两步进样法克服高盐浓度对小分子物质分析的影响
作者：程明刚 黎玉坚 梁统 周克元 凌光鑫
单位：程明刚(深圳市宝安区人民医院检验科，深圳 518101)；黎玉坚(深圳市宝安区人民医院检验科，深圳 518101)；梁统(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；周克元(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；凌光鑫(广东医学院生化教研室，湛江 524023)
关键词：高盐浓度介质；毛细管区带电泳；两步进样法； 堆积效应
广东医学院学报000205 摘要 目的：建立一种 有效克服样品中高盐浓度对毛细管区带电泳分析小分子物质 影响并提高分析灵敏度的方法。方法：用两步压力进样，先进水后 进样再分析 ，以柱效为标准优化进水及进样量。结果：在盐浓度200～6 00mmol/L时，优化的进水及进样量均为137.9kPa.s。用本法分析含氯化钠终浓度为600mmol/L的一系列浓度的肌酐样品，在肌酐浓度2.5～160 mg/L时，用吡啶作内标，肌酐浓度与相应的肌酐与吡啶的峰高比值或校 正的峰面积比值呈线性关系(r>0.99)。结论：用两步 进样法，在200 ～600mmol/L盐浓度时，可有效地分析小分子物质，这归因于毛细管内 的水，提供了一个低导电区而使“样品堆积”。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 Q 658/Q5 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057(2000)02-0129-03
A Two-step injection procedure for overcoming the influence of high salts matrix on the small molecules ananlyzed by capillary zone electrophoresis
Cheng Minggang1，Li Yujian1，Liang Tong 2，Zhou Keyuan2，Ling Guangxin2
(1 Bao’an People’Hospital，Shenzhen，5 181012 Department of Biochemistry，G uangdong MedicalCollege，Zhangjiang)
, http://www.100md.com
Abstract：Objective：To es tabilish a method for improving the sens itivity and overcoming the influence of high salts matrix on the small molecules analysed by capillary zone electrop horesis(CZE).Methods：A two-step injection pro cedure，a short injection of water follow ed by a short injection of sample，wa s used，and the optimal injection vol ume of water and that of sample were selected basing on the theoretical p lates.Results：When the c oncentrt ion of the salt is at 200～600 mmol/L，bot h the optimal injection volume of wat er and that of sample are 137.9 kPa- s Using pyridine as internal standar d，a series of different concentratio ns of creatinine diluted in final con centration of 600 mmol/L sodium cholo ride was studied as example.The resu lts show a good correlation between the concentrations of creatinine and the corresponding peak height or ad justed peak area ratios of creatinin e and pyridine(r>0.99). Conclusi ons：The two-step injection proce dure was an effective means to overcome the influence of high salts matrix on th e trace level analytes seperated by CZE，even when the concentration of t he salt is at 600 mmol/L.Moreover，the analyzer exibited high plate number s，peak height and area.This effect i s owing to a special“stacking”caused by the low resistivity of the short water zone.
, http://www.100md.com
Key words：high salts matrix；capi llary zone electrophoresis；two-step inje ction；stacking effect.
