99mTc 标记单克隆抗体Au14-1对荷宫颈癌小鼠的放射免疫显像研究
作者：徐方云 王红梅 邬淑云 温淦升 刘秋如 龚文华 张青 熊立跃
单位：徐方云 王红梅 邬淑云 温淦升 刘秋如 龚文华:江西医学院病理生理教研室肿瘤免疫研究室 (南昌 330006)张青 熊立跃:江西医学院附属一院核医学科
关键词：抗体；单克隆；宫颈肿瘤；放射免疫测定
中国病理生理杂志990915 摘 要 目的和方法：应用99mTc 直接法标记抗小鼠宫颈癌( U14)单克隆抗体 Au14-1,对荷瘤Km小鼠进行放射性分布和放射免疫显像的实验观察，探讨用99mTc-Au14-1作宫颈癌导向诊断和导向治疗的可能性。结果：(1)99mTc-Au14-1注射后12 h肿瘤灶已有放射性聚集，24 h肿瘤组织的%ID/g值达8.79,呈明显特异性浓聚；(2)除肾脏外，各脏器的T/NT值在2.02～6.71之间, SPECT 图像12h已见肿瘤显影，24 h肿瘤影像更为清晰。结论：99mTc-Au14-1的体内分布与显像结果相一致，表明 Au14-1在体内具有良好的宫颈癌导向定位作用。
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Radioimmunoimaging of 99m Tc labeled anti-mouse uterine cervical
cancer monoclonal antibody Au14-1 in tumor-bearing mice
XU Fang-Yun, WANG Hong-Mei, WU Shu-Yun, WEN Gan-Sheng,LIU Qiu-Ru,GONG Wen-Hua, ZHANG Qing, XIONG Li-Yue
Department of Pathophysiology and Tumor Immunological Labortory,Jiangxi Medical College, Nanchang (330006)
Abstract AIM and METHODS: A study of radioimmunoimaging was carried out on Kunming mice-uterine cervical cancer (U14) using 99m Tc labeled monoclonal Au14-1 with a modified Schwartz method. RESULTS: The bio-distribution showed that radioactivity accumulated in tumor tissue at 12h after 99m Tc-Au14-1 injection in tail vein. The uptake by tumor was 4.12 %ID/g at 2h and 8.79 %ID/g at 24h respectively. The tumor/non-tumor (T/NT) radioactivity ratios for organs except kidneys were ranged from 2.02 to 6.71 at 24h post-injection. The image of tumor showed at 12h and clearer at 24h after injection. CONCLUSION: The quality of tumor image was relevant to the T/NT radioactivity ratios. It was demonstrated that 99m Tc-Au14-1 has a good capability of localization for tumor.
, 百拇医药
MeSH Antibodies, monoclonal; Cervix neoplasms; Radioimmunoassay
近年来，放射免疫显像(radioimmunoimaging, RII )的研究发展迅速，国内外已有多种抗肿瘤单克隆抗体用于RII的临床试验[1,2]，但宫颈癌RII的研究尚未见报道。本室1984年成功制备抗小鼠宫颈癌( U14)单克隆抗体 Au14-1，并已证实[3]该单抗能与人宫颈癌组织HeLa细胞株表面抗原呈特异性结合，提示 Au14-1可能具有临床应用价值。本文采99mTc标记 Au14-1对荷宫颈癌的同基因型小鼠进行RII的实验研究，以探讨用 Au14-1作宫颈癌导向诊断和导向治疗的可能性。
材料与方法
, 百拇医药
(一) Au14-1的制备纯化： Michella[4]方法纯化含单抗腹水,SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度，琼脂扩散法证实为小鼠IgG1。对照抗体为抗血吸虫单克隆抗体M5(小鼠 IgG),由江西省寄生虫病研究所尹东副研究员惠赠，膜免疫荧光证明M5与U14细胞无特异性结合。分装后置-80℃冷藏备用。
