检测中国对虾非包涵体型杆状病毒的PCR方法的建立
作者：徐洪涛 朴春爱 王雷 朱俊萍 董杰 王长安 相建海 金奇 侯云德
单位：徐洪涛 王雷 朱俊萍 相建海 侯云德 中国科学院海洋研究所，山东 青岛 266071；朴春爱 董杰 王长安 金奇 中国预防医学科学院病毒学研究所，北京 100052
关键词：中国对虾；白斑征杆状病毒(WSBV)；中国对虾非包涵体型杆状病毒(PcNOBV)；聚合酶链式反应；诊断
病毒学报990409 摘要：中国对虾非包涵体型杆状病毒(PcNOBV)是中国大陆养殖的中国对虾(Penaeus chinensis)暴发性流行病——白斑综合征的主要病原，与台湾流行的PmNOBⅢ、泰国的PmNOBⅡ及日本的RV-PJ(＝PRDV)有相似的致病特征、形态学及组织病理学特征。为了解PcNOBV与PmNOBⅢ两种地域分布邻近的毒株基因水平的关系，并建立早期、敏感、特异的检测技术，利用氯化铯密度梯度超速离心技术分离纯化了PcNOBV核衣壳，根据台湾地区分离的PmNOBⅢ的基因序列设计一对引物，从纯化的PcNOBV DNA及自然发病的中国对虾、日本对虾和斑节对虾组织DNA中成功地扩增出长为355bp的目的片段，可检测出3.4pg的PcNOBV DNA。从健康对虾组织提取的DNA未能扩增出目的片段。扩增片段序列与PmNOBⅢ相应的基因序列相同。该结果从分子水平证实PcNOBV与PmNOBⅢ存在基因同源性，同时表明聚合酶链式反应(PCR)可以作为检测PcNOBV的一种敏感、特异、早期、快速的诊断手段。
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分类号：S945.4 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0354-06
DEVELOPMENT OF POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY FOR DETECTION OF PENAEUS CHINENSIS NON-OCCLUDED BACULOVIRUS
XU Hong-tao1, PIAO Chun-ai2, WANG Lei1, ZHU Jun-ping1, DONG Jie2,WANG Chang-an2, XIANG Jian-hai1, JIN Qi2, HOU Yun-de2
(1 Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Shandong, Qingdao 266071, China;2 Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine ,Beijing 100052,China)
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Abstract：Penaeus chinensis non-occluded baculovirus(PcNOBV) is the causative agent of the widespread epizootic called white spot syndrome which has caused high shrimp mortality and great economic loss to Chinese shrimp industry. Preliminary research results indicated that PcNOBV belongs to members of white spot syndrome baculoviruses (WSBVs), representing a WSBV isolate from cultured P. chinensis in mainland China. It has been assumed that all of the WSBVs including PcNOBV isolated from P. chinensis in mainland China , PmNOBⅡ from P. monodon in Thailand, PmNOBⅢ from P. monodon and P. japonicus in Taiwan and RV-Pj(=PRDV)from P. japonicus in Japan are closely related and may represent different strains of a same virus. In order to obtain some information on the relationship between the two geographically adjacent PmNOBⅢ in Taiwan and PcNOBV in mainland China, a pair of primers producing 355bp amplification fragment was designed based on the sequence of PmNOBⅢ genome DNA SalⅠ fragment. The expected amplification product was obtained when DNA isolated from purified nucleocapsids of PcNOBV and DNAs from naturally diseased P. chinensis, P. japonicus and P. monodon tissues were used as templates. The detection limit of purified PcNOBV DNA is 3.4 pg. DNA isolated from healthy penaeid shrimps did not yield any amplification product. These results demonstrate that PcNOBV and PmNOBⅢ are homologous at least in part of the genome structure, and that this assay can be used for early, rapid, sensitive and specific detection of PcNOBV infection.