毛细管区带电泳(CZE)作为一种新型的分离分析手段， 具有高效、快速、需样量少、方法易建立等优点。在实际运用中，要达到数十万到数百万的 理论塔板数， 需要进样区带很窄。一般而言，一根 75 μm×50 cm 石英毛细管柱， 2.5～25 nL是适当的进样量[1]，但如此少的进样量对 CZE紫外检测 的灵敏度是相当有限的(10-6～10-7 mol/L)。近年来许多文 献报道通过改善 CZE检测系统以提高其浓度检测限，如采用激光诱导的荧光检测、间 接荧光检测及用 Z-型池、矩形的毛细管柱等增大检测光路等。但这些方法有的 昂贵，有的技术复杂。另外，也有通过在线的“样品富积”技术，如场放大技术[ 2]、等速电泳技术[3]、样品堆积技术[4]等，在基本不损失柱效的 前提下，增加进样量以提高灵敏度。在样品富积时均将样品溶入水或低浓度的缓冲液内以提 高灵敏度[2～4，6，7]，但迄今尚未见有样品含有高浓度盐时，如何采用样 品堆积技术以改善分离效率的报道。鉴于实际样品如浓缩尿、PCR 产物和化工 反应产物中都含有高浓度的盐离子。这种盐离子在 CZE分析其中的痕量小分子 物质时，会产生严重干扰并降低分析的灵敏度，且普通的脱盐方法难以奏效，因此 本文试用两步进样法克服高盐浓度样品中小分子物质的影响以改善分离，提高分析 灵敏度。
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1 材料与方法
1.1仪器与试剂
美国Bio-Rad公司 BiofocusTM 3000型毛细管电泳仪， 用 Bio-Rad 公司 5.0积分软件处理数据。 36 cm×50 μm( I.D.)涂层柱(中科院大连化学物理研究所产)，有效长度 31.5cm， 装在 Bio-Rad公司的毛细管柱组装卡内。肌酐购自 Sigma 公司， 其他试剂为国产分析纯。
1.2 电泳条件
运行电压 16kV、200、230，254nm 多波长紫外检测，压力进样， 正极进样负极检测，电泳缓冲液均为 0.1mol/L，pH2.5 的磷酸盐 缓冲液，毛细管柱温及样品室温 20℃。检测样品中盐浓度的影响时将含终浓度 为 1mmol/L 吡啶(内标)的一系列肌酐标准品加入等体积的氯化钠溶液 中。
, 百拇医药
1.3 两步进样法
先进水后进样：条件优化时将进样量固定在 137.9kPa.s，进水量(0 ～413.7kPa.s)，选出最佳进水量后将进水量固定，再选择进样量。
2 结果
2.1盐浓度对分析效率的影响
先前文献报道[5]，当样品中盐浓度过高时会严重降低灵敏度与柱效，使峰变形， 影响定量的准确性。本实验发现在样品中盐浓度>200 mmol/L时，柱效显 著降低，峰变形。图1为 200 nm检测波长下分析含终浓度为 600 mm ol/L氯化钠的同一样品在不同进样量或进样方法下得到的图谱。
, 百拇医药 (峰1：吡啶，峰2∶肌酐) A 直接进样 137.9 kPa.s，B 两步进样法：水、样品各 137.9kPa.s
图1 高盐浓度肌酐样品的 CZE分析图谱
在高盐浓度下，肌酐、吡啶的峰变形，此时虽可通过稀释的方法使盐浓度降低，但 同时也降低了待分析的肌酐浓度，从而降低了分析的灵敏度。
2.2 两步进样法条件的优化
将进样量固定时，在进水量为 137.9 kPa.s，得到的理论塔板数最高， 将进水量固定为 137.9 kPa.s，进样量变化在 137.9～689. 5 kPa.s的范围，发现在进样量高于 413.7 kPa.s时无法有效的分 析，以 137.9 kpa.s的进样量柱效最高如图2，且在样品中盐浓度为 200～600 mmol/L的范围内，在进水量及进样量均为 137.9 kPa.s时，得到的理论塔板数为最高。本文对低于 137.9 kPa.s进样量 未进一步观察。图1 B是用两步进样法得到的图谱。
, 百拇医药
2.3 线性关系
测定含终浓度为 0.5 mmol/L吡啶、氯化钠为 60 0 mmol/L的不同浓度的肌酐标准品 (2.5～160 mg/L)，在进水 137.9 kpa.s进样137.9 kPa.s时，肌酐浓度(Y)同相应的肌酐 与内 标的峰高比值(X1)或校正的峰面积比值(X2)的线性关系分别为：Y＝19.70 χ1-0.70(r＝0.9919)；Y＝19.08χ2+2.17(r ＝ 0.9938)。
2.4 重复性实验
对肌酐浓度为 80 mg/L(吡啶 0.5 mmol/ L，氯化钠 600 mmol/L)的样品连续测定5次，结果如表1。
表1 两步进样法测定肌酐的精密度(n＝5)
±s
, 百拇医药
CV(%)
肌酐迁移时间(t/min)
7.87±0.71
9.02
吡啶迁移时间(t/min)
7.03±0.54
7.68
峰高比值
3.90±0.15
3.85
峰面积比值
5.18±1.02
, 百拇医药
19.69
校正的峰面积比值
4.70±0.85
18.08
图2 进水及进样量与柱效的关系。
从表中可见在盐浓度 600 mmol/L时用两步进样法仍可定量，峰高比的精 密度优于峰面积比。
2.5 灵敏度