(二) 小鼠宫颈癌模型的复制： U14细胞是由甲基胆蒽诱发的昆明种(Kunming, Km)小鼠宫颈未分化鳞状细胞癌，在本室已传代多年。近交系Km处女鼠12只，5～6周龄，体重18～22 g，由本院动物科学部提供。取U14细胞悬液(1×107个/mL) 0.2 mL接种于小鼠右前肢腋部皮下，8～10 d后小鼠肿瘤直径0.8～1.2 cm左右备用。
(三) 抗体标记：参考Schwartz方法[5 ，6]，作部分改良。取抗体400 μg，加入过量的2-巯基乙醇(2-ME )还原抗体(Au14-1或M5)，置室温下反应30 min。取含SnCl2的骨显像剂羟基亚甲基二磷酸盐(methylene diphosphonate,MDP )药盒1支(上海红旗制药厂)，用2 mL生理盐水稀释后，抽取40 μL加入还原抗体中，混匀后再注入新鲜淋洗的99mTcO4-370～440 mBq(1.5mL )，摇匀置室温下10 min。纸层析法测定标记率，展开剂为生理盐水，膜免疫荧光法检测标记前后Au14-1的免疫活性。抗体及试剂溶液均用微孔滤膜除菌过滤，标记过程严格按无菌操作规程进行。
, 百拇医药
(四) 放免显像及体内分布：荷瘤小鼠随机分成2组。实验组尾静脉注射99mTc-Au14-1，每鼠62.9 mBq，对照组注射等量99mTc-M5，注射标记抗体后分别于2 h、12 h、24 h用单光子发射型计算机断层摄像仪(SPECT ，Siemens JLC-3700型，)作连续平面显像,并于2 h、24 h两时点处死动物，采取血液、肿瘤组织及各重要脏器,滤纸吸干血液后称湿重，测定其放射性活度,由此计算瘤/非瘤组织放射性比值(T/NT)和单位重量摄取放射性活度的百分比(%ID/g)。
结果
(一) 标记抗体质量:抗体标记率为90～94%,放射性比活度82～97 mBq/mg蛋白膜免疫荧光法证实标记前后Au14-1免疫结合活性无明显改变。
(二) 99m Tc标记抗体的体内分布: 如表1、2所示。(1) 99m Tc-Au14-1注射后2 h，血、肿瘤的%ID/g值分别为4.51和4.12, 肿瘤组织无明显放射性浓聚,各脏器中,以肾、肝、脾的放射性为高；至24 h时,血液及各脏器组织的放射性逐渐降低, 肿瘤组织的放射性相对增高,其%ID/g值达8.79，而对照组肿瘤的%ID/g值仅为1.89，始终无放射性浓聚。(2) 各脏器不同时间T/NT值(见表2)表明:实验组各脏器T/NT值均高于对照组,并随时间延长而升高，除肾脏外，各脏器组织24 h T/NT值均在2.02～6.71 之间，瘤/血、瘤/肌肉的比值分别为 2.22和6.71; 对照组各脏器2 h、24 h的T/NT值均小于1.27。
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表1 99mTc-Au14-1和99mTc-M5在荷瘤小鼠体内的分布
Tab 1 Distribution of 99m Tc-Au14-1 and 99m Tc-M5 in tumor-bearing mice (%ID/g,
±s,n=3)
99m Tc-Au14-1
99m Tc-M5
2h
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24h
2h
24h
Blood
4.51±0.72
3.96±0.79
3.94±0.52
2.36±0.27
Heart
3.79±0.61
1.92±0.32
3.60±0.68
, 百拇医药
2.01±0.41
Lung
3.92±0.48
2.11±0.23
4.13±0.75
2.12±0.21
Liver
6.49±0.89
4.36±0.78
6.88±0.73
3.76±0.52
Spleen
, 百拇医药
4.92±0.63
3.06±0.41
4.98±0.92
2.97±0.31
Stomach
3.42±0.70
2.86±0.58
4.01±0.52
3.26±0.45
Kidney
8.15±1.12
6.59±1.01
, 百拇医药
9.13±1.17
4.39±0.47
Muscle
2.01±0.12
1.31±0.14
2.35±0.23
1.49±0.11
Tumor
4.12±0.68
8.79±0.94
2.99±0.36
1.89±0.20
, 百拇医药
表2 荷瘤小鼠各脏器组织的T/NT放射性比值
Tab 2 T/NT radioactivity ratios of various organs in tumor- bearing mice (
±s,n=3)
99m Tc-Au14-1
99m Tc-M5
2h
24h
2h
, http://www.100md.com
24h
Blood
0.91±0.25
2.22±0.32
