川芎嗪对再灌注大鼠心肌细胞c-fos基因表达及凋亡的影响
作者：李源 段红 王天成 张珊红 龚卫琴
单位：李源(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；段红(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；王天成(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；张珊红(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；龚卫琴(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)
关键词：心肌缺血再灌注；c-fos基因；细胞调亡；川芎嗪
心脏杂志000319
摘 要：目的：观察川芎嗪(TMP)对心肌缺血再灌注(MIR)大鼠心肌c-fos基因表达及凋亡细胞的作用。方法：应用免疫组化法检测MIR不同时期心肌FOS蛋白的表达，并采用末端标记技术对心肌细胞凋亡数进行检测。结果：①对照组心肌无FOS蛋白表达，亦未见凋亡细胞出现。②与MIR组相比，TMP干预组心肌FOS蛋白的表达明显减弱(60 min分别为57±44个/片和6.4±3.2个/片，90 min分别为467±450个/片和171±160个/片，120 min分别为246±160个/片和130±121个/片，均P<0.05)，TUNEL阳性细胞数均明显减少(60 min分别为36.3±8.7个/片和24.7±7.2个/片,P<0.05; 120 min分别为48.0±23.8个/片和10.0±8.1个/片, P<0.01)。结论：MIR可诱导终末分化的心肌细胞高表达FOS蛋白及发生细胞凋亡；应用TMP可使缺血心肌细胞c-fos基因表达减弱及凋亡减轻。
, 百拇医药
中图分类号：R331.31 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)03-0213-03
Effects of tetramethylpyrazine on c-fos expression and apoptosis of myocardial cells in myocardial ischemic reperfusion in rats
LI Yuan, DUAN Hong, WANG Tian-cheng, ZHANG Shan-hong, GONG Wei-qin
(Department of Geriatrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi′an 710033,Shaanxi,China)
, 百拇医药
Abstract：AIM：To study the effects of tetramethylpyrazine (TMP) on c-fos expression and apoptosis of myocardial cells in myocardial ischemic reperfusion (MIR) in rats. METHODS：Coloring TDT-mediated dutp nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemical staining were used. RESULTS：①No blue apoptosis cells and FOS protein expression were found in non-ischemic myocardial tissues; ②Compared with those of MIR rats, the number of FOS immunoreactive positive cells in rats treated with TMP decreased significantly (from 57±44/section to 6.4±3.2/section, 467±450/section to 171±161/section and 246±160/section to 130±121/section respectively, P<0.05 ) in 60, 90 and 120 min and the number of TUNEL positive cells in rats treated with TMP also decreased significantly ( from 36.3±8.7/section to 24.7±7.2/section and 48.0±23.8/section to 10.0±8.1/section respectively, P<0.01) in 60 minutes and 120 minutes. CONCLUSION：Myocardial cells may induce apoptosis in MIR and apoptosis may be related to the increased c-fos expression. Administration of TMP can decrease the expression of c-fos and the apoptosis of myocardial cells in MIR.