一般而言，适宜的进样体积应小于毛细管长度 0.5%的体积[4]，因此 36 cm×50 μm的毛细管柱适宜进样量不超过 4 nL(13.8 kPa.s )，本文用两步进样法(水、样各137.9 kPa.s)进样量增加 10倍，达 4 0 nL，与单进样(34.5 kPa.s)溶于水的标准品得到的检测限相当 (1 mgL，信噪比为3)，比单进样(137.9 kPa.s)溶于水的标准品得到 检测限高约 2.5倍，但比进样 (137.9 kPa.s)溶于 600 mm ol/L氯化钠的标准品灵敏度提高 10倍。
, 百拇医药
3 讨论
样品堆积是指在毛细管中比背景缓冲液电导率低的样品区带在施加一电压时发生的 过程。由于电场力同溶液的电导率成反比，与缓冲液区带的电场力(Vb)相比， 样品区带的电场力(Vs)要高(Vs>Vb)，因此样品区带中的带电质点的电 迁移率增大(电迁移率与电场力呈正比)，样品区带被压缩，这种被“逆转的扩散”， 称为样品堆积[4]。
样品堆积技术是将样品溶入水或低浓度的缓冲液中，而电泳缓冲液的浓度较高，在 进样并施加电压后发生的过程。本文的两步进样技术的堆积模式略有不同，在施加 电压后，水区带的电场力 Vw>Vb>Vs，因此样品区带中的离子在通过水区 带时，电迁移率大大增加，而被浓缩在水与缓冲液交界的界面，从而发生堆积；另一 方面因样品基质中的钠离子的电迁移率极大，其迅速的通过水区带，而与肌酐离子 分离，从而降低了高盐浓度对肌酐分析的影响。
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与我们的两步压力进样相似，Chien[6]等报道在用电迁移进样前，先进一 段水，可使溶于水的样品进样量提高几百倍并因而大大提高了灵敏度。但电迁移进 样存在“歧视效应”，在高盐浓度的样品分析时可能受到限制。“场放大技术”也 可使溶于水或低浓度缓冲液的样品检测的灵敏度提高1～3个数量级，但这种技术 靠观察电流变化来控制“富集”程度，操作难[7]，且含高盐样品分析时能否应 用尚有待证实。
因多数商品仪器的控制软件在毛细管柱的冲洗程序中允许低压冲洗(Psi×se c，压力乘时间单位)，因此两步进样的进水条件易优化，且可以克服电迁移进样 的偏差及高盐浓度基质的影响，大大提高了柱效和分析的灵敏度。
作者简介：程明刚，男，1970年4月出生，硕士，医师
参考文献
[1] Gordon MJ，Huang X，Pentoney SL， et al.Capillary electrophoresis.Scienc e，1988，242：224～248
, 百拇医药
[2]ChienRL，BurgiDS.Samplestackin gofanextremelylargeinjectionvo lumeinhigh-perfomancecapillaryel ectrophoresis.AnalChem，1992，64：1046 ～1050
[3] Witte DT，Nagard S，Larsson M.Impr oved sensitivity by on-line isotacho phoretic preconcentration in the cap illary zone electrophoretic determin ation of peptide-like solutes.J Chro matogr A，1994，687：155～166
[4] Vinther A，Seberg H. Mathematical model describing dispersion in free solution capillary electrophoresis under stacking condition.J Chromatog r，1991，559：3～26
, http://www.100md.com
[5] Garcia L，Li Liang，Shihabi ZK.Sam ple matrix effects in CE I.Basic cons ideration.J Chromatogr A，1993，652：4 65～469
[6] Burgi DS，Chien RL.Improvement in the method of sample stacking for g ravity injection in capillary zone e lectrophoresis.Anal Biochem，1992，202 (2)：306～309
[7] 徐秉玖，左君，严宝霞.柱上样品富集技术在微量 HPCE定量分析中 的应用.毛细管电泳进展.广州：华南理工大学出版社，1995.52～53
收稿日期：1999-10-05；修订日期：1999-12-28, http://www.100md.com
单位：程明刚(深圳市宝安区人民医院检验科，深圳 518101)；黎玉坚(深圳市宝安区人民医院检验科，深圳 518101)；梁统(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；周克元(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；凌光鑫(广东医学院生化教研室，湛江 524023)
关键词：高盐浓度介质；毛细管区带电泳；两步进样法； 堆积效应