0.76±0.13
0.80±0.18
Heart
1.09±0.19
4.58±0.48
0.83±0.26
0.94±0.12
Lung
, 百拇医药
1.05±0.22
4.17±0.52
0.72±0.21
0.89±0.15
Liver
0.63±0.32
2.02±0.29
0.44±0.19
0.50±0.07
Spleen
0.84±0.18
2.87±0.38
, 百拇医药
0.60±0.12
0.64±0.10
Stomach
1.21±0.24
3.07±0.28
0.74±0.09
0.58±0.11
Kidney
0.51±0.39
1.33±0.23
0.32±0.14
0.43±0.13
, 百拇医药
Muscle
2.05±0.39
6.71±0.69
1.27±0.19
1.27±0.15
T/NT: tumor/non-tumor
Fig 1 Radioimmunoimaging of 99m Tc-Au14-1 in tumor bearing mice after iv injection (the arrow indicates the tumor)
, http://www.100md.com
The tumor was not shown at 2h (A). Radioactivity was accumulated in tumor site as early as 12h, showing the tumor clear (B) and clearer at 24h (C)，while the higher backgroud radioactivity in abdomen was also shown
图1 99m Tc-Au14-1在荷瘤小鼠体内不同时间的放射免疫显影
(三) 显像结果: 实验组注射99mTc-Au14-1后2 h，放射性分布以腹部为高，可见甲状腺显影，但未见肿瘤显影，12 h后颈胸部放射性降低，肿瘤部位有较明显的放射性浓聚；随着放射性本底逐步降低, 24 h的肿瘤显像更为清晰，呈较高的放射性浓聚,但腹部放射性本底仍然较高(见图1)。对照组各时点均未见肿瘤显影。两组显像结果与其体内分布相一致。
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讨 论
依据宫颈细胞学和组织病理学检查可诊断宫颈癌原发灶,但对其转移灶与复发灶的诊断仍缺乏特异有效的方法。RII技术的发展有可能为临床宫颈癌的转移灶和复发灶的定位定性诊断提供新的手段。本室[3]曾以Au14-1为载体制备宫颈癌单抗-葡聚糖-氨甲喋呤偶合物用于体外抗肿瘤实验,结果证实该偶合物对人宫颈癌HeLa细胞有比小鼠宫颈癌 U14细胞更强的选择性细胞毒作用,提示 Au14-1能够导向定位于人宫颈癌细胞上。本文采用99mTc标记Au14-1作宫颈癌RII实验取得理想的结果,体内分布结果显示：99m Tc-Au14-1能够特异性地定位于肿瘤组织并产生较高的放射性浓聚, 24 h肿瘤组织%ID/g值达到8.79,分别是非瘤组织的3.96倍(血)和6.98倍(肌肉), 而对照组肿瘤的%ID/g值仅为 1.89 ,并无肿瘤部位的优势分布，表明99mTc-Au14-1在体内确有良好的导向作用。99mTc直接法标记单抗不仅方法简便实用，而且因其能量适中，特别适合显像，故已为国外普遍采用。我们采用直接法标记 Au14-1共3次,标记率均大于90%,免疫活性损伤小,用于显像均获成功。肿瘤12 h即有显影,至24 h时肿瘤影像更为清晰(见图1)。这提示99mTc-Au14-1很有可能成为临床宫颈癌RII的理想示踪剂。
, 百拇医药
参考文献
1 孙性善.我国肿瘤放射免疫显像临床研究概况和展望.实用肿瘤杂志, 1994,9(1):53.
2 Goldenberg DM. New development in MAbs for cancerdetection and therapy. Cancer J Clin, 1994,44:43.
3 Wu SY, Wen GS. Studies on monoclonal antibody Au14-1 and immunology of utervine cervical cancer. Chinese J Pathophysiol, 1997,13(4):437.
4 Michella MM, Andrew P. A simple, non-chromatophic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Meth, 1987,96:271 .
5 Schwartz A, Steinstraber A. A novel approach of 99m Tc labeled monoclonal antibody (Abstract). J Nucl Med, 1987,28:721.