, 百拇医药
Key words：myocardial ischemic reperfusion；c-fos expression；apoptosis；tetramethylpyrazine
大量动物实验已证实，缺血性心脏病中存在心肌细胞的凋亡，并认为心肌细胞的凋亡参与缺血后梗死灶的发展和梗死后心功能不全的发生[1]。然而有关干预心肌细胞凋亡的研究报导甚少。本研究观察川芎嗪(TMP)对心肌缺血再灌注(MIR)大鼠心肌细胞c-fos基因表达及凋亡的影响，探讨TMP防治心肌缺血的作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型 SD大鼠，均为雌性，体重200±15 g(由第四军医大学实验动物中心提供)。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，气管插管行正压人工呼吸。开胸暴露心脏，在距冠状动脉左前降支(LAD)根部2～3 mm处穿线阻断LAD 10 min，造成心肌缺血，然后去除穿线，恢复血流，造成MIR模型[2] 。假手术组所有操作同MIR大鼠，仅穿线不结扎LAD。实验过程中用RM6200型多导生理记录仪同步监视心电图，以出现ST段抬高或压低和/或T波高耸作为冠状动脉结扎成功指标。
, 百拇医药
1.2 实验分组及给药方法 将42只大鼠随机分为假手术组(n=6)，MIR组(60，90，120 min亚组)和TMP干预组(60，90，120 min亚组)，每亚组6只。TMP干预组在MIR动物模型上给药，TMP(50 mg/kg，北京第四制药厂)在再灌注前从尾静脉注入，MIR组再灌注前注入同等容量生理盐水。
1.3 免疫组织化学和原位末端标记技术 灌注实验结束后分别取结扎线以下缺血损伤区心肌组织，生理盐水冲净血液，吸干水分，立即置于40 g/L多聚甲醛液中固定过夜，石蜡包埋，切成5 μm切片。采用ABC法[3]，对FOS蛋白进行染色，TUNEL染色[4]显示凋亡细胞，TUNEL染色的阴性对照组用等量蒸馏水代替TdT酶。在光学显微镜下观察实验结果。
1.4 计算机辅助图像分析 染色结果用瑞士Leica公司Quontiment 570图像分析仪对FOS蛋白阳性细胞数和凋亡细胞数进行半定量分析。显微镜放大200倍，图像经过摄像机转变成电信号，再转换成可被计算机直接处理和储存的数字信号，并同时在监视器上显示。每张切片内、中、外层随机选取5个视野，进行着色细胞图像分析，计算均值。全部数据输入计算机，数据以
±s表示，统计学处理采用平方根变换后析因分析及两两显著性检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 TMP对MIR诱导的FOS蛋白表达的影响 假手术大鼠心肌组织中均未发现FOS蛋白表达，MIR与TMP干预MIR组大鼠缺血心肌均有FOS蛋白表达, 60 min出现，90 min达峰值, 120 min明显减少，但TMP干预组FOS蛋白阳性颗粒数目明显减少(表1)。
2.2 TMP对MIR诱导的细胞凋亡的影响 假手术组大鼠心肌组织未发现蓝色凋亡细胞， MIR与TMP干预组大鼠缺血心肌均有细胞调亡现象，但其凋亡细胞数有显著性差异(见图1,2)，与MIR大鼠相比, TMP干预组凋亡细胞明显减少, 60 min分别为36.3±8.7个/片和24.7±7.2个/片(P<0.05)，120 min分别为48.0±23.8个/片和10.0±8.1个/片(P<0.01)。
表 1 MIR和TMP组心肌FOS蛋白表达的比较(个/片) 组别
, 百拇医药
60 min
90 min
120 min
缺血再灌注组
57±44
467±450
246±160
川芎嗪干预组
6.4±3.2a
171±160a
130±121
与缺血再灌注组相同时间点的比较,aP<0.05。
, 百拇医药
图 1 再灌注120 min缺血心肌的TUNEL阳性细胞(×400)
图2 TMP干预再灌注120 min缺血心肌的TUNEL阳性细胞(×400)
3 讨论
最新研究表明，活体MIR和离体培养心肌细胞缺氧时均有细胞凋亡现象[5]，并认为细胞凋亡是有核细胞在外部的刺激下通过胞内信号转导启动自身内部的基因表达调控从而引发的连续性程序细胞死亡过程。本研究结果表明，MIR 60 min缺血心肌即出现细胞凋亡现象，而且细胞凋亡数随再灌注时间延长而增多，120 min时心肌凋亡细胞数最多，提示缺血心肌凋亡性损伤是一个不断发生的动态过程。与此同时，MIR 60 min缺血心肌表达FOS蛋白，90 min达高峰，结果表明心肌细胞凋亡的发生可能与c-fos基因高表达有一定关系。
, 百拇医药
缺血心肌可出现凋亡现象，心肌细胞的凋亡在调节心肌细胞的数目方面起着不可缺少的作用，那么对凋亡机制的干预将可能为缺血性心血管病防治提供新的途径。本研究结果发现，中药TMP可使MIR大鼠心肌FOS蛋白颗粒数目明显减少，TUNEL阳性细胞逐渐减少，表明TMP对MIR诱导的缺血心肌FOS蛋白的表达及MIR导致的细胞凋亡的发生有一定的抑制作用。TMP抑制缺血心肌细胞凋亡，可能与TMP的钙拮抗作用有关。TMP具有激活腺苷酸环化酶作用，从而使细胞内cAMP增加及抑制钙内流[6,7]。同时TMP也是α1-肾上腺素受体阻制剂，可阻断缺血早期心肌细胞膜上成倍增加的α1-肾上腺受体，进而抑制由于α1-肾上腺受体增多引起的大量钙内流。通过以上途径在一定程度上减轻细胞内的钙超载，阻断凋亡的始动环节。凡是能引起细胞内游离钙浓度异常增高的因素均可诱导c-fos基因表达, 凡是能降低细胞内钙的因素均可降低c-fos基因表达[8]。TMP可能通过减轻缺血心肌细胞内的钙超载，从而降低缺血心肌FOS蛋白表达和减少缺血心肌细胞凋亡。其具体的对细胞凋亡影响的机制尚需进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Gottlieb RA,Burlesen KO,Kloner RA,et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabit cardiomyocytes[J]. J Clin Invest, 1994,94(4):1621.
