人参总皂甙对造血生长因子活性及其mRNA表达的影响*
作者：王勇 王莎莉 王亚平 姜蓉 张淑慎
单位：王勇 姜蓉 张淑慎(重庆医科大学组织学胚胎学教研室)；王莎莉(生理学教研室 重庆 400016)
关键词：人参总皂甙；造血生长因子；粒-巨噬细胞集落刺激因子；白细胞介素-6；基因表达；原位杂交
解剖学报990420 【摘要】 目的 探讨人参“补气生血”的现代生物学机理。 方法 采用核酸分子原位杂交和造血生长因子生物活性检测等技术，研究人参总皂甙(TSPG)对造血生长因子活性及其mRNA表达的影响。 结果 TSPG能显著促进小鼠骨髓基质细胞(BMSC)、腹腔巨噬细胞(PMφ)和脾细胞(SPC)的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素-6(IL-6)mRNA的表达，经TSPG诱导制备的BMSC、PMφ和SPC条件培养上清液含有较高的爆式红系集落刺激活性(BPA)、粒-巨噬细胞集落刺激活性(GM-CSA)和巨核细胞集落刺激活性(MK-CSA)。 结论 TSPG促进血细胞生成的机理与其诱导造血生长因子的基因表达有密切关系。
, 百拇医药
EFFECT OF TOTAL SAPONINS OF PANAX GINSENG
ON THE BIOACTIVITY AND mRNA EXPRESSION OF
HEMATOPOIETIC GROWTH FACTORS
Wang Yong, Wang Shali, Wang Yaping△,Jiang Rong, Zhang Shushen
(Department of Histology and Embryology, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing)
【Abstract】 Objective Hematopoietic growth factors (HGF) play a very important role in hematopoietic regulation. Saponins is known as of the main effective fractions in Chinese traditional medicine Panax Ginseng. Our previous study has showed that total saponins of panax ginseng(TSPG) could stimulate hematopoiesis significantly. The present study investigate the effect of TSPG on the bioactivity and mRNA expression of HGF for clarifying the hematonic mechanism of Panax Ginseng. Methods The techniques of nucleic acid in situ hybridization, culture of hematopoietic progenitor cells ex vivo and bioassay of HGF were used. Results TSPG could markedly enhance bone marrow stromal cell (BMSC), peritoneal macrophage(PMφ) and splenic cell (SPC) to express GM-CSF mRNA and IL-6 mRNA. The BMSC, PMφ and SPC conditioned media, prepared by treating these cell with TSPG (20mg/L) ex vitro, could obviously promote proliferation and differentiation of BFU-E, CFU-GM and CFU-MK. These mean that much higher burst promoting activity (BPA), granulocyte and macrophage colony-stimulating activity (GM-CSA) and megakaryocyte colony-stimulating activity (MK-CSF) exist in TSPG induced conditioned media. Conclusion TSPG may regulate hematopoiesis by activating GM-CSF and IL-6 mRNA expression of BMSC. Mφ and lymphocyte in hematopoietic inductive microenvironment. This mayht be one of the mechanisms for the promoting vital energy and hematopoiesis of panax ginseng.
, 百拇医药
【Key words】 Total saponins of panax ginseng; Hematopoietic growth factor; Gene expression; In situ hybridization
人参是中医临床“补气”要药，有“补气生血”之功效，人参皂甙是其主要的药物成分[1]。本室既往工作证实：人参总皂甙(TSPG)能促进贫血小鼠造血功能的恢复，亦能在体外促进造血祖细胞的集落形成[2，3]。血细胞的生成与造血生长因子(hematopoietic growth factors, HGF)的调控密切相关，造血祖细胞的增殖与分化依赖于HGF的刺激，造血祖细胞体外培养术能检测HGF的生物活性[4]。为探讨TSPG促进造血与HGF的关系，本研究TSPG对粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-6(IL-6)等表达的影响，旨在阐明人参“补气生血”的细胞与分子生物学机理，以弘扬和促进祖国传统医学的发展。