6 Macher SJ, Ellison D. Reduction-mediated 99m Tc labeling of monoclonal antibodies. J Nucl Med, 1990,31:692.
(1998年5月20日收稿，1999年元月11日修回), 百拇医药
单位：徐方云 王红梅 邬淑云 温淦升 刘秋如 龚文华:江西医学院病理生理教研室肿瘤免疫研究室 (南昌 330006)张青 熊立跃:江西医学院附属一院核医学科
关键词：抗体；单克隆；宫颈肿瘤；放射免疫测定
中国病理生理杂志990915 摘 要 目的和方法：应用99mTc 直接法标记抗小鼠宫颈癌( U14)单克隆抗体 Au14-1,对荷瘤Km小鼠进行放射性分布和放射免疫显像的实验观察，探讨用99mTc-Au14-1作宫颈癌导向诊断和导向治疗的可能性。结果：(1)99mTc-Au14-1注射后12 h肿瘤灶已有放射性聚集，24 h肿瘤组织的%ID/g值达8.79,呈明显特异性浓聚；(2)除肾脏外，各脏器的T/NT值在2.02～6.71之间, SPECT 图像12h已见肿瘤显影，24 h肿瘤影像更为清晰。结论：99mTc-Au14-1的体内分布与显像结果相一致，表明 Au14-1在体内具有良好的宫颈癌导向定位作用。
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Radioimmunoimaging of 99m Tc labeled anti-mouse uterine cervical
cancer monoclonal antibody Au14-1 in tumor-bearing mice
XU Fang-Yun, WANG Hong-Mei, WU Shu-Yun, WEN Gan-Sheng,LIU Qiu-Ru,GONG Wen-Hua, ZHANG Qing, XIONG Li-Yue
Department of Pathophysiology and Tumor Immunological Labortory,Jiangxi Medical College, Nanchang (330006)
Abstract AIM and METHODS: A study of radioimmunoimaging was carried out on Kunming mice-uterine cervical cancer (U14) using 99m Tc labeled monoclonal Au14-1 with a modified Schwartz method. RESULTS: The bio-distribution showed that radioactivity accumulated in tumor tissue at 12h after 99m Tc-Au14-1 injection in tail vein. The uptake by tumor was 4.12 %ID/g at 2h and 8.79 %ID/g at 24h respectively. The tumor/non-tumor (T/NT) radioactivity ratios for organs except kidneys were ranged from 2.02 to 6.71 at 24h post-injection. The image of tumor showed at 12h and clearer at 24h after injection. CONCLUSION: The quality of tumor image was relevant to the T/NT radioactivity ratios. It was demonstrated that 99m Tc-Au14-1 has a good capability of localization for tumor.
, 百拇医药
MeSH Antibodies, monoclonal; Cervix neoplasms; Radioimmunoassay
近年来，放射免疫显像(radioimmunoimaging, RII )的研究发展迅速，国内外已有多种抗肿瘤单克隆抗体用于RII的临床试验[1,2]，但宫颈癌RII的研究尚未见报道。本室1984年成功制备抗小鼠宫颈癌( U14)单克隆抗体 Au14-1，并已证实[3]该单抗能与人宫颈癌组织HeLa细胞株表面抗原呈特异性结合，提示 Au14-1可能具有临床应用价值。本文采99mTc标记 Au14-1对荷宫颈癌的同基因型小鼠进行RII的实验研究，以探讨用 Au14-1作宫颈癌导向诊断和导向治疗的可能性。
材料与方法
, 百拇医药
(一) Au14-1的制备纯化： Michella[4]方法纯化含单抗腹水,SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度，琼脂扩散法证实为小鼠IgG1。对照抗体为抗血吸虫单克隆抗体M5(小鼠 IgG),由江西省寄生虫病研究所尹东副研究员惠赠，膜免疫荧光证明M5与U14细胞无特异性结合。分装后置-80℃冷藏备用。