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Key words：Penaeus chinensis; Penaeus chinensis non-occuded baculovirus; White spot syndrome baculovirus; Polymerase chain reaction; Diagnosis
白斑征杆状病毒(White spot syndrome baculovirus，WSBV)已使亚洲地区对虾养殖业濒临绝境。养殖对虾白斑征最早于1992年发生于台湾[1]，随后于1993年春季日本养殖的日本对虾(P.japonicus)出现大量死亡[2]。中国大陆沿海地区养殖的中国对虾(P.chinensis)、日本对虾及斑节对虾(P.monodon)于1993年夏开始全面暴发白斑征。目前白斑征杆状病毒已遍布亚洲主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲[3，4]。根据所分离毒株的地域分布及原始宿主的不同，各研究者赋予WSBV各分离株不同的命名，包括：PmNOBⅡ[5]、PmNOBⅢ[6，7]、RV-Pj(＝PRDV)[8，9]及PcNOBV[10]。这些病毒所致疾病的共同特征为发病对虾甲壳呈明显白斑，数天内死亡率高达100%。初步研究结果提示，这些病毒可能属同一种病毒或一组密切相关的病毒毒株，因此倾向于将其统称为白斑征杆状病毒[11]。该病毒是目前所报道的所有对虾病毒中毒力最强、危害最大的一种且地域分布及宿主范围广泛，几乎侵染世界上目前所有主要对虾养殖品种，包括斑节对虾、日本对虾、中国对虾、印度对虾(P.indicus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、南美白对虾(P.vannamei)、红额角对虾(P.stylirostris)、褐对虾(P.aztecus)、桃红对虾(P.duorarum)及白对虾(P.setiferus)[12]。
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中国对虾是中国大陆主要的对虾养殖品种，约占85%；斑节对虾及日本对虾在部分地区也有养殖。自1993年以来连年暴发白斑病，已致重大经济损失。现已证实：PcNOBV(Penaeus chinensis nonoccluded baculovirus)是引起中国对虾暴发性白斑病的主要病原[10]。流行病学资料显示，中国大陆流行的PcNOBV感染暴发有从南到北发展的顺序。从发病时间及顺序分析，此病毒可能与台湾地区流行的PmNOBⅢ有一定关系。为研究二者的相互关系及建立敏感、特异、快速的基因诊断技术，根据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计一对引物，对纯化的PcNOBV DNA及自然发病的三种对虾组织DNA进行扩增，研究了这对引物扩增反应的特异性和敏感性，现将结果加以报道。
材料与方法
1 病虾标本 患白斑征中国对虾及日本对虾于1996年6月至8月收集于青岛地区发病虾场；发病斑节对虾于1996年9月收集于广西北海发病虾场。病虾标本冻存于-70℃。
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2 病毒核衣壳分离纯化 按前述方法[10]进行。
3 病毒基因组DNA提取 纯化病毒核衣壳悬液加蛋白酶K及Sarkosyl分别至0.3mg/ml及1%，56℃过夜；加NaCl至0.7mol/L及0.1倍体积CTAB/NaCl溶液，65℃水浴30分钟，酚、酚：氯仿及氯仿各抽提1次，乙醇沉淀，溶于TE，紫外分光光度计定量，存4℃用作PCR反应模板。
4 健康对虾基因组DNA提取 健康中国对虾、日本对虾及斑节对虾为本室虾贝遗传组所存，组织DNA按文献[13]所述真核细胞基因组DNA提取方法进行。
5 病虾组织PCR模板制备 剪取发病对虾鳃组织，加入适量消化液(50mol/L KCL，10mol/L Tris-HCL pH8.5，0.5%NP-40，0.5%Tween-20，0.1mg/ml蛋白酶K，1%Sarkosyl)，吹打混匀，65℃消化1小时，常规酚、酚：氯仿及氯仿抽提，乙醇沉淀，加TE，56℃助溶30分钟，存4℃备用。
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6 PCR扩增反应 引物设计依据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列合成，引物1：5＇-ATCAAGACTCGCCCTCTCCA-3＇， 引物2：5＇-GTTGTTCCAAAACATTAGCA-3＇扩增片段长度为355bp。50μl PCR反应混合物内含：引物各50pmol，dNTPs各250μmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，Taq DNA Polymerase 2μ，DNA适量。反应在PE-2400热循环仪上进行，循环参数为：94℃变性5分钟；94℃45秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，循环30次；94℃ 2分钟，55℃ 2分钟，72℃ 6分钟，循环1次。反应完毕取8μl进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下分析结果。