广东医学院学报000205 摘要 目的：建立一种 有效克服样品中高盐浓度对毛细管区带电泳分析小分子物质 影响并提高分析灵敏度的方法。方法：用两步压力进样，先进水后 进样再分析 ，以柱效为标准优化进水及进样量。结果：在盐浓度200～6 00mmol/L时，优化的进水及进样量均为137.9kPa.s。用本法分析含氯化钠终浓度为600mmol/L的一系列浓度的肌酐样品，在肌酐浓度2.5～160 mg/L时，用吡啶作内标，肌酐浓度与相应的肌酐与吡啶的峰高比值或校 正的峰面积比值呈线性关系(r>0.99)。结论：用两步 进样法，在200 ～600mmol/L盐浓度时，可有效地分析小分子物质，这归因于毛细管内 的水，提供了一个低导电区而使“样品堆积”。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 Q 658/Q5 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057(2000)02-0129-03
A Two-step injection procedure for overcoming the influence of high salts matrix on the small molecules ananlyzed by capillary zone electrophoresis
Cheng Minggang1，Li Yujian1，Liang Tong 2，Zhou Keyuan2，Ling Guangxin2
(1 Bao’an People’Hospital，Shenzhen，5 181012 Department of Biochemistry，G uangdong MedicalCollege，Zhangjiang)
, http://www.100md.com
Abstract：Objective：To es tabilish a method for improving the sens itivity and overcoming the influence of high salts matrix on the small molecules analysed by capillary zone electrop horesis(CZE).Methods：A two-step injection pro cedure，a short injection of water follow ed by a short injection of sample，wa s used，and the optimal injection vol ume of water and that of sample were selected basing on the theoretical p lates.Results：When the c oncentrt ion of the salt is at 200～600 mmol/L，bot h the optimal injection volume of wat er and that of sample are 137.9 kPa- s Using pyridine as internal standar d，a series of different concentratio ns of creatinine diluted in final con centration of 600 mmol/L sodium cholo ride was studied as example.The resu lts show a good correlation between the concentrations of creatinine and the corresponding peak height or ad justed peak area ratios of creatinin e and pyridine(r>0.99). Conclusi ons：The two-step injection proce dure was an effective means to overcome the influence of high salts matrix on th e trace level analytes seperated by CZE，even when the concentration of t he salt is at 600 mmol/L.Moreover，the analyzer exibited high plate number s，peak height and area.This effect i s owing to a special“stacking”caused by the low resistivity of the short water zone.
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Key words：high salts matrix；capi llary zone electrophoresis；two-step inje ction；stacking effect.
