NH＋4对星状胶质细胞谷氨酰胺代谢的影响 李夏青 韩德五 赵元昌 许瑞龄 马学惠
作者：
单位：山西医科大学病理生理教研室(太原030001)
关键词：氨；星形细胞；谷氨酰胺
NH 摘 要 目的：了解体外培养状态下，NH+4对脑星状胶质细胞谷氨酰胺代谢的影响。方法：将不同浓度NH4Cl加入培养液作用不同时间，分别收集细胞及上清进行测定。结果：NH+4作用后，星状胶质细胞谷氨酰胺合成酶活性增加、细胞内及上清液内谷氨酰胺含量增加，且在一定程度上随着NH+4氨的浓度的增大而增加。然而，当NH+4作用时间达到一定时限(72 h)后，酶的活性及细胞内谷氨酰胺的量不再增加，甚至有所下降或减少。结论：星状胶质细胞积极参与NH3(NH3NH+4)的代谢。然而，过高浓度的NH+4作用可影响星状胶质细胞功能，使其对NH+4的解毒能力下降。
, 百拇医药
The effect of ammonia on glutamine metabolism of cultured astrocytes
LI Xia-Qing, HAN De-Wu, ZHAO Yuan-Chang, XU Rui-Ling， MA Xue-Hui
Department of Pathophysiology, Shanxi Medical University， Taiyuan (030001)
Abstract AIM: Ammonia(NH4Cl) on glutamine metabolism in cultured astrocytes of three-days-old Wistar rats were investigated in vitro. METHODS:Cultures were treated by NH4Cl with different concentration for various time periods. RESULTS: There was an obvious increase in glutamine synthetase activity and glutamine content in astrocytes under hyperammonemia. These increases were related to both ammonia concentration and time of ammonia administration. But little increase was found after ammonia incubation were prolonged to 72 h or ammonia concentration were heightened to 10 mmol/L. CONCLUSIONS: Astrocytes exhibit active changes in glutamine metabolism after beginning of ammonia exposure. However, the glutamine synthetic metabolism may be injured following a prolonged ammonia incubation or increase of ammonia dose, which means that the detoxification ability of astrocyte towards ammonia was reduced.
, 百拇医药
MeSH Ammonia; Astrocytes; Glutamine
生理条件下，体内98%～99%的NH3(氨) 均是以NH+4的形式存在的。因此，大部分体外实验中，常采用氯化铵(NH4Cl)或醋酸铵(NH4Ac)代替NH3(氨)[1,2]。
NH3与肝性脑病的关系一直是人们研究的热题。据文献报道，脑星状胶质细胞是NH3在中枢的主要解毒场所[3]。在星状胶质细胞内，NH3与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化下形成谷氨酰胺而解毒。然而，近年来有人认为，NH3在体内的代谢中间产物谷氨酰胺对高NH3血症时肝性脑病的发生发展及脑水肿的出现都可能具有十分重要的意义[4,5]。但是，究竟高NH3环境下星状胶质细胞的代谢状况如何却了解甚少。故本文用体外培养之方法观察高NH3对星状胶质细胞谷氨酰胺代谢的影响。
, 百拇医药
材料与方法
(一)星状胶质细胞培养：参照Kim等的方法，并略作改动[6]。大致步骤如下：取1～2 d龄Wistar乳鼠大脑(去除脑干)置冰冷的无菌Hanks液内洗涤2～3次，小心剥去表面脑膜及血管，剪碎成糊状，加入适量0.25%胰蛋白酶液，37℃消化10 min。用冰冷的DMEM液(内含10%新生牛血清、NaHCO3 1.3 g/L、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL、Hepes 15 mmol/L，pH 7.3)终止消化。离心后弃去上清，再加入适量DMEM液，用吸管轻轻吹散细胞，75 μm不锈钢滤网过滤，离心(1000 r/min，3 min)，弃去上清。沉淀用DMEM重新悬浮。苔盼蓝染色细胞存活率为95%以上时，调整细胞浓度至1×106/mL，接种入预先铺被胶原的50 mm玻璃培养皿内，每个培养皿放2 mL，置5%CO2孵箱内(37℃)培养。培养第3周时进行实验。