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材料和方法
1. 材料
1.1 实验动物:8～12周龄纯系615雄性小鼠60只，体重18～22g，重庆医科大学实验动物中心提供。
1.2 人参总皂甙(total saponins of Panax ginseng, TSPG):四川省中药研究所提供，皂甙纯度90%以上。IMDM培养液配制，过滤除菌。
1.3 主要试剂：RPMI-1640、IMDM培养基(GIBCO公司产品)，重组人红细胞生成素(美国Amgen公司产品)，甲基纤维素(Sigma公司产品)，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和爆式集落促进活性(BPA)(军事医学科学院提供)，地高辛标记试剂盒(德国宝灵曼公司产品)。
2.方法
, 百拇医药
2.1 骨髓基质细胞条件培养液：(BMSCM)制备：参照Dexter等[5]骨髓细胞长期培养方法，建立小鼠骨髓基质细胞系。培养2～3周待基质细胞长满瓶底后，以0.25%胰酶消化收集基质细胞，含10%小牛血清的IMDM培养液传代培养。TSPG组，在培养体系中加TSPG(终浓度20mg/L)；对照组，加等量IMDM培养液。第6d收集培养上清。
2.2 脾细胞培养上清液(SPCM)和腹腔巨噬细胞培养上清液(PMΦCM)制备：方法同文献[6]。实验组加TSPG(终浓度20mg/L)；对照组加等量的IMDM培养液，培养4d收集培养上清液。
2.3 造血生长因子活性检测：按本室常规方法培养早期红系祖细胞(BFU-E)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)和巨核系祖细胞(CFU-MK)[3]。培养体系中分别加入10%(V/V)BMSCM、PMφCM或SPCM，以每种植5×104个骨髓有核细胞(BMC)所生成的BFU-E集落数表示爆式红系集落刺激活性(BPA)的水平；以生成的CFU-GM集落数表示粒巨-噬细胞集落刺激活性(GM-CSA)的水平；以每种植1×105BMC生成CFU-MK的集落数表示巨核细胞集落刺激活性(MK-CSA)的水平。
, 百拇医药
2.4 cDNA探针制备：GM-CSF和IL-6 cDNA探针制备方法同文献[7]。用地高辛-11-dUTP(digoxigenin-11-dUTP)为标记物，随机引物法标记GM-CSF和IL-6 cDNA探针。标记程序参照宝灵曼公司Dig-High Prime试剂盒操作手册进行。
2.5 原位杂交：
2.5.1 细胞培养与涂片制备：BMSC和PMφ直接培养在载玻片上，在培养终止前24h加入TSPG(20 mg/L)。SPC培养同文献[6]，培养终止后经细胞离心涂片到载玻片上，载片经4%多聚甲醛固定，75%乙醇保存备用。
2.5.2 杂交前处理：杂交前载片处理方法同文献[7]。
2.5.3 预杂交与杂交：每张载片加预杂交液20μl,42℃湿盒内30min，吸干预杂交液，加杂交液10～20μl(含变性后的GM-CSF或IL-6cDNA探针)，42℃湿盒内过夜。
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2.5.4 杂交后显色：杂交后载片经充分漂洗，加碱性磷酸酶(AKP)标记的羊抗地高辛(sheep anti-Dig-AKP)Fab片段，37℃湿盒2h。以NBT/BCIP为显色系统，37℃湿盒内显色1～6h，核固红衬染2min，脱水，封片。
2.5.5 结果判断：光镜下GM-CSF或IL-6 mRNA表达阳性细胞的胞浆中可见蓝紫色颗粒，胞核染成红色。每张涂片计数200个细胞中阳性细胞的百分比；反应强度依据胞浆中蓝紫色颗粒多少及颜色深浅分为强阳性(+++)、阳性(++)、弱阳性(+)和阴性(-)4级，分别计为3、2、1和0分。积分指数=阳性百分率×强度计分。
2.5.6 对照实验：实验设阴性对照包括：未加探针进行杂交；用RNase处理载片后再进行杂交。所有对照结果均为阴性。
结 果
1.TSPG对BPA生成的影响
, http://www.100md.com
经TSPG刺激制备的BMSCM、PMφCM和SPCM对BFU-E增殖的刺激活性显著高于对照组，其集落产率明显提高(表1)，提示TSPG可能促进BMSC、PMφ和SPC产生BPA。
表1 人参总皂甙对爆式红系集落促进因子生成的影响
Table 1 Effect of TSPG on production of burst promoting activity (BPA) 条件培养液
conditioned media
爆式集落促进活性(BFU-E/5×104BMC)
BPA(BFU-E/5×104BMC)
对照组
, http://www.100md.com
control group
人参总皂甙组
TSPG group
骨髓基质细胞条件培养液
20.7±6.0
30.3±6.7*
BMSCM
(n=15)
(n=15)
腹腔巨噬细胞条件培养液
42.3±6.7
, 百拇医药 53.1±9.3*
PMφCM
(n=21)
(n=21)
脾细胞条件培养液
43.9±6.3
56.3±6.4*
SPCM
(n=21)
(n=21)
*,P<0.001，与对照组比
*,compared with control group. P<0.0012.TSPG对GM-CSA生成的影响
, 百拇医药
经TSPG刺激制备的BMSCM、PMφCM和SPCM对CFU-GM增殖的刺激活性明显高于对照组(表2)，提示TSPG可能诱导和促进BMSC、PMφ和SPC产生GM-CSA。
表2 人参总皂甙对粒-巨噬细胞集落刺激因子活性生成的影响
Table 2 Effect of TSPG on production of granulocyte-macrophage colony-stimulating activity(GM-CSA) 条件培养液
