HPLC法测定制首乌及复方虫草胶囊中二苯乙烯苷的含量
作者：杨东辉 魏璐雪 周洪雷 蔡少青 陆蕴茹
单位：杨东辉 蔡少青(北京大学药学院天然药物学系, 北京 100083)；魏璐雪 陆蕴茹(北京中医药大学中药学院)；周洪雷(山东中医药大学)
关键词：苯乙烯类；分析；葡糖苷类；分析；制何首乌；化学；冬虫夏草；化学；色谱法；高压液相
北京医科大学学报000325 [摘 要] 目的:建立原药材制首乌及复方虫草胶囊中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法。方法:YWG-C18柱(4.6 mm×250mm, 10μm); 流动相乙腈-水(1∶4)；检测波长：320nm,参比波长380nm；流速：1ml.min-1；柱温：室温。结果:2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品在1.65～3.85 μg范围内，进样量与峰面积间呈良好的线性关系，r=0.999 7，平均回收率(98.84±0.23)%。对照品在复方虫草胶囊中的峰纯度因子为999.352。结论:用HPLC法测定原药材制首乌及复方虫草胶囊中2，3，5，4′-四羟基葡萄糖苷的含量，操作简便，结果准确，可用于控制原药材制首乌及复方虫草胶囊制剂的质量。
, 百拇医药
[中图分类号] R932.41 [文献标识码] B
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0280-03
Determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside in
Polygonum mutiflorum Thunb.and Fu-Fang-Chong-Cao capsule by HPLC
YANG Dong-Hui，CAI Shao-Qing
(Department of Natural Medicine, School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing100083, China)
, 百拇医药
WEI Lu-Xue， LU Yun-Ru
(School of Traditional Chinese Pharmacy, Beijing Traditional Chinese Medicine University)
ZHOU Hong-Lei
(Shandong Traditional Chinese Medicine University)
ABSTRACT Objective: To control the quality of raw medicinal material Polygonum mutiflorum Thunb. and Fu-Fang-Chong-Cao capsule， and develop a method for the determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside. Methods: HPLC method, YWG-C18 column (4.6 mm×250 mm, 10 μm) with a mobile phase of acetonitrile-water (1∶4); detecting wavelength at 320 nm, reference wavelength at 380 nm; flow rate :1 ml.min-1; column temperature: room temperature. Results: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside was linear within the range of 1.65-3.85 μg, with a correlation coefficient of 0.999 7. The average recovery rate was (98.84±0.23)%. The purity factor of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside in Fu-Fang-Chong-Cao capsule was 999.352. Conclusion: The method is simple and accurate, and can be used for the quality control of raw medicinal material and Fu-Fang-Chong-Cao capsule.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Styrenes/anal; Glucosides/anal; Rd polygoni multiflori prepar/chem; Cordyceps sinensis/chem; Chromatography, high pressure liquid▲
复方虫草胶囊(简称FCJ)由制首乌、冬虫夏草、灵芝、半夏及黄花败酱五味中药组成。主要功效为润肺养肝益肾、理气化湿和络。主治因肺、肝、肾气阴不足、气滞湿阻、脉络不和所致的胸闷气短、疲劳倦怠、失眠健忘等症。FCJ的研究为国家科委新药基金资助课题，是针对慢性疲劳综合征的主要症状而研制的。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷具有降血脂的作用,在体外对蛋白激酶C活性有一定的抑制作用,是何首乌及FCJ中的有效成分之一。为控制原药材制首乌及FCJ的质量，本文采用HPLC法测定了2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在原药材制首乌和FCJ中的含量。
, 百拇医药 1 仪器及试药
HP 1050型HPLC(美国惠普公司)，二极管阵列检测器，HP1050/3D化学工作站。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(以下简称二苯乙烯苷)对照品由北京中医药大学中药学院陆蕴茹教授惠赠；制首乌Polygonum mutiflorum Thunb. 由北京中医药大学中药学院闫玉凝教授鉴定；FCJ制剂由北京中医药大学实验药厂提供。乙腈为优级纯，水为重蒸水。
色谱柱：YWG -C18柱(4.6 mm×250 mm, 10 μm); 流动相：乙腈-水(1：4)；检测波长：320 nm；流速：1 ml.min-1；柱温：室温。
2 实验方法与结果
2.1 标准曲线的建立
精密称取二苯乙烯苷对照品0.22 mg,用甲醇溶解定容至1 ml, 配成0.22 g.L-1的溶液。吸取对照品溶液7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μl，按HPLC条件，进样分析。以进样量(X)对峰面积(Y)作图，得到其标准曲线图。其回归方程为：Y=574.91X+3 518.69,r=0.999 7, n=5。二苯乙烯苷对照品在1.65～3.85 g.L-1范围内，进样量与峰面积间呈良好的线性关系。
, 百拇医药
2.2 提取时间的考察
二苯乙烯苷易溶于甲醇溶液，本文比较了何首乌药材中二苯乙烯苷用甲醇超声提取不同时间的含量(表1)。结果表明，用甲醇超声提取30 min时，自何首乌中提出的二苯乙烯苷的含量最高。为此本文采用甲醇超声提取30 min的方法制备供试品液。
表1 何首乌中二苯乙烯苷提取时间考察
Table 1 Observation of extracting time of
Polygonum mutiflorum Thunb. t/min
15
30
45
, http://www.100md.com
60
Peak area
9 796.02
13 571.30
4 114.75
3 787.98
t, extracting time.