, 百拇医药
星状胶质细胞的鉴定采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色[6]。细胞培养至3周时，95%以上皆为GFAP染色阳性细胞。
(二)实验过程：细胞培养至第3周，向培养液内加入NH4Cl造成高NH+4环境。NH+4的浓度分别为2.5 mmol/L、5 mmol/L及10 mmol/L; NH+4作用的时间分别定为24 h、48 h及72 h。在加入NH+4后的规定时间分别收集细胞及上清，测定：1.细胞内谷氨酰胺含量(mg/mg pro)； 2.培养上清液内谷氨酰胺含量(mg/100 mL)；3.细胞内谷氨酰胺合成酶的活性(μmol/mg pro.h-1)。谷氨酰胺测定采用酚-次氯酸法[7 ]。谷氨酰胺合成酶测定参照Chao等的方法进行[8]。蛋白测定采用Lowry法。
, 百拇医药
(三)统计处理：采用方差分析、q检验。数据以均数±标准差(x±s)表示。
结果
(一) 细胞内谷氨酰胺合成酶活性：当培养液内加入NH4Cl(2.5 mmol/L)后24 h，细胞内谷氨酰胺合成酶活性增加；增加NH+的浓度时，酶活性呈增高趋势，但数值间的差异无显著；固定同一NH+4的浓度，延长其作用时间时，则不论NH+4的浓度如何，细胞内酶的活性在NH+4的作用到一定时限后不再增加，并且接近正常水平(图1)。
(二)细胞及培养上清液内谷氨酰胺含量：NH+4(2.5 mmol/L)作用24 h后，培养液内谷氨酰胺含量明显增加，并随着NH+4浓度的增加而递增；当固定同一NH+4的浓度，只延长其作用时间时，培养液内谷氨酰胺含量在24、48 h呈增加趋势(但P>0.05);NH+4作用时间达到72 h后，谷氨酰胺的含量不再增加(表1)。
, 百拇医药
表1 氨对星状胶质细胞谷氨酰胺合成量的影响
Tab 1 The effect of ammonia with different concentration on glutamine content of astrocyte (x±s,n=6)
Concentration of ammonia
(mmol/L)
Glutamine content of astrocytes after various time of ammonia administration(mg/mg pro)
24h
48h
72h
, 百拇医药
Control
30.6±12.8
30.4±12.8
30.4±12.8
2.5
53.7±8.3*
45.4±2.9*
44.5±13.2*
5.0
65.8±14.8*
69.4±5.9*
, 百拇医药
77.9±13.1*
10.0
78.1±14.1*
78.7±19.9*
86.7±16.3*
* P<0.01, vs control 表 2 氨对胶质细胞培养上清液内谷氨酰胺含量的影响
Tab 2 The change of glutamine in culture medium after ammonia administration (x±s,n=6)
Concentration of
, 百拇医药
ammonia(mmol/L)
Glutamine content of culture medium after ammonia administration(mg/100 mL)
24h
48h
72h
Control
45.8±17.8
45.8±17.8
45.8±17.8
2.5
163.5±26.4*
, http://www.100md.com
174.4±41.8*
169.2±22.1*
5.0
214.8±31.5*
249.6±40.1*
144.7±16.4*
10.0
367.1±56.8*△
449.4±89.8*△
312.4±38.4#△#
*P<0.01, vs controls; △P<0.05, vs ammonia “2.5 and 5 mmol/L”;#P<0.05, vs ammonia “48h”
, 百拇医药
Fig 1 The changes of astrocytes glutamine synthetase (GS) activity after different time of amamonium treatment (x±s)
*P<0.05, vs control 图1 氨作用不同时间星状胶质细胞谷氨酰胺合成酶活性变化
加入不同浓度的NH4Cl后24 h，星状胶质细胞内谷氨酰胺含量总体上来看是增加的。但是，当固定同一NH4+的浓度、延长NH+4的作用时间或固定同一NH+4的作用时间、增加NH+4的浓度时，谷氨酰胺的增加无显著差异(P>0.05),见表2。
讨论
, 百拇医药
谷氨酰胺作为NH3