7 序列测定 PCR产物经纯化后连接到pGEMT 载体(Promega产品)，转化致敏菌DH5α，提取质粒DNA，由北京赛百盛生物工程公司进行DNA序列测定。
结果
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1 病毒核衣壳分离纯化
经氯化铯密度梯度离心后获得纯化的PcNOBV核衣壳(图1)，病毒包膜全部丢失，无细胞成分污染，用于病毒基因组DNA提取。
图1 氯化铯密度梯度纯化PcNOBV核衣壳PTA负染标本电镜照片(标尺＝100nm)
Figure 1 Electron micrograph of negatively PTA stained PcNOBV nucleocapsids purified by CsCl density gradient(Bar＝100nm)
2 PCR检测PcNOBV的特异性鉴定
分别以健康中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA，发病中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA为模板，经PCR反应扩增，结果显示，以发病中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA为模板，根据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计的引物成功地扩增出长355bp的特异性产物，而健康对虾组织DNA及无模板DNA PCR反应未检出目的扩增片段(图2)。同时对昆虫杆状病毒AcMNPV DNA进行扩增，结果也阴性。
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图2 PCR 检测PcNOBV DNA的特异性
a：pBR322HinfⅠ分子量标准；b：自然发病日本对虾组织DNA；c：自然发病斑节对虾组织DNA；d：无模板DNA；e：正常日本对虾组织DNA；f：正常斑节对虾组织DNA；g：正常中国对虾组织DNA；h：自然发病中国对虾组织DNA。
Figure 2 Specificity of PcNOBV DNA by PCR detection
a: pBR322 HinfⅠ marker; b: Tissue DNA of naturally diseased P.japoincus; c: Tissue DNA of naturally diseased P.monodon; d:No DNA template; e-g: DNA of healthy P. japonicus, P.monodon and P. chinensis; h:Tissue DNA of naturally diseased P. chinensis.
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以PcNOBV DNA为模板扩增的目的片段DNA序列测定结果，与PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段相应序列相同(图3)：
图3 扩增片段DNA序列
Figure 3 DNA sequence of the PCR product
3 PCR检测PcNOBV DNA的敏感性测定
将纯化的PcNOBV DNA溶液浓度调整至1.1μg/ml，按1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280进行系列稀释，各取2μl做模板进行PCR扩增；以健康中国对虾组织DNA及无模板DNA反应做阴性对照，结果见图4。以1：640稀释PcNOBV DNA(3.4pg)做模板，可见明显的特异扩增带，亮度较低倍稀释液做模板的产物带弱。
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图4 PCR检测PcNOBV DNA的敏感性
a：无模板DNA；b：pBR322HinfⅠ分子量标准；c-j：PcNOBV DNA系列稀释液(1：10～1：1280)；k：健康中国对虾组织DNA。
Figure 4 Sensitivity of purified PcNOBV DNA by PCR detection
a: No DNA template; b:pBR322 HinfⅠ marker; c-j: Serial dilutions of PcNOBV DNA (1:10-1:1280);k: Healthy P. chinensis genome DNA.