2.3 精密度试验
准确吸取二苯乙烯苷对照品溶液10.0 μl,按HPLC条件，重复进样6次，测定峰面积值。6次测定结果的相对标准偏差为0.66%。
2.4 日间稳定性试验
, http://www.100md.com
取新配制的二苯乙烯苷对照品甲醇液，按HPLC条件，连续5 d测定峰面积值。由测定结果(表2 )可知，二苯乙烯苷甲醇溶液在48 h内含量基本没有变化，之后含量将逐渐降低。
2.5 峰纯度检测
本文利用二极管阵列检测器可进行峰纯度检测,对FCJ中的二苯乙烯苷峰的纯度进行了测定(图1),纯度因子999.352(域值999.999)。
表2 二苯乙烯苷日间稳定性试验
Table 2 Stability experiment of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene
-2-O-β-D-glucoside between days t/day
0
, http://www.100md.com
1
2
3
4
5
Peak
area
9 390.11
9 381.44
8 879.50
8 477.55
7 673.65
7 645.57
, http://www.100md.com
t, stadning time.
图1 FCJ中二苯乙烯甙峰纯度检测图
Figure 1 Peak purity of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene
-2-O-β-D-glucoside in FCJ
2.6 加样回收率试验
称取复方虫草胶囊样品4份，每份1.0 g。其中3份分别加入0.22 g.L-1的二苯乙烯苷对照品液0.5、1.0、1.5 ml。4份样品各加入20 ml甲醇超声提取30 min，过滤，取滤液10 ml蒸干，甲醇溶解并定容至2.0 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品液。吸取供试品液10.0 μl，按HPLC条件，测定二苯乙烯苷的含量，计算加样回收率(表3)。
, 百拇医药
2.7 供试样品的含量测定
称取制首乌及FCJ制剂各1.00 g，分别加入20.0 ml甲醇，超声提取30 min,过滤，取滤液10 ml，蒸干，甲醇溶解并定容至2.0 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品液。吸取供试品液10.0 μl，按HPLC条件，测定二苯乙烯苷的含量。测定结果见表4与图2、3。
表3 复方虫草胶囊加样回收率试验结果(n=3)
Table 3 Recoveries of added constituents in FCJ (n=3) Samples
Found
(mg/g)
Recovery
, 百拇医药
(%)
(%)
RSD
(%)
FCJ
0.930 4
FCJ+added(0.110 mg)
1.039 4
99.09
98.84
0.23
, http://www.100md.com
FCJ+added(0.220 mg)
1.147 4
98.64
FCJ+added(0.330 mg)
1.256 4
98.79
RSD， relative standard deviation.
Ⅰ, peak of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside.
图2 制首乌HPLC图
, 百拇医药
Figure 2 HPLC of Polygonum mutiflorum Thunb.
表4 样品测定结果(n=3)
Table 4 Results of sample determinations(n=3) Samples
Constituents(mg/g)
RSD(%)
Polygonum
mutiflorum Thunb.
0.613 4
1.15
FCJ
, 百拇医药
971003
0.930 4
0.97
(batch number)
971006
1.189 8
1.23
971008
1.110 1
1.08
RSD， relative standard deviation.
3 讨论
, http://www.100md.com
二苯乙烯苷对照品甲醇溶液不稳定，放置2 d以后含量逐渐降低。因此，定量用二苯乙烯苷溶液用前现配测定结果比较准确。
制首乌及复方虫草胶囊制剂中二苯乙烯苷的含量比较高，且在本文的条件下其HPLC峰不受杂质峰的干扰，测试结果比较准确，可用作控制原药材制首乌及复方虫草胶囊制剂质量。
Ⅰ, peak of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside.