conditioned media
粒-巨噬细胞集落刺激活性
(CFU-GM/5×104BMC)
GM-CSA(CFU-GM/5×104BMC)
, 百拇医药
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
骨髓基质细胞条件培养液
21.5±5.9
36.6±8.9*
BMSCM
(n=17)
(n=17)
腹腔巨噬细胞条件培养液
69.4±7.8
, 百拇医药
81.8±6.3*
PMφCM
(n=21)
(n=21)
脾细胞条件培养液
61.1±4.6
78.9±5.3*
SPCM
(n=14)
(n=14)
*,P<0.001，与对照组比
, 百拇医药 *,Compared with control group. P<0.0013.TSPG对MK-CSA生成的影响
经TSPG刺激制备的BMSCM、PMφCM和SPCM对CFU-MK集落形成的刺激活性明显高于对照组(表3)，提示TSPG可能诱导和促进BMSC、PMφ和SPC分泌MK-CSA。
表3 人参总皂甙对巨核细胞集落刺激因子活性生成的影响
Table 3 Effect of TSPG on production of megakaryocytecolony-stimulating activity (MK-CSA) 条件培养液
conditioned media
巨核细胞集落刺激活性
, http://www.100md.com (CFU-MK/1×105BMC)
MK-CSA(CFU-MK/1×105BMC)
对照组
control group
TSPG组
TSPG group
骨髓基质细胞条件培养液
5.8±2.9
8.9±3.0#
BMSCM
(n=12)
, 百拇医药
(n=12)
腹腔巨噬细胞条件培养液
3.6±1.3
7.1±1.7*
PMφCM
(n=16)
(n=16)
脾细胞条件培养液
5.8±1.7
9.4±1.9*
SPCM
(n=16)
, 百拇医药
(n=16)
＃,P<0.05，*P<0.001，与对照组比
Compared with control group, #，P<0.05，*,P<0.001
4. TSPG对GM-CSFmRNA表达的影响
核酸原位杂交显示正常静止状态下BMSC、PMφ和SPC的GM-CSF mRNA表达水平较低；经TSPG诱导后，上述细胞GM-CSF mRNA表达阳性率和表达阳性强度积分值均显著提高(表4，图1～4)，提示TSPG能诱导和促进GM-CSF mRNA的表达。
表4 人参总皂甙对粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA的表达的影响
Table 4 Effect of TSPG on expression of GM-CSF mRNA 细胞
, 百拇医药
cells
表达阳性率(%)
positive cell ratio(%)
积分指数
index
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
对照组
control group
人参总皂甙组
, 百拇医药
TSPG group
骨髓基质细胞
13.6±4.5
35.7±9.4*
0.18±0.07
0.73±0.28*
BMSC
腹腔巨噬细胞
33.1±7.4
45.6±8.7*
0.89±0.15
, 百拇医药
1.29±0.29*
PMφ
脾细胞
26.4±6.6
39.1±10.2*
0.48±0.11
0.89±0.16*
SPC
*,P<0.01，与对照组相比。
*, compared with control group, P<0.001
, http://www.100md.com 5. TSPG对IL-6 mRNA表达的影响
原位杂交结果显示正常静止状态下BMSC、PMφ和SPC胞浆内均有紫蓝色颗粒的IL-6 mRNA的阳性信号。经TSPG诱导后上述细胞IL-6 mRNA表达阳性细胞率和表达强度积分值均明显高于对照组(表5，图4～8)，提示TSPG能促进IL-6 mRNA的表达。
表5 人参总皂甙对白细胞介素-6mRNA表达的影响
Table 5 Effect of TSPG on expression of IL-6 mRNA 细胞
cells
表达阳性率(%)
positive cell ratio(%)
, 百拇医药
积分指数
index
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
骨髓基质细胞
35.3±6.4
, 百拇医药
58.5±7.9*
0.74±0.09
1.22±0.13
BMSC
腹腔巨噬细胞
63.6±12.5
72.1±13.2＃
1.37±0.23
1.82±0.26*
PMφ
脾细胞
, 百拇医药
41.8±9.2
61.3±10.4*
0.87±0.8
1.32±0.21*
SPC
#,P<0.05，*,P<0.01，与对照组相比
Compared with control group, #,P<0.05,*,P<0.001讨 论
从造血干细胞到造血祖细胞的增殖分化直至成熟血细胞的形成过程中，存在着多种造血生长因子(HGF)的网络性调控作用。早期发现的一些HGF又称集落刺激活性(colony-stimulating activity,CSA)。根据其刺激造血祖细胞所形成集落的细胞类型可以分为：刺激BFU-E形成爆式红系集落的BPA，刺激CFU-GM形成粒-巨噬细胞集落的GM-CSA和刺激CFU-MK形成巨核细胞集落的MK-CSA等类型[4，8]。我们既往工作证实：TSPG能促进小鼠造血祖细胞的增殖分化[2，3]，由于造血祖细胞的增殖与CSA的刺激作用有关，本研究采用造血祖细胞培养术，检测了经TSPG诱导后制备的BMSC、PMφ和SPC条件培养上清液中BPA、GM-CSA和MK-CSA活性，以探讨TSPG促进血细胞生成与CSA活性的关系。研究结果表明：经TSPG诱导制备的BMSCM、PMΦCM和SPCM能显著提高BFU-E、CFU-GM和CFU-MK的集落产率。提示TSPG能诱导和促进BMSC、PMΦ和SPC产生BPA、GM-CSA和MK-CSA等造血细胞集落刺激活性，以促进造血祖细胞的体外增殖与集落形成。
