ASA法测定细胞色素P450 2D6酶缺陷等位基因CYP2D6E*
作者：陈枢青 赵鲁杭 孙红颖 Peter J Wedlund
单位：陈枢青 赵鲁杭 孙红颖 杭州 浙江医科大学生物化学教研室；Peter J Wedlund College of Pharmacy,University of Kentucky,Lexington KY 40536 USA
关键词：细胞色素P450；3D6(CYP2D6)；基因分型；CYP2D6E，等位基因特异扩增法
中国现代应用药学990216摘要 目的：建立细胞色素P450 2D6(CYP2D6)第3023位A→C突变造成CYP2D6酶活性缺陷的等位基因CYP2D6E的测定方法。方法：利用等位基因特异扩增法(ASA)为基本原理，设计两对引物分别扩增野生型等位基因和突变型等位基因。结果：经396例测定，发现2例CYP2D6E与CYP2D6B的异突变型纯合子，其表现型均为慢代谢者。阳性对照说明本法重复性好，阴性对照显示本法无污染问题。结论：本法比PCR-RFLP法更为快捷、更少污染。对CYP2D6E的测定有助于准确预测CYP2D6表现型。
, 百拇医药
Analysis of cytochrome P450 2D6 enzyme defect allele CYP2D6E by allele-specific amplification
Chen Shuqing(Chen SQ)，Zhao Luhang(Zhao LH),Sun Hongying(Sun HY)，et al(Department of Biochemistry，Zhejiang Medical University，Hangzhou 310006)
ABSTRACT OBJECTIVE：To set up a genotyping method for CYP2D6E allele which is a 3023 A→C mutation on CYP2D6 gene and result in a function deficient enzyme.METHOD:Two pairs of primers were designed to separately amplify wildtype and mutant CYP2D6E allele based on the principle of allele-specific amplification.RESULTS:This method was employed to genotyping 396 subjects,2 of them with the genotype of CYP2D6E heterozygote and CYP2D6B heterozygote were found to be poor metabolizers.Positive and negative controls indicated that the method be accurate and without the problem of contamination.CONCLUSION:The method was proved to be simple,quick,accurate and less contamination in comparing with the PCR-RFLP protocol.
, 百拇医药
KEY WORDS cytochrome P450 2D6,genotyping,CYP2D6E,allele-specific amplification
细胞色素P450 2D6(CYP2D6)参与50多种药物代谢，据报道其羟化活性可激活前致癌物引发肺癌和膀胱癌[1]，因此其多态性研究在药物代谢和致癌机理研究等领域受到重视。1994年，Evert[2]等发现了CYP2D6E等位基因。CYP2D6E是CYP2D6基因第六
*本文部分工作受到浙江省卫生厅科研基金和浙江省自然科学基金(第396473号)的资助
外显子上3023位A→C突变，导致表达产物324His→Pro,引起酶活性缺陷。该等位基因造成了约5%的CYP2D6慢代谢者，进行CYP2D6E分析对准确测定CYP2D6慢代谢者有着重要意义。Evert[2]等报道的PCR-RFLP法结果准确，但步骤较繁。本研究旨在利用等位基因特异扩增法(ASA)基本原理，建立更为快捷准确的基因分型法来测定CYP2D6E等位基因，从而为深入研究CYP2D6多态性的生物学意义奠定基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂：Taq DNA 聚合酶、dNTPs和PCR反应管是Perkin-Elmer产品(Norwalk, USA)；PCR引物由Operon Technologies Inc(Alameda,USA)合成并经HPLC纯化；琼脂糖(Type V)、凝胶电泳加样液和溴化乙锭是Sigma Chemical产品(St.Louis,USA)。1 Kb DNA分子量标准是Gibco产品(Gaithersburg,USA)。
1.1.2 仪器：PCR仪(Perkin Elmer,USA)，电泳仪(Mupid-2)(COSMO,Japan)，紫外检测器(FBTIV-88)和电泳照相机(FB-PDC-34)是Fisher Scientific(USA)的产品，高速低温离心机是International Equipment Co.(USA)的产品。
, http://www.100md.com
1.1.3 受试者：所有受试者抽20ml静脉血(EDTA抗凝)，用于提取DNA进行基因分型，并在睡前口服60mg右旋美沙芬，收集8h内全部尿液用于表型分型。接受表型分型的受试者经体检肝、肾功能正常，参加研究前半月内未服任何药物。