采用PCR方法经双盲法对健康对虾、试验感染对虾及池养对虾进行检测，并与DIG标记DNA探针杂交技术进行了比较，结果表明PCR方法可靠(另文报道)。
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讨论
进入90年代以来，白斑征杆状病毒感染已使包括中国大陆和台湾等地，以及日本、泰国、印尼、印度、菲律宾等国家的对虾养殖业出现危机，成为目前危害最大的一种对虾病毒。WSBV所致流行病最早于1992年初暴发于台湾南部地区养殖的日本对虾，1993年该地区养殖的斑节对虾及长毛对虾也暴发白斑征。中国大陆相似疾病最早见于1992年7月福建南部地区养殖的斑节对虾和长毛对虾，1993年沿海地区养殖对虾先后从南到北大面积暴发白斑征。日本相似疾病最早暴发于1993年春季，被认为是由于从中国福建引进日本对虾虾苗所致。泰国养殖的斑节对虾大面积暴发白斑征始于1994年底。PcMOBV与台湾地区流行的PmNOBⅢ地理分布相近，在致病性、流行特征、形态特征等方面有相似性[10]，可能属同一种病毒从南到北蔓延，逐渐流行于整个大陆沿海养殖区。
本文依据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计引物，从纯化的PcNOBV基因组DNA中成功地扩增出特异性目的片段，片段序列与PmNOBⅢ基因组DNA相应序列相同，从基因水平证实二者的基因组至少有部分同源性，为这一假设提供了证据。结合发病时间及顺序等资料分析，日本流行的RV-Pj也应与PcNOBV及PmNOBⅢ有同源性。由于无法得到其它毒株的DNA标本，尚不能对多毒株进行比较分析。目前所有对虾病毒均未被ICTV进行分类定位，PcNOBV、PmNOBⅡ、PmNOBⅢ及RV-Pj(＝PRDV)等于不同地域及不同宿主中分离的WSBV之间的具体关系及分类定位，尚有待补充更多的资料特别是有关基因组结构研究的资料才能确定。我们正在进行PcNOBV的基因组克隆及序列测定，其它相关毒株的基因组文库构建及序列测定工作也正在不同国家和地区的实验室分别进行。积累更多的基因序列资料将对阐明这些相关病毒的关系、分类及起源有重要意义。
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对虾病毒的诊断技术大多依赖于临床病症、光镜组织病理及电子显微镜技术，这些技术具有敏感性及特异性差、耗时、价昂、取材常致对虾死亡等缺点。近年来核酸探针杂交技术已用于对虾细小病毒的检测并在美国已有商品试剂盒出售[3]。PCR技术以其高度敏感性、特异性及技术操作简易而广泛应用于医学及动物病毒的诊断[14]。本文采用氯化铯密度梯度超速离心技术，从发病中国对虾中分离纯化获得高纯度的PcNOBV核衣壳，用以提取病毒基因组DNA。所设计引物从纯化PcNOBV DNA中成功扩增出特异性目的片段，检测敏感度为3.4pg PcNOBV DNA；从三种患病对虾鳃组织制备的模板DNA也扩增出特异性目的片段，而正常对虾组织DNA未扩增出相应产物，表明所建立的方法是敏感而特异的，可以进行PcNOBV及PmNOBⅢ感染的检测和诊断，用于发现病毒携带者、对虾苗及种虾病毒检测、早期发现受染对虾。这对及时采取综合措施、有效防治虾病暴发有重要意义，同时也为虾苗及种虾的进出口检疫提供了有效手段，防止带毒种虾及虾苗的广泛播散。剪取少量鳃组织用于模板制备，不会使对虾死亡，因此非常适用于宝贵种苗的病毒检测。PCR用于临床标本的检测，有效的模板制备至关重要。海洋生物体内存在抑制PCR DNA聚合酶的不明成份，虾组织内的抑制成分可能为多酚类化合物或色素，酚、氯仿抽提法基本可以去除这些影响成分[15]。但作为PCR诊断试剂盒来应用，尚需对大量临床标本进行检测验证，对抑制成分的去除应做更深入的研究。
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基金项目：海洋“863”；中国科学院EMBL开放课题；病毒基因工程国家重点实验室客座课题。
作者简介：徐洪涛(1965-)，男，医学博士，研究方向：海洋病毒学。
参考文献
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13 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T(eds). Molecular Cloning: A Laboratory Manual[M]. 2nd ed. New York, Cold Spring. Harbor: CSH Laboratory Press, 1989.