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CSA检测仅反映了上述细胞条件培养液所含HGF的生物学活性，即对相应造血祖细胞增殖与分化的刺激活性[4]。由于CSA并非均一的造血生长因子[8，9]，而且HGF本身也有其多效性(pleiotropy)和丰富性(redundancy)的特点，为进一步阐明TSPG能诱导和影响哪些具体的HGF表达，本研究用经地高辛标记的GM-CSF和IL-6 cDNA探针，通过核酸原位杂交技术，检测了在有或无TSPG刺激条件下，BMSC、PMφ和SPC细胞GM-CSF和IL-6 mRNA的表达水平。原位杂交结果显示：经TSPG诱导后BMSC、PMφ和SPC的GM-CSF和IL-6 mRNA表达阳性率和强度积分值均显著高于对照组，提示TSPG能促进GM-CSF和IL-6 mRNA的表达。GM-CSF是由激活的T淋巴细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等产生的分子量约为22kD的糖蛋白，能刺激CFU-GM、BFU-E和CFU-MK等多种造血祖细胞增殖，是对早期造血祖细胞具有广泛增殖促进活性的集落刺激因子[9]。IL-6除协同IL-3刺激早期造血祖细胞增殖外，尚能促进巨核细胞的成熟与血小板的生成[10]。现代研究认为：造血生长因子(HGF)与造血细胞膜上相应的HGF受体结合，启动调控信号向核内转导，引起核内某些基因转录增强或其他基因转录抑制，最终表现出蛋白合成改变，而导致细胞行为等变化。可见研究HGF的基因表达及调控能深入阐明造血调控的分子生物学机理。我们的研究结果提示：TSPG能促进BMSC、PMΦ和SPC细胞GM-CSF和IL-6基因的表达，表明TSPG促进血细胞生成与其诱导GM-CSF和IL-6基因表达，促进GM-CSF和IL-6等HGF的产生有密切关系。当然与造血调控有关的HGF还有很多，如红细胞生成素(Epo)，白细胞介素-3(IL-3)和血小板生成素(Tpo)等，此外还有相应HGF的受体。对此我们正在进行深入探讨，为阐明人参“补气生血”的现代生物学机理提供实验依据。
, 百拇医药
图版说明
图1 正常静止状态下骨髓基质细胞的粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达水平很低 ×200
图2 人参总皂甙诱导后24h，骨髓基质细胞粒-巨噬细胞集落刺激因子m RNA表达显著提高 ×400
图3 经人参总皂甙诱导后24h，腹腔巨噬细胞的粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达水平明显提高 ×400
图4 经人参总皂甙诱导后24h，脾细胞的粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达显著提高 ×600
图5 正常静止状态下骨髓基质细胞的IL-6 mRNA表达较低 ×450
图6 经人参总皂甙诱导后24h，骨髓基质细胞的IL-6 mRNA表达提高 ×600
, 百拇医药
图7 经人参总皂甙诱导后24h，腹腔巨噬细胞的IL-6 mRNA表达明显提高 ×400
图8 人参总皂甙诱导24h，脾细胞的IL-6 mRNA表达显著增加 ×450
Explanation of figures
Fig.1 Weakened GM-CSF mRNA expression of bone marrow stromal cell in control group. ×200
Fig.2 Remarkedly increased GM-CSF mRNA expression of bone marrow stromal cell after induced with TSPG for 24hr. ×400
Fig.3 Obviously promoted GM-CSF mRNA expression of peritoneal macrophage after induced with TSPG for 24hr. ×400
, 百拇医药
Fig.4 GM-CSF mRNA expression of splenic cell is enhanced after induced with TSPG for 24hr. ×600
Fig.5 Weakened IL-6 mRNA expression of bone marrow stromal cell in the control group. ×450
Fig.6 Markedely promoted IL-6 mRNA expression of bone marrow stromal cells after treated with TSPG for 24hr. ×600
Fig.7 IL-6 mRNA expression of peritoneal macrophage is increased after treated with TSPG for 24hr. ×400
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Fig.8 Remarkedly increased IL-6 mRNA expression of splenic cells after treated with TSPG for 24hr. ×450
*国家自然科学基金资助课题(No.39670880),重庆市中医药管理局资助课题
△ Department of Histology and Embryology, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China.