(二) 小鼠宫颈癌模型的复制： U14细胞是由甲基胆蒽诱发的昆明种(Kunming, Km)小鼠宫颈未分化鳞状细胞癌，在本室已传代多年。近交系Km处女鼠12只，5～6周龄，体重18～22 g，由本院动物科学部提供。取U14细胞悬液(1×107个/mL) 0.2 mL接种于小鼠右前肢腋部皮下，8～10 d后小鼠肿瘤直径0.8～1.2 cm左右备用。
(三) 抗体标记：参考Schwartz方法[5 ，6]，作部分改良。取抗体400 μg，加入过量的2-巯基乙醇(2-ME )还原抗体(Au14-1或M5)，置室温下反应30 min。取含SnCl2的骨显像剂羟基亚甲基二磷酸盐(methylene diphosphonate,MDP )药盒1支(上海红旗制药厂)，用2 mL生理盐水稀释后，抽取40 μL加入还原抗体中，混匀后再注入新鲜淋洗的99mTcO4-370～440 mBq(1.5mL )，摇匀置室温下10 min。纸层析法测定标记率，展开剂为生理盐水，膜免疫荧光法检测标记前后Au14-1的免疫活性。抗体及试剂溶液均用微孔滤膜除菌过滤，标记过程严格按无菌操作规程进行。
, 百拇医药
(四) 放免显像及体内分布：荷瘤小鼠随机分成2组。实验组尾静脉注射99mTc-Au14-1，每鼠62.9 mBq，对照组注射等量99mTc-M5，注射标记抗体后分别于2 h、12 h、24 h用单光子发射型计算机断层摄像仪(SPECT ，Siemens JLC-3700型，)作连续平面显像,并于2 h、24 h两时点处死动物，采取血液、肿瘤组织及各重要脏器,滤纸吸干血液后称湿重，测定其放射性活度,由此计算瘤/非瘤组织放射性比值(T/NT)和单位重量摄取放射性活度的百分比(%ID/g)。
结果
(一) 标记抗体质量:抗体标记率为90～94%,放射性比活度82～97 mBq/mg蛋白膜免疫荧光法证实标记前后Au14-1免疫结合活性无明显改变。
(二) 99m Tc标记抗体的体内分布: 如表1、2所示。(1) 99m Tc-Au14-1注射后2 h，血、肿瘤的%ID/g值分别为4.51和4.12, 肿瘤组织无明显放射性浓聚,各脏器中,以肾、肝、脾的放射性为高；至24 h时,血液及各脏器组织的放射性逐渐降低, 肿瘤组织的放射性相对增高,其%ID/g值达8.79，而对照组肿瘤的%ID/g值仅为1.89，始终无放射性浓聚。(2) 各脏器不同时间T/NT值(见表2)表明:实验组各脏器T/NT值均高于对照组,并随时间延长而升高，除肾脏外，各脏器组织24 h T/NT值均在2.02～6.71 之间，瘤/血、瘤/肌肉的比值分别为 2.22和6.71; 对照组各脏器2 h、24 h的T/NT值均小于1.27。
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表1 99mTc-Au14-1和99mTc-M5在荷瘤小鼠体内的分布
Tab 1 Distribution of 99m Tc-Au14-1 and 99m Tc-M5 in tumor-bearing mice (%ID/g,
±s,n=3)99m Tc-Au14-1
99m Tc-M5
2h
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24h
2h
24h
Blood
4.51±0.72
3.96±0.79
3.94±0.52
2.36±0.27
Heart
3.79±0.61
1.92±0.32
3.60±0.68
, 百拇医药
2.01±0.41
Lung
3.92±0.48
2.11±0.23
4.13±0.75
2.12±0.21
Liver
6.49±0.89
4.36±0.78
6.88±0.73
3.76±0.52
Spleen
, 百拇医药
4.92±0.63
3.06±0.41
4.98±0.92
2.97±0.31
Stomach
3.42±0.70
2.86±0.58
4.01±0.52
3.26±0.45
Kidney
8.15±1.12
6.59±1.01
, 百拇医药
9.13±1.17
4.39±0.47
Muscle
2.01±0.12
1.31±0.14
2.35±0.23
1.49±0.11
Tumor
4.12±0.68
8.79±0.94
2.99±0.36
1.89±0.20
, 百拇医药
表2 荷瘤小鼠各脏器组织的T/NT放射性比值
Tab 2 T/NT radioactivity ratios of various organs in tumor- bearing mice (
±s,n=3)99m Tc-Au14-1
99m Tc-M5
2h
24h
2h
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24h
Blood
0.91±0.25
2.22±0.32
0.76±0.13
0.80±0.18
Heart
1.09±0.19
4.58±0.48
0.83±0.26
0.94±0.12
Lung
, 百拇医药
