L-精氨酸及L-硝基精氨酸对缺氧肺动脉内皮细胞内皮素的影响
作者：魏琴 李万镇 黄丽英 杜军保
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：低氧；肺动脉；内皮；血管；内皮缩血管肽类
中华儿科杂志/980406
【摘要】 目的 探讨L-精氨酸(一氧化氮合成的前体物质)及L-硝基精氨酸(一氧化氮合酶抑制剂)对缺氧肺动脉内皮细胞内皮素-1分泌及基因表达的影响。方法 采用斑点杂交、Northern杂交及放射免疫分析，对常氧、缺氧、缺氧加L-精氨酸及缺氧加L-硝基精氨酸组的猪肺动脉内皮细胞进行了内皮素-1的测定。结果 缺氧能增加肺动脉内皮细胞的内皮素-1的分泌及基因表达，此作用能被L-精氨酸所抑制。L-硝基精氨酸能增加缺氧时肺动脉内皮细胞的内皮素-1分泌及基因表达。结论 本实验间接提示，一氧化氮对肺动脉内皮细胞内皮素-1的分泌及基因表达起调节作用。
, 百拇医药
Effect of L-Arg and L-NNA on endothelin gene expression and secretion by porcine pulmonary artery endothelial cells under hypoxia
Wei Qin, Li Wanzhen, Huang Liying, et al.
Department of Pediatrics. The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To examine the effect of L-Arginine (L-arg), a precussor of nitric oxide, and N-nitro-L-arginine (L-NNA), an inhibitor of nitric oxide synthase, on endothelin-1 (ET-1) gene expression and secretion by porcine pulmonary artery endothelial cells (PAEC) under hypoxia. Methods The authors did dot blot hybridizationt, Northern blot and radioimmunoassy on cultured PAEC from pigs of control group, hypoxia group, hypoxia+L-arg group and hypoxia+L-NNA group. Results Hypoxia induced ET-1 gene expression and secretion in cultured PAEC were suppressed by L-arg but augmented by L-NNA under hypoxia. Conclusion Nitric oxide played a modulatory role in ET-1 gene expression and secretion by PAEC.
, 百拇医药
【Key words】 Anoxia Pulmonary artery Endothelium, vascular Endothelins
迄今为止，L-精氨酸(L-arg)及L-硝基精氨酸(L-NNA)对缺氧状态下的肺动脉内皮细胞内皮素(ET-1)分泌及基因表达的影响尚未阐明。我们采用肺动脉内皮细胞进行斑点杂交、Northern杂交及放射免疫分析，探讨L-arg及L-NNA对肺动脉内皮细胞ET-1分泌及基因表达的调节作用，从而为缺氧性肺动脉高压的形成机制及其治疗途径提供理论依据。
材料及方法
一、材料
1.猪肺动脉：由北京第一肉联厂提供。
2.内皮细胞培养和制备：用Hank液反复冲洗干净后，管腔内灌入0.1%胶原酶，37℃消化15分钟，离心消化液收集细胞。用含20%胎牛血清的M-199培养液进行原代培养。待细胞铺满瓶底并被鉴定为内皮细胞后进行传代培养。内皮细胞的鉴定根据：倒置相差显微镜下观察培养细胞呈单层铺路石子状镶嵌排列；Ⅷ因子免疫荧光检查呈强阳性反应；透视电镜见细胞含有Weibel-Palade小体，证实为内皮细胞。
, 百拇医药
3.实验分组：将8～12代内皮细胞制成1×105/ml细胞悬液，以每孔1 ml细胞悬液接种于24孔培养版上。待细胞铺满孔底后，用无血清M-199培养液取代20%胎牛血清M-199培养液，培养24小时。实验共分4组：对照(常氧)组，缺氧组，缺氧+L-arg组及缺氧+L-NNA组。实验中L-arg浓度为10-3 mol/L，L-NNA浓度为2.5×10-3 mol/L。