图3 复方虫草胶囊HPLC图
Figure 3 HPLC of FCJ
(2000-01-31收稿), 百拇医药
单位：杨东辉 蔡少青(北京大学药学院天然药物学系, 北京 100083)；魏璐雪 陆蕴茹(北京中医药大学中药学院)；周洪雷(山东中医药大学)
关键词：苯乙烯类；分析；葡糖苷类；分析；制何首乌；化学；冬虫夏草；化学；色谱法；高压液相
北京医科大学学报000325 [摘 要] 目的:建立原药材制首乌及复方虫草胶囊中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法。方法:YWG-C18柱(4.6 mm×250mm, 10μm); 流动相乙腈-水(1∶4)；检测波长：320nm,参比波长380nm；流速：1ml.min-1；柱温：室温。结果:2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品在1.65～3.85 μg范围内，进样量与峰面积间呈良好的线性关系，r=0.999 7，平均回收率(98.84±0.23)%。对照品在复方虫草胶囊中的峰纯度因子为999.352。结论:用HPLC法测定原药材制首乌及复方虫草胶囊中2，3，5，4′-四羟基葡萄糖苷的含量，操作简便，结果准确，可用于控制原药材制首乌及复方虫草胶囊制剂的质量。
, 百拇医药
[中图分类号] R932.41 [文献标识码] B
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0280-03
Determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside in
Polygonum mutiflorum Thunb.and Fu-Fang-Chong-Cao capsule by HPLC
YANG Dong-Hui，CAI Shao-Qing
(Department of Natural Medicine, School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing100083, China)
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WEI Lu-Xue， LU Yun-Ru
(School of Traditional Chinese Pharmacy, Beijing Traditional Chinese Medicine University)
ZHOU Hong-Lei
(Shandong Traditional Chinese Medicine University)
ABSTRACT Objective: To control the quality of raw medicinal material Polygonum mutiflorum Thunb. and Fu-Fang-Chong-Cao capsule， and develop a method for the determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside. Methods: HPLC method, YWG-C18 column (4.6 mm×250 mm, 10 μm) with a mobile phase of acetonitrile-water (1∶4); detecting wavelength at 320 nm, reference wavelength at 380 nm; flow rate :1 ml.min-1; column temperature: room temperature. Results: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside was linear within the range of 1.65-3.85 μg, with a correlation coefficient of 0.999 7. The average recovery rate was (98.84±0.23)%. The purity factor of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside in Fu-Fang-Chong-Cao capsule was 999.352. Conclusion: The method is simple and accurate, and can be used for the quality control of raw medicinal material and Fu-Fang-Chong-Cao capsule.
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KEY WORDS Styrenes/anal; Glucosides/anal; Rd polygoni multiflori prepar/chem; Cordyceps sinensis/chem; Chromatography, high pressure liquid▲
复方虫草胶囊(简称FCJ)由制首乌、冬虫夏草、灵芝、半夏及黄花败酱五味中药组成。主要功效为润肺养肝益肾、理气化湿和络。主治因肺、肝、肾气阴不足、气滞湿阻、脉络不和所致的胸闷气短、疲劳倦怠、失眠健忘等症。FCJ的研究为国家科委新药基金资助课题，是针对慢性疲劳综合征的主要症状而研制的。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷具有降血脂的作用,在体外对蛋白激酶C活性有一定的抑制作用,是何首乌及FCJ中的有效成分之一。为控制原药材制首乌及FCJ的质量，本文采用HPLC法测定了2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在原药材制首乌和FCJ中的含量。
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HP 1050型HPLC(美国惠普公司)，二极管阵列检测器，HP1050/3D化学工作站。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(以下简称二苯乙烯苷)对照品由北京中医药大学中药学院陆蕴茹教授惠赠；制首乌Polygonum mutiflorum Thunb. 由北京中医药大学中药学院闫玉凝教授鉴定；FCJ制剂由北京中医药大学实验药厂提供。乙腈为优级纯，水为重蒸水。
色谱柱：YWG -C18柱(4.6 mm×250 mm, 10 μm); 流动相：乙腈-水(1：4)；检测波长：320 nm；流速：1 ml.min-1；柱温：室温。
2 实验方法与结果
2.1 标准曲线的建立
精密称取二苯乙烯苷对照品0.22 mg,用甲醇溶解定容至1 ml, 配成0.22 g.L-1的溶液。吸取对照品溶液7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μl，按HPLC条件，进样分析。以进样量(X)对峰面积(Y)作图，得到其标准曲线图。其回归方程为：Y=574.91X+3 518.69,r=0.999 7, n=5。二苯乙烯苷对照品在1.65～3.85 g.L-1范围内，进样量与峰面积间呈良好的线性关系。
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2.2 提取时间的考察
二苯乙烯苷易溶于甲醇溶液，本文比较了何首乌药材中二苯乙烯苷用甲醇超声提取不同时间的含量(表1)。结果表明，用甲醇超声提取30 min时，自何首乌中提出的二苯乙烯苷的含量最高。为此本文采用甲醇超声提取30 min的方法制备供试品液。
表1 何首乌中二苯乙烯苷提取时间考察
Table 1 Observation of extracting time of
Polygonum mutiflorum Thunb. t/min
15
30
45
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60
Peak area
9 796.02
13 571.30
4 114.75
3 787.98
t, extracting time.