1.2 方法
1.2.1 等位基因特异扩增法：50μl PCR反应体系含有10mmol Tris-HCl pH 8.3、50mmol KCl、2.0mmol MgCl2、0.2mmol各dNTP、0.2μmol各引物(表1)和50～1000ng的DNA模板，1.0单位的Taq DNA聚合酶。94℃×1min、65℃×1min、72℃×1.5min扩增35循环。最后，72℃延长7min。1.25%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的产物，扩增片段应为178bp。
表1 CYP2D6E等位基因测定时的引物 基因型
, 百拇医药
序 列
基因位置
野生型
正向
5′-GGC CTC CTG CTC ATG ATC CTA CA-3′
3001～3023
反向
5′-CCG GCC CTG ACA CTC CTT CT-3′
3200～3181
突变型
正向
, 百拇医药 5′-GGC CTC CTG CTC ATG ATC CTA CC-3′
3001～3023
反向
5′-CCG GCC CTG ACA CTC CTT CT-3′
3200～3181
1.2.2 基因分型结果重复性与质量控制：取已测定结果的DNA样本24份，这些样本中包括CYP2D6E等位基因，每份样本分成2份。然后，随机编号得到48份DNA样本，进行盲法测定基因分型。将结果与原来的测定结果对照，检测其一致性。由于PCR方法灵敏度较高，较易污染。为减少污染，PCR扩增和PCR产物检测在不同实验室进行。同时，在基因分型时做阳性对照和空白对照进行PCR质量控制。阳性对照为已知基因型的DNA样本，这些样本中含有各种等位基因，并将其分装，随机编号，测定时进行盲法试验；空白对照为不加DNA模板。
, 百拇医药
1.2.3 表型分型法：参照Guttendorf[3]等的方法，稍加修改。
2 结果与讨论
2.1 等位基因特异扩增法：等位基因特异扩增法利用PCR扩增中引物3′末端碱基互配时要求最为严格的原理，设计了等位基因特异的引物。扩增后的结果有三种可能性：只有野生型等位基因特异的引物有扩增，说明检样只含野生型等位基因，为野生型纯合子；只有突变型等位基因特异的引物有扩增，说明检样只含突变型等位基因，为突变型纯合子；野生型和突变型等位基因均有扩增，说明检样是杂合子。对CYP2D6E的测定只发现了野生型纯合子和CYP2D6E杂合子，未发现突变型纯合子(图1)。
图1 CYP2D6E等位基因测定时的二种典型结果，未发现CYP2D6E纯合子
, 百拇医药
wt/wt:野生型纯合子;wt/E:CYP2D6E杂合子
2.2 基因分型与表型分型的一致性：本研究对396例受试者进行基因分型测定，其中2例CYP2D6B杂合子受试者其表现型却为慢代谢者。在进行CYP2D6E测定后，发现这2例同时也是CYP2D6E杂合子(表2)，说明CYP2D6E与CYP2D6B不连锁发生，致使两份基因均失活。因此，对CYP2D6E进行测定可提高基因分型对表现型的预测准确率。表2 CYP2D6E基因分型与表型分型的一致性 基因型
例 数
表现型
B/E
2
慢代谢
其他
, http://www.100md.com
394
B:CYP2D6等位基因(按Chen[4]等的方法测定)；其他：未检测到CYP2D6E等位基因
2.3 PCR结果重复性与质量控制：对随机编号的已知基因型DNA样本进行盲法基因分型分析，发现本实验室建立的CYP2D6E等位基因测定方法重复性很好，所有测定结果与已知基因型完全一致。空白对照实验证明，本实验室所进行的PCR分析法无污染问题。阳性对照的结果说明基因分型分析方法完全可信，每次分析均设置阳性对照有助于发现一些不可预料的因素对实验的影响，从而提高结果的可信度。
参考文献
[1] Agundez JA,Martinez C,Ladero JM,et al.Debrisoquine oxidation genotype and susceptibility to lung cancer.Clin Pharmacol Ther，1994，55∶10.
, http://www.100md.com
[2] Evert B,Griese EU,Eichelbaum M.A missense mutation in exon 6 of the CYP2D6 gene leading to a histidine 324 to proline exchange is associated with the poor metabolizer phenotype of sparteine.Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol，1994，350∶434.
[3] Guttendorf RJ,Britto M,Blouin RA,et al.Rapid screening for polymorphisms in dextromethorphan and mephenytoin metabolism.Br J Clin Pharmacol，1990，29∶373.
[4] Chen S,Chou WH,Blouin RA,et al.The cytochrome P450-2D6(CYP2D6) enzyme polymorphism:screening costs and influence on clinical outcomes in psychiatry.Clin Pharm Ther,1996，60(5)∶522.