NH3(NH+4)在中枢的代谢中间产物在肝性脑病发生机制中的作用已日渐引起重视[4～6]。谷氨酰胺一方面作为氨在中枢的代谢终产物存在，另一方面又是神经细胞用来合成谷氨酸、γ-氨基丁酸及天门冬氨酸等神经递质的前体物质[9,10]。这些神经递质在释放后，须由星状胶质细胞摄取合成谷氨酰胺，再将其转运到神经细胞进行分解转化后才能被重新利用，因此，谷氨酰胺是神经细胞与星状细胞存在的谷氨酸-谷氨酰胺环中的重要中间产物。
本实验结果表明：一定程度高NH+4环境下，星状胶质细胞积极参与NH+4的解毒代谢。因此，高NH+4时，细胞内外谷氨酰胺含量确有显著增加，这种增加在一定程度上与谷氨酰胺合成酶活性增加有关。然而，当NH+4的作用时间达到一定时间后，谷氨酰胺合成酶活性可能因星状胶质细胞本身发生中毒而降低，此时，星状胶质细胞谷氨酰胺的合成将不再增加甚至由于谷氨酰胺的移出而减少。另外，当NH+4 的作用达到一定时间或一定程度时，在星状胶质细胞发生中毒的同时，不能排除神经细胞也发生中毒的可能，此时，神经细胞的谷氨酰胺酶被抑制，谷氨酰胺的利用减少，大量的谷氨酰胺在脑内蓄积。已经有人发现，高NH3环境下谷氨酰胺的分解利用减少[10]。谷氨酰胺被认为具有渗透分子作用，细胞内谷氨酰胺含量增加可继发细胞内水分的积聚引起细胞水肿[4]。另外谷氨酰胺本身是一种生理惰性物质，在脑内堆积过多也可直接影响脑细胞功能。再则，当脑内谷氨酰胺增多时，谷氨酰胺可由血脑屏障逸出，同时使大量的芳香族氨基酸被转运入脑，在脑内进一步转化成为假性神经递质及抑制性神经递质。因此，高NH3血症时星状胶质细胞的代偿性代谢改变可能是脑内谷氨酰胺蓄积的原因之一。
, 百拇医药
由于体外实验所采用的NH3浓度是依据文献所提示的人或动物发生肝性脑病时常出现的脑NH3浓度而确定的[1]，且观察时间较短，在此种条件下星状胶质细胞所出现的谷氨酰胺代谢变化是否真正反映肝性脑病时脑内谷氨酰胺的代谢状况还有待于进一步探讨。
参考文献
1 Szerb JC, Butterworth RF. Effect of ammonium ions on synaptic transminssion in the mammalian central nervous system. Prog Neurobiol, 1991,39:135.
2 Gregorios JB, Mozes LW, Norenberg LOB, et al. Morphologic effects of ammonia on primary astrocyte cultures. I. Light microscopic studies. J Neurobiol Exp Neurol, 1985,44:397.
, http://www.100md.com
3 Norrenberg MD, Martinez-Hermandez A. Fine structural localization of glutamine synthetase in astrocytes of rat brain. Brain Res, 1979,161:303.
4 Hawkins RA, Jessy AM, Mans AM, et al. Effect of reducing brain glutamine synthesis on metabolic symptoms of hepatic encephalopathy. J Neurochem, 1993,60:1000.
5 Takahashi H, Koehler RC, Brusilow SW, et al. Inhibition of brain glutamine accumulation prevents cerebral edema in hyperammonemia rats. J Am Physiol, 1991,261:H825.
, 百拇医药
6 Hawkins RA, Jessy J. Hyperammonemia dose not impair brain function in the absence of net glutamine synthesis. Biochem J, 1991,277:697.
7 Benjamin TH, Hamlin EM， Reynolds TB. Glutamine as a measure of hepatic encephalopathy. Arch Intern Med, 1971,127:1033.
8 Chao CC, Hu SX, Tsang M, et al. Effects of transforming growth factor-β on murine astrocyte glutamine synthetase activity. J Clin Invest, 1992, 90:1786.
, 百拇医药
9 Benjamin AM. Control of glutaminase activity in rat brain cortex in vitro: influence of glutamate, phosphate, ammonium, calcium and hydrogen ions. Brain Res, 1981,208:363.