[2] 胡 萍,尤家禄,罗 正. 大鼠心脏再灌注损伤模型[J]. 湖南医学院学报, 1986,11(1):17.
[3] Das DK,Engelman RM. Molecular adaptation of cellular defences following preconditioning of the heart by repeated ischemia[J]. Cardiovas Res, 1993,27(4):578.
, 百拇医药
[4] Wihsman JH. A new method to detect apoptosis in paraffin sections:in situ end-labeling of fragmented DNA[J]. J Histochem Cytochem, 1993,41(1):7.
[5] 罗 义, 李卓仁, 郭南山. 心血管疾病中的细胞凋亡[J]. 中华内科杂志, 1998，37(3)：207.
[6] 王玉良, 巴彦坤. 川芎嗪对心血管的药理和电生理作用—一种新的钙拮抗剂[J]. 中西医结合杂志, 1995,15(6):291.
[7] Kwan CY,Daniel EF. Inhibitor of vasoconstriction by tetramethyl pyrazine:Does it act by blocking votage dependent Ca channel[J]? Cardiovasc pharmacol, 1990，15(2):157.
[8] Morgan J, Curran T. Role of ion flux in the control of c-fos expression[J]. Nature, 1986,322(6079):552.
(收稿 1999-04-15 修回 1999-12-10), 百拇医药
单位：李源(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；段红(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；王天成(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；张珊红(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)；龚卫琴(第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710033)
关键词：心肌缺血再灌注；c-fos基因；细胞调亡；川芎嗪
心脏杂志000319
摘 要：目的：观察川芎嗪(TMP)对心肌缺血再灌注(MIR)大鼠心肌c-fos基因表达及凋亡细胞的作用。方法：应用免疫组化法检测MIR不同时期心肌FOS蛋白的表达，并采用末端标记技术对心肌细胞凋亡数进行检测。结果：①对照组心肌无FOS蛋白表达，亦未见凋亡细胞出现。②与MIR组相比，TMP干预组心肌FOS蛋白的表达明显减弱(60 min分别为57±44个/片和6.4±3.2个/片，90 min分别为467±450个/片和171±160个/片，120 min分别为246±160个/片和130±121个/片，均P<0.05)，TUNEL阳性细胞数均明显减少(60 min分别为36.3±8.7个/片和24.7±7.2个/片,P<0.05; 120 min分别为48.0±23.8个/片和10.0±8.1个/片, P<0.01)。结论：MIR可诱导终末分化的心肌细胞高表达FOS蛋白及发生细胞凋亡；应用TMP可使缺血心肌细胞c-fos基因表达减弱及凋亡减轻。
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中图分类号：R331.31 文献标识码：A
文章编号：1005-3271(2000)03-0213-03
Effects of tetramethylpyrazine on c-fos expression and apoptosis of myocardial cells in myocardial ischemic reperfusion in rats
LI Yuan, DUAN Hong, WANG Tian-cheng, ZHANG Shan-hong, GONG Wei-qin
(Department of Geriatrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi′an 710033,Shaanxi,China)
, 百拇医药
Abstract：AIM：To study the effects of tetramethylpyrazine (TMP) on c-fos expression and apoptosis of myocardial cells in myocardial ischemic reperfusion (MIR) in rats. METHODS：Coloring TDT-mediated dutp nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemical staining were used. RESULTS：①No blue apoptosis cells and FOS protein expression were found in non-ischemic myocardial tissues; ②Compared with those of MIR rats, the number of FOS immunoreactive positive cells in rats treated with TMP decreased significantly (from 57±44/section to 6.4±3.2/section, 467±450/section to 171±161/section and 246±160/section to 130±121/section respectively, P<0.05 ) in 60, 90 and 120 min and the number of TUNEL positive cells in rats treated with TMP also decreased significantly ( from 36.3±8.7/section to 24.7±7.2/section and 48.0±23.8/section to 10.0±8.1/section respectively, P<0.01) in 60 minutes and 120 minutes. CONCLUSION：Myocardial cells may induce apoptosis in MIR and apoptosis may be related to the increased c-fos expression. Administration of TMP can decrease the expression of c-fos and the apoptosis of myocardial cells in MIR.