参考文献
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7 王亚平，王勇，郑敏，等.地高辛标记cDNA探针检测GM-CSFmRNA表达.免疫学杂志，1999，15(3)：223
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10 Leary AG, Ikebuchik, Hirai Y, et al. Synergism between interleukin-6 and IL-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells. Blood, 1988,71(6):1759
收稿1998-10 修回1999-02, 百拇医药
单位：王勇 姜蓉 张淑慎(重庆医科大学组织学胚胎学教研室)；王莎莉(生理学教研室 重庆 400016)
关键词：人参总皂甙；造血生长因子；粒-巨噬细胞集落刺激因子；白细胞介素-6；基因表达；原位杂交
解剖学报990420 【摘要】 目的 探讨人参“补气生血”的现代生物学机理。 方法 采用核酸分子原位杂交和造血生长因子生物活性检测等技术，研究人参总皂甙(TSPG)对造血生长因子活性及其mRNA表达的影响。 结果 TSPG能显著促进小鼠骨髓基质细胞(BMSC)、腹腔巨噬细胞(PMφ)和脾细胞(SPC)的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素-6(IL-6)mRNA的表达，经TSPG诱导制备的BMSC、PMφ和SPC条件培养上清液含有较高的爆式红系集落刺激活性(BPA)、粒-巨噬细胞集落刺激活性(GM-CSA)和巨核细胞集落刺激活性(MK-CSA)。 结论 TSPG促进血细胞生成的机理与其诱导造血生长因子的基因表达有密切关系。
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EFFECT OF TOTAL SAPONINS OF PANAX GINSENG
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【Abstract】 Objective Hematopoietic growth factors (HGF) play a very important role in hematopoietic regulation. Saponins is known as of the main effective fractions in Chinese traditional medicine Panax Ginseng. Our previous study has showed that total saponins of panax ginseng(TSPG) could stimulate hematopoiesis significantly. The present study investigate the effect of TSPG on the bioactivity and mRNA expression of HGF for clarifying the hematonic mechanism of Panax Ginseng. Methods The techniques of nucleic acid in situ hybridization, culture of hematopoietic progenitor cells ex vivo and bioassay of HGF were used. Results TSPG could markedly enhance bone marrow stromal cell (BMSC), peritoneal macrophage(PMφ) and splenic cell (SPC) to express GM-CSF mRNA and IL-6 mRNA. The BMSC, PMφ and SPC conditioned media, prepared by treating these cell with TSPG (20mg/L) ex vitro, could obviously promote proliferation and differentiation of BFU-E, CFU-GM and CFU-MK. These mean that much higher burst promoting activity (BPA), granulocyte and macrophage colony-stimulating activity (GM-CSA) and megakaryocyte colony-stimulating activity (MK-CSF) exist in TSPG induced conditioned media. Conclusion TSPG may regulate hematopoiesis by activating GM-CSF and IL-6 mRNA expression of BMSC. Mφ and lymphocyte in hematopoietic inductive microenvironment. This mayht be one of the mechanisms for the promoting vital energy and hematopoiesis of panax ginseng.
, 百拇医药
【Key words】 Total saponins of panax ginseng; Hematopoietic growth factor; Gene expression; In situ hybridization
人参是中医临床“补气”要药，有“补气生血”之功效，人参皂甙是其主要的药物成分[1]。本室既往工作证实：人参总皂甙(TSPG)能促进贫血小鼠造血功能的恢复，亦能在体外促进造血祖细胞的集落形成[2，3]。血细胞的生成与造血生长因子(hematopoietic growth factors, HGF)的调控密切相关，造血祖细胞的增殖与分化依赖于HGF的刺激，造血祖细胞体外培养术能检测HGF的生物活性[4]。为探讨TSPG促进造血与HGF的关系，本研究TSPG对粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-6(IL-6)等表达的影响，旨在阐明人参“补气生血”的细胞与分子生物学机理，以弘扬和促进祖国传统医学的发展。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 材料