10 Mathson DF, van Den Berg CJ. Ammonia and brain glutamine: inhibition of glutamine degradation by ammonia. Biochem Soc Trans, 1975,3:525.
(1998年3月30日收稿，1999年元月14日修回), 百拇医药
单位：山西医科大学病理生理教研室(太原030001)
关键词：氨；星形细胞；谷氨酰胺
NH 摘 要 目的：了解体外培养状态下，NH+4对脑星状胶质细胞谷氨酰胺代谢的影响。方法：将不同浓度NH4Cl加入培养液作用不同时间，分别收集细胞及上清进行测定。结果：NH+4作用后，星状胶质细胞谷氨酰胺合成酶活性增加、细胞内及上清液内谷氨酰胺含量增加，且在一定程度上随着NH+4氨的浓度的增大而增加。然而，当NH+4作用时间达到一定时限(72 h)后，酶的活性及细胞内谷氨酰胺的量不再增加，甚至有所下降或减少。结论：星状胶质细胞积极参与NH3(NH3NH+4)的代谢。然而，过高浓度的NH+4作用可影响星状胶质细胞功能，使其对NH+4的解毒能力下降。
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The effect of ammonia on glutamine metabolism of cultured astrocytes
LI Xia-Qing, HAN De-Wu, ZHAO Yuan-Chang, XU Rui-Ling， MA Xue-Hui
Department of Pathophysiology, Shanxi Medical University， Taiyuan (030001)
Abstract AIM: Ammonia(NH4Cl) on glutamine metabolism in cultured astrocytes of three-days-old Wistar rats were investigated in vitro. METHODS:Cultures were treated by NH4Cl with different concentration for various time periods. RESULTS: There was an obvious increase in glutamine synthetase activity and glutamine content in astrocytes under hyperammonemia. These increases were related to both ammonia concentration and time of ammonia administration. But little increase was found after ammonia incubation were prolonged to 72 h or ammonia concentration were heightened to 10 mmol/L. CONCLUSIONS: Astrocytes exhibit active changes in glutamine metabolism after beginning of ammonia exposure. However, the glutamine synthetic metabolism may be injured following a prolonged ammonia incubation or increase of ammonia dose, which means that the detoxification ability of astrocyte towards ammonia was reduced.
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MeSH Ammonia; Astrocytes; Glutamine
生理条件下，体内98%～99%的NH3(氨) 均是以NH+4的形式存在的。因此，大部分体外实验中，常采用氯化铵(NH4Cl)或醋酸铵(NH4Ac)代替NH3(氨)[1,2]。
NH3与肝性脑病的关系一直是人们研究的热题。据文献报道，脑星状胶质细胞是NH3在中枢的主要解毒场所[3]。在星状胶质细胞内，NH3与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化下形成谷氨酰胺而解毒。然而，近年来有人认为，NH3在体内的代谢中间产物谷氨酰胺对高NH3血症时肝性脑病的发生发展及脑水肿的出现都可能具有十分重要的意义[4,5]。但是，究竟高NH3环境下星状胶质细胞的代谢状况如何却了解甚少。故本文用体外培养之方法观察高NH3对星状胶质细胞谷氨酰胺代谢的影响。
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材料与方法
(一)星状胶质细胞培养：参照Kim等的方法，并略作改动[6]。大致步骤如下：取1～2 d龄Wistar乳鼠大脑(去除脑干)置冰冷的无菌Hanks液内洗涤2～3次，小心剥去表面脑膜及血管，剪碎成糊状，加入适量0.25%胰蛋白酶液，37℃消化10 min。用冰冷的DMEM液(内含10%新生牛血清、NaHCO3 1.3 g/L、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL、Hepes 15 mmol/L，pH 7.3)终止消化。离心后弃去上清，再加入适量DMEM液，用吸管轻轻吹散细胞，75 μm不锈钢滤网过滤，离心(1000 r/min，3 min)，弃去上清。沉淀用DMEM重新悬浮。苔盼蓝染色细胞存活率为95%以上时，调整细胞浓度至1×106/mL，接种入预先铺被胶原的50 mm玻璃培养皿内，每个培养皿放2 mL，置5%CO2孵箱内(37℃)培养。培养第3周时进行实验。