1.05±0.22
4.17±0.52
0.72±0.21
0.89±0.15
Liver
0.63±0.32
2.02±0.29
0.44±0.19
0.50±0.07
Spleen
0.84±0.18
2.87±0.38
, 百拇医药
0.60±0.12
0.64±0.10
Stomach
1.21±0.24
3.07±0.28
0.74±0.09
0.58±0.11
Kidney
0.51±0.39
1.33±0.23
0.32±0.14
0.43±0.13
, 百拇医药
Muscle
2.05±0.39
6.71±0.69
1.27±0.19
1.27±0.15
T/NT: tumor/non-tumor
Fig 1 Radioimmunoimaging of 99m Tc-Au14-1 in tumor bearing mice after iv injection (the arrow indicates the tumor)
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The tumor was not shown at 2h (A). Radioactivity was accumulated in tumor site as early as 12h, showing the tumor clear (B) and clearer at 24h (C)，while the higher backgroud radioactivity in abdomen was also shown
图1 99m Tc-Au14-1在荷瘤小鼠体内不同时间的放射免疫显影
(三) 显像结果: 实验组注射99mTc-Au14-1后2 h，放射性分布以腹部为高，可见甲状腺显影，但未见肿瘤显影，12 h后颈胸部放射性降低，肿瘤部位有较明显的放射性浓聚；随着放射性本底逐步降低, 24 h的肿瘤显像更为清晰，呈较高的放射性浓聚,但腹部放射性本底仍然较高(见图1)。对照组各时点均未见肿瘤显影。两组显像结果与其体内分布相一致。
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讨 论
依据宫颈细胞学和组织病理学检查可诊断宫颈癌原发灶,但对其转移灶与复发灶的诊断仍缺乏特异有效的方法。RII技术的发展有可能为临床宫颈癌的转移灶和复发灶的定位定性诊断提供新的手段。本室[3]曾以Au14-1为载体制备宫颈癌单抗-葡聚糖-氨甲喋呤偶合物用于体外抗肿瘤实验,结果证实该偶合物对人宫颈癌HeLa细胞有比小鼠宫颈癌 U14细胞更强的选择性细胞毒作用,提示 Au14-1能够导向定位于人宫颈癌细胞上。本文采用99mTc标记Au14-1作宫颈癌RII实验取得理想的结果,体内分布结果显示：99m Tc-Au14-1能够特异性地定位于肿瘤组织并产生较高的放射性浓聚, 24 h肿瘤组织%ID/g值达到8.79,分别是非瘤组织的3.96倍(血)和6.98倍(肌肉), 而对照组肿瘤的%ID/g值仅为 1.89 ,并无肿瘤部位的优势分布，表明99mTc-Au14-1在体内确有良好的导向作用。99mTc直接法标记单抗不仅方法简便实用，而且因其能量适中，特别适合显像，故已为国外普遍采用。我们采用直接法标记 Au14-1共3次,标记率均大于90%,免疫活性损伤小,用于显像均获成功。肿瘤12 h即有显影,至24 h时肿瘤影像更为清晰(见图1)。这提示99mTc-Au14-1很有可能成为临床宫颈癌RII的理想示踪剂。
, 百拇医药
参考文献
1 孙性善.我国肿瘤放射免疫显像临床研究概况和展望.实用肿瘤杂志, 1994,9(1):53.
2 Goldenberg DM. New development in MAbs for cancerdetection and therapy. Cancer J Clin, 1994,44:43.
3 Wu SY, Wen GS. Studies on monoclonal antibody Au14-1 and immunology of utervine cervical cancer. Chinese J Pathophysiol, 1997,13(4):437.
4 Michella MM, Andrew P. A simple, non-chromatophic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Meth, 1987,96:271 .
5 Schwartz A, Steinstraber A. A novel approach of 99m Tc labeled monoclonal antibody (Abstract). J Nucl Med, 1987,28:721.
6 Macher SJ, Ellison D. Reduction-mediated 99m Tc labeling of monoclonal antibodies. J Nucl Med, 1990,31:692.
(1998年5月20日收稿，1999年元月11日修回), 百拇医药