收稿日期：1997-11-12, 百拇医药
单位：陈枢青 赵鲁杭 孙红颖 杭州 浙江医科大学生物化学教研室；Peter J Wedlund College of Pharmacy,University of Kentucky,Lexington KY 40536 USA
关键词：细胞色素P450；3D6(CYP2D6)；基因分型；CYP2D6E，等位基因特异扩增法
中国现代应用药学990216摘要 目的：建立细胞色素P450 2D6(CYP2D6)第3023位A→C突变造成CYP2D6酶活性缺陷的等位基因CYP2D6E的测定方法。方法：利用等位基因特异扩增法(ASA)为基本原理，设计两对引物分别扩增野生型等位基因和突变型等位基因。结果：经396例测定，发现2例CYP2D6E与CYP2D6B的异突变型纯合子，其表现型均为慢代谢者。阳性对照说明本法重复性好，阴性对照显示本法无污染问题。结论：本法比PCR-RFLP法更为快捷、更少污染。对CYP2D6E的测定有助于准确预测CYP2D6表现型。
, 百拇医药
Analysis of cytochrome P450 2D6 enzyme defect allele CYP2D6E by allele-specific amplification
Chen Shuqing(Chen SQ)，Zhao Luhang(Zhao LH),Sun Hongying(Sun HY)，et al(Department of Biochemistry，Zhejiang Medical University，Hangzhou 310006)
ABSTRACT OBJECTIVE：To set up a genotyping method for CYP2D6E allele which is a 3023 A→C mutation on CYP2D6 gene and result in a function deficient enzyme.METHOD:Two pairs of primers were designed to separately amplify wildtype and mutant CYP2D6E allele based on the principle of allele-specific amplification.RESULTS:This method was employed to genotyping 396 subjects,2 of them with the genotype of CYP2D6E heterozygote and CYP2D6B heterozygote were found to be poor metabolizers.Positive and negative controls indicated that the method be accurate and without the problem of contamination.CONCLUSION:The method was proved to be simple,quick,accurate and less contamination in comparing with the PCR-RFLP protocol.
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KEY WORDS cytochrome P450 2D6,genotyping,CYP2D6E,allele-specific amplification
细胞色素P450 2D6(CYP2D6)参与50多种药物代谢，据报道其羟化活性可激活前致癌物引发肺癌和膀胱癌[1]，因此其多态性研究在药物代谢和致癌机理研究等领域受到重视。1994年，Evert[2]等发现了CYP2D6E等位基因。CYP2D6E是CYP2D6基因第六
*本文部分工作受到浙江省卫生厅科研基金和浙江省自然科学基金(第396473号)的资助
外显子上3023位A→C突变，导致表达产物324His→Pro,引起酶活性缺陷。该等位基因造成了约5%的CYP2D6慢代谢者，进行CYP2D6E分析对准确测定CYP2D6慢代谢者有着重要意义。Evert[2]等报道的PCR-RFLP法结果准确，但步骤较繁。本研究旨在利用等位基因特异扩增法(ASA)基本原理，建立更为快捷准确的基因分型法来测定CYP2D6E等位基因，从而为深入研究CYP2D6多态性的生物学意义奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂：Taq DNA 聚合酶、dNTPs和PCR反应管是Perkin-Elmer产品(Norwalk, USA)；PCR引物由Operon Technologies Inc(Alameda,USA)合成并经HPLC纯化；琼脂糖(Type V)、凝胶电泳加样液和溴化乙锭是Sigma Chemical产品(St.Louis,USA)。1 Kb DNA分子量标准是Gibco产品(Gaithersburg,USA)。
1.1.2 仪器：PCR仪(Perkin Elmer,USA)，电泳仪(Mupid-2)(COSMO,Japan)，紫外检测器(FBTIV-88)和电泳照相机(FB-PDC-34)是Fisher Scientific(USA)的产品，高速低温离心机是International Equipment Co.(USA)的产品。
, http://www.100md.com
1.1.3 受试者：所有受试者抽20ml静脉血(EDTA抗凝)，用于提取DNA进行基因分型，并在睡前口服60mg右旋美沙芬，收集8h内全部尿液用于表型分型。接受表型分型的受试者经体检肝、肾功能正常，参加研究前半月内未服任何药物。
1.2 方法