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Key words：myocardial ischemic reperfusion；c-fos expression；apoptosis；tetramethylpyrazine
大量动物实验已证实，缺血性心脏病中存在心肌细胞的凋亡，并认为心肌细胞的凋亡参与缺血后梗死灶的发展和梗死后心功能不全的发生[1]。然而有关干预心肌细胞凋亡的研究报导甚少。本研究观察川芎嗪(TMP)对心肌缺血再灌注(MIR)大鼠心肌细胞c-fos基因表达及凋亡的影响，探讨TMP防治心肌缺血的作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型 SD大鼠，均为雌性，体重200±15 g(由第四军医大学实验动物中心提供)。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，气管插管行正压人工呼吸。开胸暴露心脏，在距冠状动脉左前降支(LAD)根部2～3 mm处穿线阻断LAD 10 min，造成心肌缺血，然后去除穿线，恢复血流，造成MIR模型[2] 。假手术组所有操作同MIR大鼠，仅穿线不结扎LAD。实验过程中用RM6200型多导生理记录仪同步监视心电图，以出现ST段抬高或压低和/或T波高耸作为冠状动脉结扎成功指标。
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1.2 实验分组及给药方法 将42只大鼠随机分为假手术组(n=6)，MIR组(60，90，120 min亚组)和TMP干预组(60，90，120 min亚组)，每亚组6只。TMP干预组在MIR动物模型上给药，TMP(50 mg/kg，北京第四制药厂)在再灌注前从尾静脉注入，MIR组再灌注前注入同等容量生理盐水。
1.3 免疫组织化学和原位末端标记技术 灌注实验结束后分别取结扎线以下缺血损伤区心肌组织，生理盐水冲净血液，吸干水分，立即置于40 g/L多聚甲醛液中固定过夜，石蜡包埋，切成5 μm切片。采用ABC法[3]，对FOS蛋白进行染色，TUNEL染色[4]显示凋亡细胞，TUNEL染色的阴性对照组用等量蒸馏水代替TdT酶。在光学显微镜下观察实验结果。
1.4 计算机辅助图像分析 染色结果用瑞士Leica公司Quontiment 570图像分析仪对FOS蛋白阳性细胞数和凋亡细胞数进行半定量分析。显微镜放大200倍，图像经过摄像机转变成电信号，再转换成可被计算机直接处理和储存的数字信号，并同时在监视器上显示。每张切片内、中、外层随机选取5个视野，进行着色细胞图像分析，计算均值。全部数据输入计算机，数据以
±s表示，统计学处理采用平方根变换后析因分析及两两显著性检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 TMP对MIR诱导的FOS蛋白表达的影响 假手术大鼠心肌组织中均未发现FOS蛋白表达，MIR与TMP干预MIR组大鼠缺血心肌均有FOS蛋白表达, 60 min出现，90 min达峰值, 120 min明显减少，但TMP干预组FOS蛋白阳性颗粒数目明显减少(表1)。
2.2 TMP对MIR诱导的细胞凋亡的影响 假手术组大鼠心肌组织未发现蓝色凋亡细胞， MIR与TMP干预组大鼠缺血心肌均有细胞调亡现象，但其凋亡细胞数有显著性差异(见图1,2)，与MIR大鼠相比, TMP干预组凋亡细胞明显减少, 60 min分别为36.3±8.7个/片和24.7±7.2个/片(P<0.05)，120 min分别为48.0±23.8个/片和10.0±8.1个/片(P<0.01)。
表 1 MIR和TMP组心肌FOS蛋白表达的比较(个/片) 组别
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60 min
90 min
120 min
缺血再灌注组
57±44
467±450
246±160
川芎嗪干预组
6.4±3.2a
171±160a
130±121
与缺血再灌注组相同时间点的比较,aP<0.05。
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图 1 再灌注120 min缺血心肌的TUNEL阳性细胞(×400)