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星状胶质细胞的鉴定采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色[6]。细胞培养至3周时，95%以上皆为GFAP染色阳性细胞。
(二)实验过程：细胞培养至第3周，向培养液内加入NH4Cl造成高NH+4环境。NH+4的浓度分别为2.5 mmol/L、5 mmol/L及10 mmol/L; NH+4作用的时间分别定为24 h、48 h及72 h。在加入NH+4后的规定时间分别收集细胞及上清，测定：1.细胞内谷氨酰胺含量(mg/mg pro)； 2.培养上清液内谷氨酰胺含量(mg/100 mL)；3.细胞内谷氨酰胺合成酶的活性(μmol/mg pro.h-1)。谷氨酰胺测定采用酚-次氯酸法[7 ]。谷氨酰胺合成酶测定参照Chao等的方法进行[8]。蛋白测定采用Lowry法。
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(三)统计处理：采用方差分析、q检验。数据以均数±标准差(x±s)表示。
结果
(一) 细胞内谷氨酰胺合成酶活性：当培养液内加入NH4Cl(2.5 mmol/L)后24 h，细胞内谷氨酰胺合成酶活性增加；增加NH+的浓度时，酶活性呈增高趋势，但数值间的差异无显著；固定同一NH+4的浓度，延长其作用时间时，则不论NH+4的浓度如何，细胞内酶的活性在NH+4的作用到一定时限后不再增加，并且接近正常水平(图1)。
(二)细胞及培养上清液内谷氨酰胺含量：NH+4(2.5 mmol/L)作用24 h后，培养液内谷氨酰胺含量明显增加，并随着NH+4浓度的增加而递增；当固定同一NH+4的浓度，只延长其作用时间时，培养液内谷氨酰胺含量在24、48 h呈增加趋势(但P>0.05);NH+4作用时间达到72 h后，谷氨酰胺的含量不再增加(表1)。
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表1 氨对星状胶质细胞谷氨酰胺合成量的影响
Tab 1 The effect of ammonia with different concentration on glutamine content of astrocyte (x±s,n=6)
Concentration of ammonia
(mmol/L)
Glutamine content of astrocytes after various time of ammonia administration(mg/mg pro)
24h
48h
72h
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Control
30.6±12.8
30.4±12.8
30.4±12.8
2.5
53.7±8.3*
45.4±2.9*
44.5±13.2*
5.0
65.8±14.8*
69.4±5.9*
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77.9±13.1*
10.0
78.1±14.1*
78.7±19.9*
86.7±16.3*
* P<0.01, vs control 表 2 氨对胶质细胞培养上清液内谷氨酰胺含量的影响
Tab 2 The change of glutamine in culture medium after ammonia administration (x±s,n=6)
Concentration of
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ammonia(mmol/L)
Glutamine content of culture medium after ammonia administration(mg/100 mL)
24h
48h
72h
Control
45.8±17.8
45.8±17.8
45.8±17.8
2.5
163.5±26.4*
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174.4±41.8*
169.2±22.1*
5.0
214.8±31.5*
249.6±40.1*
144.7±16.4*
10.0
367.1±56.8*△
449.4±89.8*△
312.4±38.4#△#
*P<0.01, vs controls; △P<0.05, vs ammonia “2.5 and 5 mmol/L”;#P<0.05, vs ammonia “48h”
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Fig 1 The changes of astrocytes glutamine synthetase (GS) activity after different time of amamonium treatment (x±s)
*P<0.05, vs control 图1 氨作用不同时间星状胶质细胞谷氨酰胺合成酶活性变化
加入不同浓度的NH4Cl后24 h，星状胶质细胞内谷氨酰胺含量总体上来看是增加的。但是，当固定同一NH4+的浓度、延长NH+4的作用时间或固定同一NH+4的作用时间、增加NH+4的浓度时，谷氨酰胺的增加无显著差异(P>0.05),见表2。
讨论
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谷氨酰胺作为NH3