二、方法
1.缺氧方法：缺氧装置为自控密闭有机玻璃小舱。将小舱置于37℃水浴箱中，并通入95%氮气+5%二氧化碳混合气体。用CY-2型测氧装置测得小舱内氧气浓度维持在2%。
2.ET-1含量测定：将需缺氧条件的各组细胞均置入缺氧小舱内24小时，然后收集培养液，离心取上清液采用放射免疫分析法测定ET-1含量。
, 百拇医药
3.ET基因表达的测定：(1)探针制备：质粒Bluescript ET-1，经氨苄抗性筛选，转入受体菌DH5α，经裂解，纯化，ECORI酶切后收得Prepro ET-1，为1.1 kb。杂交时采用随机引物标记法标记探针。(2)测定方法：实验分组同前，进行缺氧及药物刺激后，取107内皮细胞，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿方法提取总RNA，然后用斑点杂交和Northern杂交检测mRNA含量。斑点杂交的浓度为15 μg，用点膜器在尼龙膜上直接点样。Northern杂交用30μg总RNA，先在1%琼酯糖凝胶中电泳，再用虹吸法转移至尼龙膜上。80℃烤膜2小时后与斑点杂交一样，与标记探针进行杂交，最后置-70℃进行放射自显影。用计算机图象分析仪检测mRNA的相对量。
三、统计学方法
应用方差分析对四组间内皮细胞分泌ET-1含量进行分析。
结果
, 百拇医药
一、各组内皮细胞分泌ET-1含量测定
缺氧组ET-1分泌高于对照(常氧)组(P<0.05)。缺氧组、缺氧+L-arg组及缺氧+L-NNA组之间ET-1分泌量差异有非常显著意义(F=51.39，P<0.001)。缺氧+L-arg组ET-1分泌量明显低于缺氧组，而缺氧+L-NNA组ET-1分泌量明显高于缺氧组(表1)。
表1 各组内皮细胞分泌的ET-1含量△(单位：pg) 组别
例数
ET-1
对照(常氧)组
8
321±21
, http://www.100md.com
缺氧组
7
488±44*
缺氧+L-Arg组
7
355±31**
缺氧+L-NNA组
7
632±86**
注：△ 为105个内皮细胞在24小时内产生的ET-1量；与对照组相比 * P<0.05；与缺氧组相比 ** P<0.01
, 百拇医药
二、斑点印迹杂交结果
缺氧后ET-1 mRNA表达较对照(常氧)组增高；缺氧+L-NNA组ET-1 mRNA表达较缺氧组增高(表2)。
三、Northern印迹杂交结果
缺氧后ET-1 mRNA表达较对照(常氧)组增高；缺氧+L-arg组ET-1 mRNA表达较缺氧组降低；缺氧+L-NNA组ET-1 mRNA表达较缺氧组增高(表2)。表2 各组斑点杂交及Northern杂交检测
ET-1 mRNA相对水平 组别
斑点杂交
Northern杂交
对照(常氧)组
, 百拇医药
4.28
21.42
缺氧组
6.44
29.17
缺氧+L-arg组
23.34
缺氧+L-NNA组
17.32
38.66
讨论
整体和离体动物实验证明：缺氧能明显促进ET的分泌[1～3]，然而缺氧对体外培养的内皮细胞ET的分泌与ET基因表达的影响却有不同的报道[2，4]。我们的实验结果表明：缺氧能直接刺激猪肺动脉内皮细胞ET的分泌及ET基因的表达。缺氧引起ET分泌及ET基因表达增加的机制是一个相当复杂的过程。缺氧可促进某些原癌基因C-fos、C-Jun的表达，其表达产物作用于ET基因上顺式作用元件AP1位点，从而使ET基因表达增加。另外，缺氧可直接作用于内皮细胞，兴奋其钙信使系统，从而使ET基因表达增加[5，6]。
, http://www.100md.com
L-arg在一氧化氮合酶(NOS)的作用下可生成NO。我们以往的整体动物实验研究表明：L-arg能使缺氧时升高的肺动脉压降低[7]。通过本实验发现，L-arg能抑制缺氧诱发的体外培养肺动脉内皮细胞的ET-1分泌及其基因的表达，表明NO能对ET-1的产生起调节作用。
本实验结果表明：L-NNA作为NOS抑制剂，能通过抑制缺氧下NO的合成，从而增加肺动脉内皮细胞ET的分泌及ET基因的表达；并表明缺氧与L-NNA对ET的分泌及基因的表达具有叠加效应。
参考文献
1 Hassoun PM, Thapha V, Landman M, et al. Endothelin 1: mitogenic activity on pulmonary artery smooth muscle cells and release from hypoxic endothelial cells. Proc Soc Exp Biol Med, 1992, 199:165-170.