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15 Wang S Y, Hong C, Lotz J M. The development of a PCR procedure for the detection of Baculovirus penaei in shrimp [J]. Dis Aquat Org, 1996, 25:123-131.
来搞日期：1998-06-10；修回日期：1998-07-13, 百拇医药
单位：徐洪涛 王雷 朱俊萍 相建海 侯云德 中国科学院海洋研究所，山东 青岛 266071；朴春爱 董杰 王长安 金奇 中国预防医学科学院病毒学研究所，北京 100052
关键词：中国对虾；白斑征杆状病毒(WSBV)；中国对虾非包涵体型杆状病毒(PcNOBV)；聚合酶链式反应；诊断
病毒学报990409 摘要：中国对虾非包涵体型杆状病毒(PcNOBV)是中国大陆养殖的中国对虾(Penaeus chinensis)暴发性流行病——白斑综合征的主要病原，与台湾流行的PmNOBⅢ、泰国的PmNOBⅡ及日本的RV-PJ(＝PRDV)有相似的致病特征、形态学及组织病理学特征。为了解PcNOBV与PmNOBⅢ两种地域分布邻近的毒株基因水平的关系，并建立早期、敏感、特异的检测技术，利用氯化铯密度梯度超速离心技术分离纯化了PcNOBV核衣壳，根据台湾地区分离的PmNOBⅢ的基因序列设计一对引物，从纯化的PcNOBV DNA及自然发病的中国对虾、日本对虾和斑节对虾组织DNA中成功地扩增出长为355bp的目的片段，可检测出3.4pg的PcNOBV DNA。从健康对虾组织提取的DNA未能扩增出目的片段。扩增片段序列与PmNOBⅢ相应的基因序列相同。该结果从分子水平证实PcNOBV与PmNOBⅢ存在基因同源性，同时表明聚合酶链式反应(PCR)可以作为检测PcNOBV的一种敏感、特异、早期、快速的诊断手段。
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分类号：S945.4 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0354-06
DEVELOPMENT OF POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY FOR DETECTION OF PENAEUS CHINENSIS NON-OCCLUDED BACULOVIRUS
XU Hong-tao1, PIAO Chun-ai2, WANG Lei1, ZHU Jun-ping1, DONG Jie2,WANG Chang-an2, XIANG Jian-hai1, JIN Qi2, HOU Yun-de2
(1 Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Shandong, Qingdao 266071, China;2 Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine ,Beijing 100052,China)
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Abstract：Penaeus chinensis non-occluded baculovirus(PcNOBV) is the causative agent of the widespread epizootic called white spot syndrome which has caused high shrimp mortality and great economic loss to Chinese shrimp industry. Preliminary research results indicated that PcNOBV belongs to members of white spot syndrome baculoviruses (WSBVs), representing a WSBV isolate from cultured P. chinensis in mainland China. It has been assumed that all of the WSBVs including PcNOBV isolated from P. chinensis in mainland China , PmNOBⅡ from P. monodon in Thailand, PmNOBⅢ from P. monodon and P. japonicus in Taiwan and RV-Pj(=PRDV)from P. japonicus in Japan are closely related and may represent different strains of a same virus. In order to obtain some information on the relationship between the two geographically adjacent PmNOBⅢ in Taiwan and PcNOBV in mainland China, a pair of primers producing 355bp amplification fragment was designed based on the sequence of PmNOBⅢ genome DNA SalⅠ fragment. The expected amplification product was obtained when DNA isolated from purified nucleocapsids of PcNOBV and DNAs from naturally diseased P. chinensis, P. japonicus and P. monodon tissues were used as templates. The detection limit of purified PcNOBV DNA is 3.4 pg. DNA isolated from healthy penaeid shrimps did not yield any amplification product. These results demonstrate that PcNOBV and PmNOBⅢ are homologous at least in part of the genome structure, and that this assay can be used for early, rapid, sensitive and specific detection of PcNOBV infection.