1.1 实验动物:8～12周龄纯系615雄性小鼠60只，体重18～22g，重庆医科大学实验动物中心提供。
1.2 人参总皂甙(total saponins of Panax ginseng, TSPG):四川省中药研究所提供，皂甙纯度90%以上。IMDM培养液配制，过滤除菌。
1.3 主要试剂：RPMI-1640、IMDM培养基(GIBCO公司产品)，重组人红细胞生成素(美国Amgen公司产品)，甲基纤维素(Sigma公司产品)，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和爆式集落促进活性(BPA)(军事医学科学院提供)，地高辛标记试剂盒(德国宝灵曼公司产品)。
2.方法
, 百拇医药
2.1 骨髓基质细胞条件培养液：(BMSCM)制备：参照Dexter等[5]骨髓细胞长期培养方法，建立小鼠骨髓基质细胞系。培养2～3周待基质细胞长满瓶底后，以0.25%胰酶消化收集基质细胞，含10%小牛血清的IMDM培养液传代培养。TSPG组，在培养体系中加TSPG(终浓度20mg/L)；对照组，加等量IMDM培养液。第6d收集培养上清。
2.2 脾细胞培养上清液(SPCM)和腹腔巨噬细胞培养上清液(PMΦCM)制备：方法同文献[6]。实验组加TSPG(终浓度20mg/L)；对照组加等量的IMDM培养液，培养4d收集培养上清液。
2.3 造血生长因子活性检测：按本室常规方法培养早期红系祖细胞(BFU-E)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)和巨核系祖细胞(CFU-MK)[3]。培养体系中分别加入10%(V/V)BMSCM、PMφCM或SPCM，以每种植5×104个骨髓有核细胞(BMC)所生成的BFU-E集落数表示爆式红系集落刺激活性(BPA)的水平；以生成的CFU-GM集落数表示粒巨-噬细胞集落刺激活性(GM-CSA)的水平；以每种植1×105BMC生成CFU-MK的集落数表示巨核细胞集落刺激活性(MK-CSA)的水平。
, 百拇医药
2.4 cDNA探针制备：GM-CSF和IL-6 cDNA探针制备方法同文献[7]。用地高辛-11-dUTP(digoxigenin-11-dUTP)为标记物，随机引物法标记GM-CSF和IL-6 cDNA探针。标记程序参照宝灵曼公司Dig-High Prime试剂盒操作手册进行。
2.5 原位杂交：
2.5.1 细胞培养与涂片制备：BMSC和PMφ直接培养在载玻片上，在培养终止前24h加入TSPG(20 mg/L)。SPC培养同文献[6]，培养终止后经细胞离心涂片到载玻片上，载片经4%多聚甲醛固定，75%乙醇保存备用。
2.5.2 杂交前处理：杂交前载片处理方法同文献[7]。
2.5.3 预杂交与杂交：每张载片加预杂交液20μl,42℃湿盒内30min，吸干预杂交液，加杂交液10～20μl(含变性后的GM-CSF或IL-6cDNA探针)，42℃湿盒内过夜。
, http://www.100md.com
2.5.4 杂交后显色：杂交后载片经充分漂洗，加碱性磷酸酶(AKP)标记的羊抗地高辛(sheep anti-Dig-AKP)Fab片段，37℃湿盒2h。以NBT/BCIP为显色系统，37℃湿盒内显色1～6h，核固红衬染2min，脱水，封片。
2.5.5 结果判断：光镜下GM-CSF或IL-6 mRNA表达阳性细胞的胞浆中可见蓝紫色颗粒，胞核染成红色。每张涂片计数200个细胞中阳性细胞的百分比；反应强度依据胞浆中蓝紫色颗粒多少及颜色深浅分为强阳性(+++)、阳性(++)、弱阳性(+)和阴性(-)4级，分别计为3、2、1和0分。积分指数=阳性百分率×强度计分。
2.5.6 对照实验：实验设阴性对照包括：未加探针进行杂交；用RNase处理载片后再进行杂交。所有对照结果均为阴性。
结 果
1.TSPG对BPA生成的影响
, http://www.100md.com
经TSPG刺激制备的BMSCM、PMφCM和SPCM对BFU-E增殖的刺激活性显著高于对照组，其集落产率明显提高(表1)，提示TSPG可能促进BMSC、PMφ和SPC产生BPA。
表1 人参总皂甙对爆式红系集落促进因子生成的影响
Table 1 Effect of TSPG on production of burst promoting activity (BPA) 条件培养液
conditioned media
爆式集落促进活性(BFU-E/5×104BMC)
BPA(BFU-E/5×104BMC)
对照组
, http://www.100md.com
control group
人参总皂甙组
TSPG group
骨髓基质细胞条件培养液
20.7±6.0
30.3±6.7*
BMSCM
(n=15)
(n=15)
腹腔巨噬细胞条件培养液
42.3±6.7
, 百拇医药 53.1±9.3*
PMφCM
(n=21)
(n=21)
脾细胞条件培养液
43.9±6.3
56.3±6.4*
SPCM
(n=21)
(n=21)
*,P<0.001，与对照组比
*,compared with control group. P<0.0012.TSPG对GM-CSA生成的影响
, 百拇医药
经TSPG刺激制备的BMSCM、PMφCM和SPCM对CFU-GM增殖的刺激活性明显高于对照组(表2)，提示TSPG可能诱导和促进BMSC、PMφ和SPC产生GM-CSA。
表2 人参总皂甙对粒-巨噬细胞集落刺激因子活性生成的影响
Table 2 Effect of TSPG on production of granulocyte-macrophage colony-stimulating activity(GM-CSA) 条件培养液
conditioned media
粒-巨噬细胞集落刺激活性
(CFU-GM/5×104BMC)
GM-CSA(CFU-GM/5×104BMC)
, 百拇医药
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
骨髓基质细胞条件培养液
21.5±5.9
36.6±8.9*
BMSCM
(n=17)
(n=17)
腹腔巨噬细胞条件培养液
69.4±7.8
, 百拇医药
81.8±6.3*
PMφCM
(n=21)
(n=21)
脾细胞条件培养液
61.1±4.6
78.9±5.3*
SPCM
(n=14)