图2 TMP干预再灌注120 min缺血心肌的TUNEL阳性细胞(×400)
3 讨论
最新研究表明，活体MIR和离体培养心肌细胞缺氧时均有细胞凋亡现象[5]，并认为细胞凋亡是有核细胞在外部的刺激下通过胞内信号转导启动自身内部的基因表达调控从而引发的连续性程序细胞死亡过程。本研究结果表明，MIR 60 min缺血心肌即出现细胞凋亡现象，而且细胞凋亡数随再灌注时间延长而增多，120 min时心肌凋亡细胞数最多，提示缺血心肌凋亡性损伤是一个不断发生的动态过程。与此同时，MIR 60 min缺血心肌表达FOS蛋白，90 min达高峰，结果表明心肌细胞凋亡的发生可能与c-fos基因高表达有一定关系。
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缺血心肌可出现凋亡现象，心肌细胞的凋亡在调节心肌细胞的数目方面起着不可缺少的作用，那么对凋亡机制的干预将可能为缺血性心血管病防治提供新的途径。本研究结果发现，中药TMP可使MIR大鼠心肌FOS蛋白颗粒数目明显减少，TUNEL阳性细胞逐渐减少，表明TMP对MIR诱导的缺血心肌FOS蛋白的表达及MIR导致的细胞凋亡的发生有一定的抑制作用。TMP抑制缺血心肌细胞凋亡，可能与TMP的钙拮抗作用有关。TMP具有激活腺苷酸环化酶作用，从而使细胞内cAMP增加及抑制钙内流[6,7]。同时TMP也是α1-肾上腺素受体阻制剂，可阻断缺血早期心肌细胞膜上成倍增加的α1-肾上腺受体，进而抑制由于α1-肾上腺受体增多引起的大量钙内流。通过以上途径在一定程度上减轻细胞内的钙超载，阻断凋亡的始动环节。凡是能引起细胞内游离钙浓度异常增高的因素均可诱导c-fos基因表达, 凡是能降低细胞内钙的因素均可降低c-fos基因表达[8]。TMP可能通过减轻缺血心肌细胞内的钙超载，从而降低缺血心肌FOS蛋白表达和减少缺血心肌细胞凋亡。其具体的对细胞凋亡影响的机制尚需进一步研究。
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参考文献：
[1] Gottlieb RA,Burlesen KO,Kloner RA,et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabit cardiomyocytes[J]. J Clin Invest, 1994,94(4):1621.
[2] 胡 萍,尤家禄,罗 正. 大鼠心脏再灌注损伤模型[J]. 湖南医学院学报, 1986,11(1):17.
[3] Das DK,Engelman RM. Molecular adaptation of cellular defences following preconditioning of the heart by repeated ischemia[J]. Cardiovas Res, 1993,27(4):578.
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[4] Wihsman JH. A new method to detect apoptosis in paraffin sections:in situ end-labeling of fragmented DNA[J]. J Histochem Cytochem, 1993,41(1):7.
[5] 罗 义, 李卓仁, 郭南山. 心血管疾病中的细胞凋亡[J]. 中华内科杂志, 1998，37(3)：207.
[6] 王玉良, 巴彦坤. 川芎嗪对心血管的药理和电生理作用—一种新的钙拮抗剂[J]. 中西医结合杂志, 1995,15(6):291.
[7] Kwan CY,Daniel EF. Inhibitor of vasoconstriction by tetramethyl pyrazine:Does it act by blocking votage dependent Ca channel[J]? Cardiovasc pharmacol, 1990，15(2):157.
[8] Morgan J, Curran T. Role of ion flux in the control of c-fos expression[J]. Nature, 1986,322(6079):552.
(收稿 1999-04-15 修回 1999-12-10), 百拇医药