NH3(NH+4)在中枢的代谢中间产物在肝性脑病发生机制中的作用已日渐引起重视[4～6]。谷氨酰胺一方面作为氨在中枢的代谢终产物存在，另一方面又是神经细胞用来合成谷氨酸、γ-氨基丁酸及天门冬氨酸等神经递质的前体物质[9,10]。这些神经递质在释放后，须由星状胶质细胞摄取合成谷氨酰胺，再将其转运到神经细胞进行分解转化后才能被重新利用，因此，谷氨酰胺是神经细胞与星状细胞存在的谷氨酸-谷氨酰胺环中的重要中间产物。本实验结果表明：一定程度高NH+4环境下，星状胶质细胞积极参与NH+4的解毒代谢。因此，高NH+4时，细胞内外谷氨酰胺含量确有显著增加，这种增加在一定程度上与谷氨酰胺合成酶活性增加有关。然而，当NH+4的作用时间达到一定时间后，谷氨酰胺合成酶活性可能因星状胶质细胞本身发生中毒而降低，此时，星状胶质细胞谷氨酰胺的合成将不再增加甚至由于谷氨酰胺的移出而减少。另外，当NH+4 的作用达到一定时间或一定程度时，在星状胶质细胞发生中毒的同时，不能排除神经细胞也发生中毒的可能，此时，神经细胞的谷氨酰胺酶被抑制，谷氨酰胺的利用减少，大量的谷氨酰胺在脑内蓄积。已经有人发现，高NH3环境下谷氨酰胺的分解利用减少[10]。谷氨酰胺被认为具有渗透分子作用，细胞内谷氨酰胺含量增加可继发细胞内水分的积聚引起细胞水肿[4]。另外谷氨酰胺本身是一种生理惰性物质，在脑内堆积过多也可直接影响脑细胞功能。再则，当脑内谷氨酰胺增多时，谷氨酰胺可由血脑屏障逸出，同时使大量的芳香族氨基酸被转运入脑，在脑内进一步转化成为假性神经递质及抑制性神经递质。因此，高NH3血症时星状胶质细胞的代偿性代谢改变可能是脑内谷氨酰胺蓄积的原因之一。
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由于体外实验所采用的NH3浓度是依据文献所提示的人或动物发生肝性脑病时常出现的脑NH3浓度而确定的[1]，且观察时间较短，在此种条件下星状胶质细胞所出现的谷氨酰胺代谢变化是否真正反映肝性脑病时脑内谷氨酰胺的代谢状况还有待于进一步探讨。
参考文献
1 Szerb JC, Butterworth RF. Effect of ammonium ions on synaptic transminssion in the mammalian central nervous system. Prog Neurobiol, 1991,39:135.
2 Gregorios JB, Mozes LW, Norenberg LOB, et al. Morphologic effects of ammonia on primary astrocyte cultures. I. Light microscopic studies. J Neurobiol Exp Neurol, 1985,44:397.
, http://www.100md.com
3 Norrenberg MD, Martinez-Hermandez A. Fine structural localization of glutamine synthetase in astrocytes of rat brain. Brain Res, 1979,161:303.
4 Hawkins RA, Jessy AM, Mans AM, et al. Effect of reducing brain glutamine synthesis on metabolic symptoms of hepatic encephalopathy. J Neurochem, 1993,60:1000.
5 Takahashi H, Koehler RC, Brusilow SW, et al. Inhibition of brain glutamine accumulation prevents cerebral edema in hyperammonemia rats. J Am Physiol, 1991,261:H825.
, 百拇医药
6 Hawkins RA, Jessy J. Hyperammonemia dose not impair brain function in the absence of net glutamine synthesis. Biochem J, 1991,277:697.
7 Benjamin TH, Hamlin EM， Reynolds TB. Glutamine as a measure of hepatic encephalopathy. Arch Intern Med, 1971,127:1033.
8 Chao CC, Hu SX, Tsang M, et al. Effects of transforming growth factor-β on murine astrocyte glutamine synthetase activity. J Clin Invest, 1992, 90:1786.
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9 Benjamin AM. Control of glutaminase activity in rat brain cortex in vitro: influence of glutamate, phosphate, ammonium, calcium and hydrogen ions. Brain Res, 1981,208:363.
10 Mathson DF, van Den Berg CJ. Ammonia and brain glutamine: inhibition of glutamine degradation by ammonia. Biochem Soc Trans, 1975,3:525.
(1998年3月30日收稿，1999年元月14日修回), 百拇医药