1.2.1 等位基因特异扩增法：50μl PCR反应体系含有10mmol Tris-HCl pH 8.3、50mmol KCl、2.0mmol MgCl2、0.2mmol各dNTP、0.2μmol各引物(表1)和50～1000ng的DNA模板，1.0单位的Taq DNA聚合酶。94℃×1min、65℃×1min、72℃×1.5min扩增35循环。最后，72℃延长7min。1.25%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的产物，扩增片段应为178bp。
表1 CYP2D6E等位基因测定时的引物 基因型
, 百拇医药
序 列
基因位置
野生型
正向
5′-GGC CTC CTG CTC ATG ATC CTA CA-3′
3001～3023
反向
5′-CCG GCC CTG ACA CTC CTT CT-3′
3200～3181
突变型
正向
, 百拇医药 5′-GGC CTC CTG CTC ATG ATC CTA CC-3′
3001～3023
反向
5′-CCG GCC CTG ACA CTC CTT CT-3′
3200～3181
1.2.2 基因分型结果重复性与质量控制：取已测定结果的DNA样本24份，这些样本中包括CYP2D6E等位基因，每份样本分成2份。然后，随机编号得到48份DNA样本，进行盲法测定基因分型。将结果与原来的测定结果对照，检测其一致性。由于PCR方法灵敏度较高，较易污染。为减少污染，PCR扩增和PCR产物检测在不同实验室进行。同时，在基因分型时做阳性对照和空白对照进行PCR质量控制。阳性对照为已知基因型的DNA样本，这些样本中含有各种等位基因，并将其分装，随机编号，测定时进行盲法试验；空白对照为不加DNA模板。
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1.2.3 表型分型法：参照Guttendorf[3]等的方法，稍加修改。
2 结果与讨论
2.1 等位基因特异扩增法：等位基因特异扩增法利用PCR扩增中引物3′末端碱基互配时要求最为严格的原理，设计了等位基因特异的引物。扩增后的结果有三种可能性：只有野生型等位基因特异的引物有扩增，说明检样只含野生型等位基因，为野生型纯合子；只有突变型等位基因特异的引物有扩增，说明检样只含突变型等位基因，为突变型纯合子；野生型和突变型等位基因均有扩增，说明检样是杂合子。对CYP2D6E的测定只发现了野生型纯合子和CYP2D6E杂合子，未发现突变型纯合子(图1)。
图1 CYP2D6E等位基因测定时的二种典型结果，未发现CYP2D6E纯合子
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wt/wt:野生型纯合子;wt/E:CYP2D6E杂合子
2.2 基因分型与表型分型的一致性：本研究对396例受试者进行基因分型测定，其中2例CYP2D6B杂合子受试者其表现型却为慢代谢者。在进行CYP2D6E测定后，发现这2例同时也是CYP2D6E杂合子(表2)，说明CYP2D6E与CYP2D6B不连锁发生，致使两份基因均失活。因此，对CYP2D6E进行测定可提高基因分型对表现型的预测准确率。表2 CYP2D6E基因分型与表型分型的一致性 基因型
例 数
表现型
B/E
2
慢代谢
其他
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394
B:CYP2D6等位基因(按Chen[4]等的方法测定)；其他：未检测到CYP2D6E等位基因
2.3 PCR结果重复性与质量控制：对随机编号的已知基因型DNA样本进行盲法基因分型分析，发现本实验室建立的CYP2D6E等位基因测定方法重复性很好，所有测定结果与已知基因型完全一致。空白对照实验证明，本实验室所进行的PCR分析法无污染问题。阳性对照的结果说明基因分型分析方法完全可信，每次分析均设置阳性对照有助于发现一些不可预料的因素对实验的影响，从而提高结果的可信度。
参考文献
[1] Agundez JA,Martinez C,Ladero JM,et al.Debrisoquine oxidation genotype and susceptibility to lung cancer.Clin Pharmacol Ther，1994，55∶10.
, http://www.100md.com
[2] Evert B,Griese EU,Eichelbaum M.A missense mutation in exon 6 of the CYP2D6 gene leading to a histidine 324 to proline exchange is associated with the poor metabolizer phenotype of sparteine.Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol，1994，350∶434.
[3] Guttendorf RJ,Britto M,Blouin RA,et al.Rapid screening for polymorphisms in dextromethorphan and mephenytoin metabolism.Br J Clin Pharmacol，1990，29∶373.
[4] Chen S,Chou WH,Blouin RA,et al.The cytochrome P450-2D6(CYP2D6) enzyme polymorphism:screening costs and influence on clinical outcomes in psychiatry.Clin Pharm Ther,1996，60(5)∶522.
收稿日期：1997-11-12, 百拇医药