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Key words：Penaeus chinensis; Penaeus chinensis non-occuded baculovirus; White spot syndrome baculovirus; Polymerase chain reaction; Diagnosis
白斑征杆状病毒(White spot syndrome baculovirus，WSBV)已使亚洲地区对虾养殖业濒临绝境。养殖对虾白斑征最早于1992年发生于台湾[1]，随后于1993年春季日本养殖的日本对虾(P.japonicus)出现大量死亡[2]。中国大陆沿海地区养殖的中国对虾(P.chinensis)、日本对虾及斑节对虾(P.monodon)于1993年夏开始全面暴发白斑征。目前白斑征杆状病毒已遍布亚洲主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲[3，4]。根据所分离毒株的地域分布及原始宿主的不同，各研究者赋予WSBV各分离株不同的命名，包括：PmNOBⅡ[5]、PmNOBⅢ[6，7]、RV-Pj(＝PRDV)[8，9]及PcNOBV[10]。这些病毒所致疾病的共同特征为发病对虾甲壳呈明显白斑，数天内死亡率高达100%。初步研究结果提示，这些病毒可能属同一种病毒或一组密切相关的病毒毒株，因此倾向于将其统称为白斑征杆状病毒[11]。该病毒是目前所报道的所有对虾病毒中毒力最强、危害最大的一种且地域分布及宿主范围广泛，几乎侵染世界上目前所有主要对虾养殖品种，包括斑节对虾、日本对虾、中国对虾、印度对虾(P.indicus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、南美白对虾(P.vannamei)、红额角对虾(P.stylirostris)、褐对虾(P.aztecus)、桃红对虾(P.duorarum)及白对虾(P.setiferus)[12]。
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中国对虾是中国大陆主要的对虾养殖品种，约占85%；斑节对虾及日本对虾在部分地区也有养殖。自1993年以来连年暴发白斑病，已致重大经济损失。现已证实：PcNOBV(Penaeus chinensis nonoccluded baculovirus)是引起中国对虾暴发性白斑病的主要病原[10]。流行病学资料显示，中国大陆流行的PcNOBV感染暴发有从南到北发展的顺序。从发病时间及顺序分析，此病毒可能与台湾地区流行的PmNOBⅢ有一定关系。为研究二者的相互关系及建立敏感、特异、快速的基因诊断技术，根据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计一对引物，对纯化的PcNOBV DNA及自然发病的三种对虾组织DNA进行扩增，研究了这对引物扩增反应的特异性和敏感性，现将结果加以报道。
材料与方法
1 病虾标本 患白斑征中国对虾及日本对虾于1996年6月至8月收集于青岛地区发病虾场；发病斑节对虾于1996年9月收集于广西北海发病虾场。病虾标本冻存于-70℃。
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2 病毒核衣壳分离纯化 按前述方法[10]进行。
3 病毒基因组DNA提取 纯化病毒核衣壳悬液加蛋白酶K及Sarkosyl分别至0.3mg/ml及1%，56℃过夜；加NaCl至0.7mol/L及0.1倍体积CTAB/NaCl溶液，65℃水浴30分钟，酚、酚：氯仿及氯仿各抽提1次，乙醇沉淀，溶于TE，紫外分光光度计定量，存4℃用作PCR反应模板。
4 健康对虾基因组DNA提取 健康中国对虾、日本对虾及斑节对虾为本室虾贝遗传组所存，组织DNA按文献[13]所述真核细胞基因组DNA提取方法进行。
5 病虾组织PCR模板制备 剪取发病对虾鳃组织，加入适量消化液(50mol/L KCL，10mol/L Tris-HCL pH8.5，0.5%NP-40，0.5%Tween-20，0.1mg/ml蛋白酶K，1%Sarkosyl)，吹打混匀，65℃消化1小时，常规酚、酚：氯仿及氯仿抽提，乙醇沉淀，加TE，56℃助溶30分钟，存4℃备用。
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6 PCR扩增反应 引物设计依据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列合成，引物1：5＇-ATCAAGACTCGCCCTCTCCA-3＇， 引物2：5＇-GTTGTTCCAAAACATTAGCA-3＇扩增片段长度为355bp。50μl PCR反应混合物内含：引物各50pmol，dNTPs各250μmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，Taq DNA Polymerase 2μ，DNA适量。反应在PE-2400热循环仪上进行，循环参数为：94℃变性5分钟；94℃45秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，循环30次；94℃ 2分钟，55℃ 2分钟，72℃ 6分钟，循环1次。反应完毕取8μl进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下分析结果。