(n=14)
*,P<0.001，与对照组比
, 百拇医药 *,Compared with control group. P<0.0013.TSPG对MK-CSA生成的影响
经TSPG刺激制备的BMSCM、PMφCM和SPCM对CFU-MK集落形成的刺激活性明显高于对照组(表3)，提示TSPG可能诱导和促进BMSC、PMφ和SPC分泌MK-CSA。
表3 人参总皂甙对巨核细胞集落刺激因子活性生成的影响
Table 3 Effect of TSPG on production of megakaryocytecolony-stimulating activity (MK-CSA) 条件培养液
conditioned media
巨核细胞集落刺激活性
, http://www.100md.com (CFU-MK/1×105BMC)
MK-CSA(CFU-MK/1×105BMC)
对照组
control group
TSPG组
TSPG group
骨髓基质细胞条件培养液
5.8±2.9
8.9±3.0#
BMSCM
(n=12)
, 百拇医药
(n=12)
腹腔巨噬细胞条件培养液
3.6±1.3
7.1±1.7*
PMφCM
(n=16)
(n=16)
脾细胞条件培养液
5.8±1.7
9.4±1.9*
SPCM
(n=16)
, 百拇医药
(n=16)
＃,P<0.05，*P<0.001，与对照组比
Compared with control group, #，P<0.05，*,P<0.001
4. TSPG对GM-CSFmRNA表达的影响
核酸原位杂交显示正常静止状态下BMSC、PMφ和SPC的GM-CSF mRNA表达水平较低；经TSPG诱导后，上述细胞GM-CSF mRNA表达阳性率和表达阳性强度积分值均显著提高(表4，图1～4)，提示TSPG能诱导和促进GM-CSF mRNA的表达。
表4 人参总皂甙对粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA的表达的影响
Table 4 Effect of TSPG on expression of GM-CSF mRNA 细胞
, 百拇医药
cells
表达阳性率(%)
positive cell ratio(%)
积分指数
index
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
对照组
control group
人参总皂甙组
, 百拇医药
TSPG group
骨髓基质细胞
13.6±4.5
35.7±9.4*
0.18±0.07
0.73±0.28*
BMSC
腹腔巨噬细胞
33.1±7.4
45.6±8.7*
0.89±0.15
, 百拇医药
1.29±0.29*
PMφ
脾细胞
26.4±6.6
39.1±10.2*
0.48±0.11
0.89±0.16*
SPC
*,P<0.01，与对照组相比。
*, compared with control group, P<0.001
, http://www.100md.com 5. TSPG对IL-6 mRNA表达的影响
原位杂交结果显示正常静止状态下BMSC、PMφ和SPC胞浆内均有紫蓝色颗粒的IL-6 mRNA的阳性信号。经TSPG诱导后上述细胞IL-6 mRNA表达阳性细胞率和表达强度积分值均明显高于对照组(表5，图4～8)，提示TSPG能促进IL-6 mRNA的表达。
表5 人参总皂甙对白细胞介素-6mRNA表达的影响
Table 5 Effect of TSPG on expression of IL-6 mRNA 细胞
cells
表达阳性率(%)
positive cell ratio(%)
, 百拇医药
积分指数
index
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
对照组
control group
人参总皂甙组
TSPG group
骨髓基质细胞
35.3±6.4
, 百拇医药
58.5±7.9*
0.74±0.09
1.22±0.13
BMSC
腹腔巨噬细胞
63.6±12.5
72.1±13.2＃
1.37±0.23
1.82±0.26*
PMφ
脾细胞
, 百拇医药
41.8±9.2
61.3±10.4*
0.87±0.8
1.32±0.21*
SPC
#,P<0.05，*,P<0.01，与对照组相比
Compared with control group, #,P<0.05,*,P<0.001讨 论
从造血干细胞到造血祖细胞的增殖分化直至成熟血细胞的形成过程中，存在着多种造血生长因子(HGF)的网络性调控作用。早期发现的一些HGF又称集落刺激活性(colony-stimulating activity,CSA)。根据其刺激造血祖细胞所形成集落的细胞类型可以分为：刺激BFU-E形成爆式红系集落的BPA，刺激CFU-GM形成粒-巨噬细胞集落的GM-CSA和刺激CFU-MK形成巨核细胞集落的MK-CSA等类型[4，8]。我们既往工作证实：TSPG能促进小鼠造血祖细胞的增殖分化[2，3]，由于造血祖细胞的增殖与CSA的刺激作用有关，本研究采用造血祖细胞培养术，检测了经TSPG诱导后制备的BMSC、PMφ和SPC条件培养上清液中BPA、GM-CSA和MK-CSA活性，以探讨TSPG促进血细胞生成与CSA活性的关系。研究结果表明：经TSPG诱导制备的BMSCM、PMΦCM和SPCM能显著提高BFU-E、CFU-GM和CFU-MK的集落产率。提示TSPG能诱导和促进BMSC、PMΦ和SPC产生BPA、GM-CSA和MK-CSA等造血细胞集落刺激活性，以促进造血祖细胞的体外增殖与集落形成。
, http://www.100md.com