毛细管区带电泳(CZE)作为一种新型的分离分析手段， 具有高效、快速、需样量少、方法易建立等优点。在实际运用中，要达到数十万到数百万的 理论塔板数， 需要进样区带很窄。一般而言，一根 75 μm×50 cm 石英毛细管柱， 2.5～25 nL是适当的进样量[1]，但如此少的进样量对 CZE紫外检测 的灵敏度是相当有限的(10-6～10-7 mol/L)。近年来许多文 献报道通过改善 CZE检测系统以提高其浓度检测限，如采用激光诱导的荧光检测、间 接荧光检测及用 Z-型池、矩形的毛细管柱等增大检测光路等。但这些方法有的 昂贵，有的技术复杂。另外，也有通过在线的“样品富积”技术，如场放大技术[ 2]、等速电泳技术[3]、样品堆积技术[4]等，在基本不损失柱效的 前提下，增加进样量以提高灵敏度。在样品富积时均将样品溶入水或低浓度的缓冲液内以提 高灵敏度[2～4，6，7]，但迄今尚未见有样品含有高浓度盐时，如何采用样 品堆积技术以改善分离效率的报道。鉴于实际样品如浓缩尿、PCR 产物和化工 反应产物中都含有高浓度的盐离子。这种盐离子在 CZE分析其中的痕量小分子 物质时，会产生严重干扰并降低分析的灵敏度，且普通的脱盐方法难以奏效，因此 本文试用两步进样法克服高盐浓度样品中小分子物质的影响以改善分离，提高分析 灵敏度。
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1 材料与方法
1.1仪器与试剂
美国Bio-Rad公司 BiofocusTM 3000型毛细管电泳仪， 用 Bio-Rad 公司 5.0积分软件处理数据。 36 cm×50 μm( I.D.)涂层柱(中科院大连化学物理研究所产)，有效长度 31.5cm， 装在 Bio-Rad公司的毛细管柱组装卡内。肌酐购自 Sigma 公司， 其他试剂为国产分析纯。
1.2 电泳条件
运行电压 16kV、200、230，254nm 多波长紫外检测，压力进样， 正极进样负极检测，电泳缓冲液均为 0.1mol/L，pH2.5 的磷酸盐 缓冲液，毛细管柱温及样品室温 20℃。检测样品中盐浓度的影响时将含终浓度 为 1mmol/L 吡啶(内标)的一系列肌酐标准品加入等体积的氯化钠溶液 中。
, 百拇医药
1.3 两步进样法
先进水后进样：条件优化时将进样量固定在 137.9kPa.s，进水量(0 ～413.7kPa.s)，选出最佳进水量后将进水量固定，再选择进样量。
2 结果
2.1盐浓度对分析效率的影响
先前文献报道[5]，当样品中盐浓度过高时会严重降低灵敏度与柱效，使峰变形， 影响定量的准确性。本实验发现在样品中盐浓度>200 mmol/L时，柱效显 著降低，峰变形。图1为 200 nm检测波长下分析含终浓度为 600 mm ol/L氯化钠的同一样品在不同进样量或进样方法下得到的图谱。
, 百拇医药 (峰1：吡啶，峰2∶肌酐) A 直接进样 137.9 kPa.s，B 两步进样法：水、样品各 137.9kPa.s
图1 高盐浓度肌酐样品的 CZE分析图谱
在高盐浓度下，肌酐、吡啶的峰变形，此时虽可通过稀释的方法使盐浓度降低，但 同时也降低了待分析的肌酐浓度，从而降低了分析的灵敏度。
2.2 两步进样法条件的优化
将进样量固定时，在进水量为 137.9 kPa.s，得到的理论塔板数最高， 将进水量固定为 137.9 kPa.s，进样量变化在 137.9～689. 5 kPa.s的范围，发现在进样量高于 413.7 kPa.s时无法有效的分 析，以 137.9 kpa.s的进样量柱效最高如图2，且在样品中盐浓度为 200～600 mmol/L的范围内，在进水量及进样量均为 137.9 kPa.s时，得到的理论塔板数为最高。本文对低于 137.9 kPa.s进样量 未进一步观察。图1 B是用两步进样法得到的图谱。
, 百拇医药
2.3 线性关系
测定含终浓度为 0.5 mmol/L吡啶、氯化钠为 60 0 mmol/L的不同浓度的肌酐标准品 (2.5～160 mg/L)，在进水 137.9 kpa.s进样137.9 kPa.s时，肌酐浓度(Y)同相应的肌酐 与内 标的峰高比值(X1)或校正的峰面积比值(X2)的线性关系分别为：Y＝19.70 χ1-0.70(r＝0.9919)；Y＝19.08χ2+2.17(r ＝ 0.9938)。
2.4 重复性实验
对肌酐浓度为 80 mg/L(吡啶 0.5 mmol/ L，氯化钠 600 mmol/L)的样品连续测定5次，结果如表1。
表1 两步进样法测定肌酐的精密度(n＝5)
±s, 百拇医药
CV(%)
肌酐迁移时间(t/min)
7.87±0.71
9.02
吡啶迁移时间(t/min)
7.03±0.54
7.68
峰高比值
3.90±0.15
3.85
峰面积比值
5.18±1.02
, 百拇医药
19.69
校正的峰面积比值
4.70±0.85
18.08
图2 进水及进样量与柱效的关系。
从表中可见在盐浓度 600 mmol/L时用两步进样法仍可定量，峰高比的精 密度优于峰面积比。