7 序列测定 PCR产物经纯化后连接到pGEMT 载体(Promega产品)，转化致敏菌DH5α，提取质粒DNA，由北京赛百盛生物工程公司进行DNA序列测定。
结果
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1 病毒核衣壳分离纯化
经氯化铯密度梯度离心后获得纯化的PcNOBV核衣壳(图1)，病毒包膜全部丢失，无细胞成分污染，用于病毒基因组DNA提取。
图1 氯化铯密度梯度纯化PcNOBV核衣壳PTA负染标本电镜照片(标尺＝100nm)
Figure 1 Electron micrograph of negatively PTA stained PcNOBV nucleocapsids purified by CsCl density gradient(Bar＝100nm)
2 PCR检测PcNOBV的特异性鉴定
分别以健康中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA，发病中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA为模板，经PCR反应扩增，结果显示，以发病中国对虾、日本对虾及斑节对虾组织DNA为模板，根据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计的引物成功地扩增出长355bp的特异性产物，而健康对虾组织DNA及无模板DNA PCR反应未检出目的扩增片段(图2)。同时对昆虫杆状病毒AcMNPV DNA进行扩增，结果也阴性。
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图2 PCR 检测PcNOBV DNA的特异性
a：pBR322HinfⅠ分子量标准；b：自然发病日本对虾组织DNA；c：自然发病斑节对虾组织DNA；d：无模板DNA；e：正常日本对虾组织DNA；f：正常斑节对虾组织DNA；g：正常中国对虾组织DNA；h：自然发病中国对虾组织DNA。
Figure 2 Specificity of PcNOBV DNA by PCR detection
a: pBR322 HinfⅠ marker; b: Tissue DNA of naturally diseased P.japoincus; c: Tissue DNA of naturally diseased P.monodon; d:No DNA template; e-g: DNA of healthy P. japonicus, P.monodon and P. chinensis; h:Tissue DNA of naturally diseased P. chinensis.
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以PcNOBV DNA为模板扩增的目的片段DNA序列测定结果，与PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段相应序列相同(图3)：
图3 扩增片段DNA序列
Figure 3 DNA sequence of the PCR product
3 PCR检测PcNOBV DNA的敏感性测定
将纯化的PcNOBV DNA溶液浓度调整至1.1μg/ml，按1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280进行系列稀释，各取2μl做模板进行PCR扩增；以健康中国对虾组织DNA及无模板DNA反应做阴性对照，结果见图4。以1：640稀释PcNOBV DNA(3.4pg)做模板，可见明显的特异扩增带，亮度较低倍稀释液做模板的产物带弱。
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图4 PCR检测PcNOBV DNA的敏感性
a：无模板DNA；b：pBR322HinfⅠ分子量标准；c-j：PcNOBV DNA系列稀释液(1：10～1：1280)；k：健康中国对虾组织DNA。
Figure 4 Sensitivity of purified PcNOBV DNA by PCR detection
a: No DNA template; b:pBR322 HinfⅠ marker; c-j: Serial dilutions of PcNOBV DNA (1:10-1:1280);k: Healthy P. chinensis genome DNA.