, 百拇医药
2 Wiebke JL, Zeitlin PL, Guggino WB, et al. Effect of hypoxia on endothelin-1 production by pulmonary vascular endothelial cells. Biochem Biophy Acta, 1992, 1134:105-111.
3 陈霞，黄丽英，李万镇，等.缺氧性肺动脉高压大鼠内皮素的变化.中华医学杂志，1993，73：400-402.
4 Kourembanas S, Marsden PA, Mcquillan LP, et al. Hypoxia induces endothelin gene expression and secretion in culture human endothelium. J Clin Invest, 1991, 88:1054-1057.
, http://www.100md.com 5 Morganti A, Giusani M, Ghio F, et al. Endothelin-releasing stimuli and calcium antagonists in normal and pathological conditions.J hypertension, 1994, 12(Suppl):S27-S31.
6 Luscher TF, Boulanger CM, Dohi Y, et al. Endothelium-derived contracting factors. Hypertension, 1992, 19:117-130.
7 杜军保，赵斌，黎文，等.L-精氨酸调节缺氧性肺动脉增压反应的实验研究.北京医科大学学报，1997，29：136-138., 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：低氧；肺动脉；内皮；血管；内皮缩血管肽类
中华儿科杂志/980406
【摘要】 目的 探讨L-精氨酸(一氧化氮合成的前体物质)及L-硝基精氨酸(一氧化氮合酶抑制剂)对缺氧肺动脉内皮细胞内皮素-1分泌及基因表达的影响。方法 采用斑点杂交、Northern杂交及放射免疫分析，对常氧、缺氧、缺氧加L-精氨酸及缺氧加L-硝基精氨酸组的猪肺动脉内皮细胞进行了内皮素-1的测定。结果 缺氧能增加肺动脉内皮细胞的内皮素-1的分泌及基因表达，此作用能被L-精氨酸所抑制。L-硝基精氨酸能增加缺氧时肺动脉内皮细胞的内皮素-1分泌及基因表达。结论 本实验间接提示，一氧化氮对肺动脉内皮细胞内皮素-1的分泌及基因表达起调节作用。
, 百拇医药
Effect of L-Arg and L-NNA on endothelin gene expression and secretion by porcine pulmonary artery endothelial cells under hypoxia
Wei Qin, Li Wanzhen, Huang Liying, et al.
Department of Pediatrics. The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To examine the effect of L-Arginine (L-arg), a precussor of nitric oxide, and N-nitro-L-arginine (L-NNA), an inhibitor of nitric oxide synthase, on endothelin-1 (ET-1) gene expression and secretion by porcine pulmonary artery endothelial cells (PAEC) under hypoxia. Methods The authors did dot blot hybridizationt, Northern blot and radioimmunoassy on cultured PAEC from pigs of control group, hypoxia group, hypoxia+L-arg group and hypoxia+L-NNA group. Results Hypoxia induced ET-1 gene expression and secretion in cultured PAEC were suppressed by L-arg but augmented by L-NNA under hypoxia. Conclusion Nitric oxide played a modulatory role in ET-1 gene expression and secretion by PAEC.