CSA检测仅反映了上述细胞条件培养液所含HGF的生物学活性，即对相应造血祖细胞增殖与分化的刺激活性[4]。由于CSA并非均一的造血生长因子[8，9]，而且HGF本身也有其多效性(pleiotropy)和丰富性(redundancy)的特点，为进一步阐明TSPG能诱导和影响哪些具体的HGF表达，本研究用经地高辛标记的GM-CSF和IL-6 cDNA探针，通过核酸原位杂交技术，检测了在有或无TSPG刺激条件下，BMSC、PMφ和SPC细胞GM-CSF和IL-6 mRNA的表达水平。原位杂交结果显示：经TSPG诱导后BMSC、PMφ和SPC的GM-CSF和IL-6 mRNA表达阳性率和强度积分值均显著高于对照组，提示TSPG能促进GM-CSF和IL-6 mRNA的表达。GM-CSF是由激活的T淋巴细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等产生的分子量约为22kD的糖蛋白，能刺激CFU-GM、BFU-E和CFU-MK等多种造血祖细胞增殖，是对早期造血祖细胞具有广泛增殖促进活性的集落刺激因子[9]。IL-6除协同IL-3刺激早期造血祖细胞增殖外，尚能促进巨核细胞的成熟与血小板的生成[10]。现代研究认为：造血生长因子(HGF)与造血细胞膜上相应的HGF受体结合，启动调控信号向核内转导，引起核内某些基因转录增强或其他基因转录抑制，最终表现出蛋白合成改变，而导致细胞行为等变化。可见研究HGF的基因表达及调控能深入阐明造血调控的分子生物学机理。我们的研究结果提示：TSPG能促进BMSC、PMΦ和SPC细胞GM-CSF和IL-6基因的表达，表明TSPG促进血细胞生成与其诱导GM-CSF和IL-6基因表达，促进GM-CSF和IL-6等HGF的产生有密切关系。当然与造血调控有关的HGF还有很多，如红细胞生成素(Epo)，白细胞介素-3(IL-3)和血小板生成素(Tpo)等，此外还有相应HGF的受体。对此我们正在进行深入探讨，为阐明人参“补气生血”的现代生物学机理提供实验依据。
, 百拇医药
图版说明
图1 正常静止状态下骨髓基质细胞的粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达水平很低 ×200
图2 人参总皂甙诱导后24h，骨髓基质细胞粒-巨噬细胞集落刺激因子m RNA表达显著提高 ×400
图3 经人参总皂甙诱导后24h，腹腔巨噬细胞的粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达水平明显提高 ×400
图4 经人参总皂甙诱导后24h，脾细胞的粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达显著提高 ×600
图5 正常静止状态下骨髓基质细胞的IL-6 mRNA表达较低 ×450
图6 经人参总皂甙诱导后24h，骨髓基质细胞的IL-6 mRNA表达提高 ×600
, 百拇医药
图7 经人参总皂甙诱导后24h，腹腔巨噬细胞的IL-6 mRNA表达明显提高 ×400
图8 人参总皂甙诱导24h，脾细胞的IL-6 mRNA表达显著增加 ×450
Explanation of figures
Fig.1 Weakened GM-CSF mRNA expression of bone marrow stromal cell in control group. ×200
Fig.2 Remarkedly increased GM-CSF mRNA expression of bone marrow stromal cell after induced with TSPG for 24hr. ×400
Fig.3 Obviously promoted GM-CSF mRNA expression of peritoneal macrophage after induced with TSPG for 24hr. ×400
, 百拇医药
Fig.4 GM-CSF mRNA expression of splenic cell is enhanced after induced with TSPG for 24hr. ×600
Fig.5 Weakened IL-6 mRNA expression of bone marrow stromal cell in the control group. ×450
Fig.6 Markedely promoted IL-6 mRNA expression of bone marrow stromal cells after treated with TSPG for 24hr. ×600
Fig.7 IL-6 mRNA expression of peritoneal macrophage is increased after treated with TSPG for 24hr. ×400
, http://www.100md.com
Fig.8 Remarkedly increased IL-6 mRNA expression of splenic cells after treated with TSPG for 24hr. ×450
*国家自然科学基金资助课题(No.39670880),重庆市中医药管理局资助课题
△ Department of Histology and Embryology, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China.
参考文献
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3 王勇，王亚平，祝彼得.人参总皂甙对小鼠造血细胞增殖的影响.解剖学杂志，1995，18(2)：153
4 王勇，祝彼得.造血祖细胞体外培养的实验研究和临床意义.国外医学输血与血液学分册，1994，17：89
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6 王亚平，王勇，姜蓉，等.人参总皂甙诱导造血生长因子生成的实验研究.解剖学报，1997，28(3)：304
, 百拇医药
7 王亚平，王勇，郑敏，等.地高辛标记cDNA探针检测GM-CSFmRNA表达.免疫学杂志，1999，15(3)：223
8 Wang SY, Ho CK, Chen LY, et al. The effect of lipopolysaccharide on the production of GM-EA, GM-CSA and PGE2 by human monocyte-derived lipid-containing macrophages. Exp Hematol, 1988,16(5):349
9 Sieff CA, Ekern SC, Nathan DG, et al. Combinations of recombinant colony-stimulating factors are required for optimal hematopoietic differentiation in serum-derived culture. Blood, 1988,73:(3)688
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收稿1998-10 修回1999-02, 百拇医药