2.3 精密度试验
准确吸取二苯乙烯苷对照品溶液10.0 μl,按HPLC条件，重复进样6次，测定峰面积值。6次测定结果的相对标准偏差为0.66%。
2.4 日间稳定性试验
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取新配制的二苯乙烯苷对照品甲醇液，按HPLC条件，连续5 d测定峰面积值。由测定结果(表2 )可知，二苯乙烯苷甲醇溶液在48 h内含量基本没有变化，之后含量将逐渐降低。
2.5 峰纯度检测
本文利用二极管阵列检测器可进行峰纯度检测,对FCJ中的二苯乙烯苷峰的纯度进行了测定(图1),纯度因子999.352(域值999.999)。
表2 二苯乙烯苷日间稳定性试验
Table 2 Stability experiment of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene
-2-O-β-D-glucoside between days t/day
0
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1
2
3
4
5
Peak
area
9 390.11
9 381.44
8 879.50
8 477.55
7 673.65
7 645.57
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图1 FCJ中二苯乙烯甙峰纯度检测图
Figure 1 Peak purity of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene
-2-O-β-D-glucoside in FCJ
2.6 加样回收率试验
称取复方虫草胶囊样品4份，每份1.0 g。其中3份分别加入0.22 g.L-1的二苯乙烯苷对照品液0.5、1.0、1.5 ml。4份样品各加入20 ml甲醇超声提取30 min，过滤，取滤液10 ml蒸干，甲醇溶解并定容至2.0 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品液。吸取供试品液10.0 μl，按HPLC条件，测定二苯乙烯苷的含量，计算加样回收率(表3)。
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2.7 供试样品的含量测定
称取制首乌及FCJ制剂各1.00 g，分别加入20.0 ml甲醇，超声提取30 min,过滤，取滤液10 ml，蒸干，甲醇溶解并定容至2.0 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品液。吸取供试品液10.0 μl，按HPLC条件，测定二苯乙烯苷的含量。测定结果见表4与图2、3。
表3 复方虫草胶囊加样回收率试验结果(n=3)
Table 3 Recoveries of added constituents in FCJ (n=3) Samples
Found
(mg/g)
Recovery
, 百拇医药
(%)
(%)
RSD
(%)
FCJ
0.930 4
FCJ+added(0.110 mg)
1.039 4
99.09
98.84
0.23
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FCJ+added(0.220 mg)
1.147 4
98.64
FCJ+added(0.330 mg)
1.256 4
98.79
RSD， relative standard deviation.
Ⅰ, peak of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside.
图2 制首乌HPLC图
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Figure 2 HPLC of Polygonum mutiflorum Thunb.
表4 样品测定结果(n=3)
Table 4 Results of sample determinations(n=3) Samples
Constituents(mg/g)
RSD(%)
Polygonum
mutiflorum Thunb.
0.613 4
1.15
FCJ
, 百拇医药
971003
0.930 4
0.97
(batch number)
971006
1.189 8
1.23
971008
1.110 1
1.08
RSD， relative standard deviation.
3 讨论
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二苯乙烯苷对照品甲醇溶液不稳定，放置2 d以后含量逐渐降低。因此，定量用二苯乙烯苷溶液用前现配测定结果比较准确。
制首乌及复方虫草胶囊制剂中二苯乙烯苷的含量比较高，且在本文的条件下其HPLC峰不受杂质峰的干扰，测试结果比较准确，可用作控制原药材制首乌及复方虫草胶囊制剂质量。
Ⅰ, peak of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside.
图3 复方虫草胶囊HPLC图
Figure 3 HPLC of FCJ
(2000-01-31收稿), 百拇医药