, 百拇医药
【Key words】 Anoxia Pulmonary artery Endothelium, vascular Endothelins
迄今为止，L-精氨酸(L-arg)及L-硝基精氨酸(L-NNA)对缺氧状态下的肺动脉内皮细胞内皮素(ET-1)分泌及基因表达的影响尚未阐明。我们采用肺动脉内皮细胞进行斑点杂交、Northern杂交及放射免疫分析，探讨L-arg及L-NNA对肺动脉内皮细胞ET-1分泌及基因表达的调节作用，从而为缺氧性肺动脉高压的形成机制及其治疗途径提供理论依据。
材料及方法
一、材料
1.猪肺动脉：由北京第一肉联厂提供。
2.内皮细胞培养和制备：用Hank液反复冲洗干净后，管腔内灌入0.1%胶原酶，37℃消化15分钟，离心消化液收集细胞。用含20%胎牛血清的M-199培养液进行原代培养。待细胞铺满瓶底并被鉴定为内皮细胞后进行传代培养。内皮细胞的鉴定根据：倒置相差显微镜下观察培养细胞呈单层铺路石子状镶嵌排列；Ⅷ因子免疫荧光检查呈强阳性反应；透视电镜见细胞含有Weibel-Palade小体，证实为内皮细胞。
, 百拇医药
3.实验分组：将8～12代内皮细胞制成1×105/ml细胞悬液，以每孔1 ml细胞悬液接种于24孔培养版上。待细胞铺满孔底后，用无血清M-199培养液取代20%胎牛血清M-199培养液，培养24小时。实验共分4组：对照(常氧)组，缺氧组，缺氧+L-arg组及缺氧+L-NNA组。实验中L-arg浓度为10-3 mol/L，L-NNA浓度为2.5×10-3 mol/L。
二、方法
1.缺氧方法：缺氧装置为自控密闭有机玻璃小舱。将小舱置于37℃水浴箱中，并通入95%氮气+5%二氧化碳混合气体。用CY-2型测氧装置测得小舱内氧气浓度维持在2%。
2.ET-1含量测定：将需缺氧条件的各组细胞均置入缺氧小舱内24小时，然后收集培养液，离心取上清液采用放射免疫分析法测定ET-1含量。
, 百拇医药
3.ET基因表达的测定：(1)探针制备：质粒Bluescript ET-1，经氨苄抗性筛选，转入受体菌DH5α，经裂解，纯化，ECORI酶切后收得Prepro ET-1，为1.1 kb。杂交时采用随机引物标记法标记探针。(2)测定方法：实验分组同前，进行缺氧及药物刺激后，取107内皮细胞，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿方法提取总RNA，然后用斑点杂交和Northern杂交检测mRNA含量。斑点杂交的浓度为15 μg，用点膜器在尼龙膜上直接点样。Northern杂交用30μg总RNA，先在1%琼酯糖凝胶中电泳，再用虹吸法转移至尼龙膜上。80℃烤膜2小时后与斑点杂交一样，与标记探针进行杂交，最后置-70℃进行放射自显影。用计算机图象分析仪检测mRNA的相对量。
三、统计学方法
应用方差分析对四组间内皮细胞分泌ET-1含量进行分析。
结果
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一、各组内皮细胞分泌ET-1含量测定
缺氧组ET-1分泌高于对照(常氧)组(P<0.05)。缺氧组、缺氧+L-arg组及缺氧+L-NNA组之间ET-1分泌量差异有非常显著意义(F=51.39，P<0.001)。缺氧+L-arg组ET-1分泌量明显低于缺氧组，而缺氧+L-NNA组ET-1分泌量明显高于缺氧组(表1)。
表1 各组内皮细胞分泌的ET-1含量△(单位：pg) 组别
例数
ET-1
对照(常氧)组
8
321±21
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缺氧组
7
488±44*
缺氧+L-Arg组
7
355±31**
缺氧+L-NNA组
7
632±86**
注：△ 为105个内皮细胞在24小时内产生的ET-1量；与对照组相比 * P<0.05；与缺氧组相比 ** P<0.01
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二、斑点印迹杂交结果