2.5 灵敏度
一般而言，适宜的进样体积应小于毛细管长度 0.5%的体积[4]，因此 36 cm×50 μm的毛细管柱适宜进样量不超过 4 nL(13.8 kPa.s )，本文用两步进样法(水、样各137.9 kPa.s)进样量增加 10倍，达 4 0 nL，与单进样(34.5 kPa.s)溶于水的标准品得到的检测限相当 (1 mgL，信噪比为3)，比单进样(137.9 kPa.s)溶于水的标准品得到 检测限高约 2.5倍，但比进样 (137.9 kPa.s)溶于 600 mm ol/L氯化钠的标准品灵敏度提高 10倍。
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3 讨论
样品堆积是指在毛细管中比背景缓冲液电导率低的样品区带在施加一电压时发生的 过程。由于电场力同溶液的电导率成反比，与缓冲液区带的电场力(Vb)相比， 样品区带的电场力(Vs)要高(Vs>Vb)，因此样品区带中的带电质点的电 迁移率增大(电迁移率与电场力呈正比)，样品区带被压缩，这种被“逆转的扩散”， 称为样品堆积[4]。
样品堆积技术是将样品溶入水或低浓度的缓冲液中，而电泳缓冲液的浓度较高，在 进样并施加电压后发生的过程。本文的两步进样技术的堆积模式略有不同，在施加 电压后，水区带的电场力 Vw>Vb>Vs，因此样品区带中的离子在通过水区 带时，电迁移率大大增加，而被浓缩在水与缓冲液交界的界面，从而发生堆积；另一 方面因样品基质中的钠离子的电迁移率极大，其迅速的通过水区带，而与肌酐离子 分离，从而降低了高盐浓度对肌酐分析的影响。
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与我们的两步压力进样相似，Chien[6]等报道在用电迁移进样前，先进一 段水，可使溶于水的样品进样量提高几百倍并因而大大提高了灵敏度。但电迁移进 样存在“歧视效应”，在高盐浓度的样品分析时可能受到限制。“场放大技术”也 可使溶于水或低浓度缓冲液的样品检测的灵敏度提高1～3个数量级，但这种技术 靠观察电流变化来控制“富集”程度，操作难[7]，且含高盐样品分析时能否应 用尚有待证实。
因多数商品仪器的控制软件在毛细管柱的冲洗程序中允许低压冲洗(Psi×se c，压力乘时间单位)，因此两步进样的进水条件易优化，且可以克服电迁移进样 的偏差及高盐浓度基质的影响，大大提高了柱效和分析的灵敏度。
作者简介：程明刚，男，1970年4月出生，硕士，医师
参考文献
[1] Gordon MJ，Huang X，Pentoney SL， et al.Capillary electrophoresis.Scienc e，1988，242：224～248
, 百拇医药
[2]ChienRL，BurgiDS.Samplestackin gofanextremelylargeinjectionvo lumeinhigh-perfomancecapillaryel ectrophoresis.AnalChem，1992，64：1046 ～1050
[3] Witte DT，Nagard S，Larsson M.Impr oved sensitivity by on-line isotacho phoretic preconcentration in the cap illary zone electrophoretic determin ation of peptide-like solutes.J Chro matogr A，1994，687：155～166
[4] Vinther A，Seberg H. Mathematical model describing dispersion in free solution capillary electrophoresis under stacking condition.J Chromatog r，1991，559：3～26
, http://www.100md.com
[5] Garcia L，Li Liang，Shihabi ZK.Sam ple matrix effects in CE I.Basic cons ideration.J Chromatogr A，1993，652：4 65～469
[6] Burgi DS，Chien RL.Improvement in the method of sample stacking for g ravity injection in capillary zone e lectrophoresis.Anal Biochem，1992，202 (2)：306～309
[7] 徐秉玖，左君，严宝霞.柱上样品富集技术在微量 HPCE定量分析中 的应用.毛细管电泳进展.广州：华南理工大学出版社，1995.52～53
收稿日期：1999-10-05；修订日期：1999-12-28, http://www.100md.com