响，这将为感染性休克的临床治疗提供新的思路。
(本研究得到美国国家卫生研究院 Robert L. Danner 教授的帮助和指导，特此致谢!)
* 国家自然科学基金(39670309)和卫生部科学基金资助
参考文献
1 Fong Y, Lowry SF. Tumor necrosis factor in the pathophysiology of infection and sepsis. Clin Immunol Immunopathol, 1990， 55:157.
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2 Glauser MP, Zanetti G, Baumgartner JD. et al. Septic shock pathogenesis. Lancet, 1991, 338:732.
3 Mohler KM, Sleath PR, Fitzner JN, et al. Protection against a lethal dose of endotoxin by an inhibitor of tumor necrosis factor processing. Nature, 1994, 370:218.
4 Dubravek DB, Spriggs DR, Mannick JA, et al. Circulating human peripheral blood, granulocytes synthesize and secrete tumor necrosis factor-α. Proc Nalt Acad Sci USA, 1990, 87:6758.
, 百拇医药
5 Djeu JY, Serbousek D, Bloanchard DK. Release of tumor necrosis factor by human polymorphonuclear leukocytes. Blood 1990， 76:1405.
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(1999年元月5日收稿，1999年3月24日修回), 百拇医药