缺氧后ET-1 mRNA表达较对照(常氧)组增高；缺氧+L-NNA组ET-1 mRNA表达较缺氧组增高(表2)。
三、Northern印迹杂交结果
缺氧后ET-1 mRNA表达较对照(常氧)组增高；缺氧+L-arg组ET-1 mRNA表达较缺氧组降低；缺氧+L-NNA组ET-1 mRNA表达较缺氧组增高(表2)。表2 各组斑点杂交及Northern杂交检测
ET-1 mRNA相对水平 组别
斑点杂交
Northern杂交
对照(常氧)组
, 百拇医药
4.28
21.42
缺氧组
6.44
29.17
缺氧+L-arg组
23.34
缺氧+L-NNA组
17.32
38.66
讨论
整体和离体动物实验证明：缺氧能明显促进ET的分泌[1～3]，然而缺氧对体外培养的内皮细胞ET的分泌与ET基因表达的影响却有不同的报道[2，4]。我们的实验结果表明：缺氧能直接刺激猪肺动脉内皮细胞ET的分泌及ET基因的表达。缺氧引起ET分泌及ET基因表达增加的机制是一个相当复杂的过程。缺氧可促进某些原癌基因C-fos、C-Jun的表达，其表达产物作用于ET基因上顺式作用元件AP1位点，从而使ET基因表达增加。另外，缺氧可直接作用于内皮细胞，兴奋其钙信使系统，从而使ET基因表达增加[5，6]。
, http://www.100md.com
L-arg在一氧化氮合酶(NOS)的作用下可生成NO。我们以往的整体动物实验研究表明：L-arg能使缺氧时升高的肺动脉压降低[7]。通过本实验发现，L-arg能抑制缺氧诱发的体外培养肺动脉内皮细胞的ET-1分泌及其基因的表达，表明NO能对ET-1的产生起调节作用。
本实验结果表明：L-NNA作为NOS抑制剂，能通过抑制缺氧下NO的合成，从而增加肺动脉内皮细胞ET的分泌及ET基因的表达；并表明缺氧与L-NNA对ET的分泌及基因的表达具有叠加效应。
参考文献
1 Hassoun PM, Thapha V, Landman M, et al. Endothelin 1: mitogenic activity on pulmonary artery smooth muscle cells and release from hypoxic endothelial cells. Proc Soc Exp Biol Med, 1992, 199:165-170.
, 百拇医药
2 Wiebke JL, Zeitlin PL, Guggino WB, et al. Effect of hypoxia on endothelin-1 production by pulmonary vascular endothelial cells. Biochem Biophy Acta, 1992, 1134:105-111.
3 陈霞，黄丽英，李万镇，等.缺氧性肺动脉高压大鼠内皮素的变化.中华医学杂志，1993，73：400-402.
4 Kourembanas S, Marsden PA, Mcquillan LP, et al. Hypoxia induces endothelin gene expression and secretion in culture human endothelium. J Clin Invest, 1991, 88:1054-1057.
, http://www.100md.com 5 Morganti A, Giusani M, Ghio F, et al. Endothelin-releasing stimuli and calcium antagonists in normal and pathological conditions.J hypertension, 1994, 12(Suppl):S27-S31.
6 Luscher TF, Boulanger CM, Dohi Y, et al. Endothelium-derived contracting factors. Hypertension, 1992, 19:117-130.
7 杜军保，赵斌，黎文，等.L-精氨酸调节缺氧性肺动脉增压反应的实验研究.北京医科大学学报，1997，29：136-138., 百拇医药