采用PCR方法经双盲法对健康对虾、试验感染对虾及池养对虾进行检测，并与DIG标记DNA探针杂交技术进行了比较，结果表明PCR方法可靠(另文报道)。
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讨论
进入90年代以来，白斑征杆状病毒感染已使包括中国大陆和台湾等地，以及日本、泰国、印尼、印度、菲律宾等国家的对虾养殖业出现危机，成为目前危害最大的一种对虾病毒。WSBV所致流行病最早于1992年初暴发于台湾南部地区养殖的日本对虾，1993年该地区养殖的斑节对虾及长毛对虾也暴发白斑征。中国大陆相似疾病最早见于1992年7月福建南部地区养殖的斑节对虾和长毛对虾，1993年沿海地区养殖对虾先后从南到北大面积暴发白斑征。日本相似疾病最早暴发于1993年春季，被认为是由于从中国福建引进日本对虾虾苗所致。泰国养殖的斑节对虾大面积暴发白斑征始于1994年底。PcMOBV与台湾地区流行的PmNOBⅢ地理分布相近，在致病性、流行特征、形态特征等方面有相似性[10]，可能属同一种病毒从南到北蔓延，逐渐流行于整个大陆沿海养殖区。
本文依据PmNOBⅢ基因组SalⅠ片段序列设计引物，从纯化的PcNOBV基因组DNA中成功地扩增出特异性目的片段，片段序列与PmNOBⅢ基因组DNA相应序列相同，从基因水平证实二者的基因组至少有部分同源性，为这一假设提供了证据。结合发病时间及顺序等资料分析，日本流行的RV-Pj也应与PcNOBV及PmNOBⅢ有同源性。由于无法得到其它毒株的DNA标本，尚不能对多毒株进行比较分析。目前所有对虾病毒均未被ICTV进行分类定位，PcNOBV、PmNOBⅡ、PmNOBⅢ及RV-Pj(＝PRDV)等于不同地域及不同宿主中分离的WSBV之间的具体关系及分类定位，尚有待补充更多的资料特别是有关基因组结构研究的资料才能确定。我们正在进行PcNOBV的基因组克隆及序列测定，其它相关毒株的基因组文库构建及序列测定工作也正在不同国家和地区的实验室分别进行。积累更多的基因序列资料将对阐明这些相关病毒的关系、分类及起源有重要意义。
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对虾病毒的诊断技术大多依赖于临床病症、光镜组织病理及电子显微镜技术，这些技术具有敏感性及特异性差、耗时、价昂、取材常致对虾死亡等缺点。近年来核酸探针杂交技术已用于对虾细小病毒的检测并在美国已有商品试剂盒出售[3]。PCR技术以其高度敏感性、特异性及技术操作简易而广泛应用于医学及动物病毒的诊断[14]。本文采用氯化铯密度梯度超速离心技术，从发病中国对虾中分离纯化获得高纯度的PcNOBV核衣壳，用以提取病毒基因组DNA。所设计引物从纯化PcNOBV DNA中成功扩增出特异性目的片段，检测敏感度为3.4pg PcNOBV DNA；从三种患病对虾鳃组织制备的模板DNA也扩增出特异性目的片段，而正常对虾组织DNA未扩增出相应产物，表明所建立的方法是敏感而特异的，可以进行PcNOBV及PmNOBⅢ感染的检测和诊断，用于发现病毒携带者、对虾苗及种虾病毒检测、早期发现受染对虾。这对及时采取综合措施、有效防治虾病暴发有重要意义，同时也为虾苗及种虾的进出口检疫提供了有效手段，防止带毒种虾及虾苗的广泛播散。剪取少量鳃组织用于模板制备，不会使对虾死亡，因此非常适用于宝贵种苗的病毒检测。PCR用于临床标本的检测，有效的模板制备至关重要。海洋生物体内存在抑制PCR DNA聚合酶的不明成份，虾组织内的抑制成分可能为多酚类化合物或色素，酚、氯仿抽提法基本可以去除这些影响成分[15]。但作为PCR诊断试剂盒来应用，尚需对大量临床标本进行检测验证，对抑制成分的去除应做更深入的研究。
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基金项目：海洋“863”；中国科学院EMBL开放课题；病毒基因工程国家重点实验室客座课题。
作者简介：徐洪涛(1965-)，男，医学博士，研究方向：海洋病毒学。
参考文献
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来搞日期：1998-06-10；修回日期：1998-07-13, 百拇医药