分段毛囊上皮细胞增生能力比较
作者：伍津津 刘荣卿 唐书谦 钟白玉 叶庆佾
单位：伍津津(现在第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科) 刘荣卿 唐书谦 钟白玉 叶庆佾 400042重庆，第三军医大学西南医院皮肤科
关键词：毛囊干细胞
中华皮肤科杂志990310
【摘要】目的 阐明分段毛囊上皮细胞之间的生物学特性和毛囊干细胞的定位。方法 将毛囊上皮细胞分成上段、下段和球部，分别培养于人成纤维细胞滋养层上，然后传代，或在成纤维细胞胶原凝胶上行器官型培养。结果 上段细胞传代次数最多，形成的克隆数最多，细胞生长活力最强；而球部细胞的生长能力最差，下段细胞有少数能形成进行性生长克隆。在间质细胞胶原凝胶上上段细胞形成了层次结构清楚的表皮，下段细胞次之，球部细胞较差。结论 毛囊上段细胞的增生能力最强，分化能力最好，支持毛囊干细胞定位于隆突部的假说。
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Comparison of the Proliferative Potential of Keratinocytes from
Different Fragment of Hair Follicle
WU Jinjin, LIU Rongqin,YIE Qinyi,et al. Department of Dermatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【 Abstract】 Objective To investigate the biological characteristics of epithelial cells from different segments of hair follicle and localization of follicular stem cells. Methods The epithelial cells of hair follicles were cut into three parts:upper segment, lower segment and bulb, they were dispersed to single cells by 0.125% trypsin and 0.02% EDTA, then cultured respectively on a feeder cell layer of human dermal fibroblasts, and passaged or organotypically cultured on collagen gel of fibroblasts. Results The keratinocytes from upper segment grew best, with the most numerous colonies and passage times. The bulb cells grew worst.A few of keratinocytes from lower segment showed continuing growth colonies. When cocultured on collagen gel of fibroblasts, the keratinocytes from upper segment formed a piece of well differentiated epidermis.Conclusion The keratinocytes from the upper segment of hair follicle have the strongest proliferative potential and best differentiation ability which support the hypothesis that the stem cells of follicle are localized in the bulge area.
, 百拇医药
【 Key words】 Hair follicle Stem cell
传统认为毛囊干细胞位于毛球部[1]，近年来孙同天等[2]提出了隆突激活假说，认为毛囊干细胞位于毛囊隆突部，即立毛肌附着点附近，因此将毛囊上皮部分分段，进行生长分化能力和重建表皮能力的比较，有助于阐明分段毛囊上皮细胞之间的生物学特性和毛囊干细胞的定位。
材料和方法
1.头皮或包皮成纤维细胞培养：采用的标本为正常人头皮，取自急性创伤青年患者尸体或良性头皮肿瘤边缘的正常头皮，或是去皱整形的正常头皮，包皮取自包皮环切术后的正常包皮，头皮或包皮的真皮成纤维细胞培养按我科常规采用组织块培养法进行。
2.分段毛囊上皮细胞的游离：头皮处理如前文[3]报道，从真皮-皮下组织交界处剪开的头皮条用0.5%分离酶(Sigma)4℃下孵育6～18h，然后用尖细镊子分离表皮、真皮。部分毛囊上皮组织的真皮段(即毛囊上段)随表皮分离下来，用剪刀将其剪下，挤出留在真皮组织中的毛囊上段；下部毛囊的上皮组织从皮下组织中挤出，然后在显微解剖镜下分成下段和球部。上述4种上皮组织采用0.125%胰酶+0.02%EDTA在37℃下消化成游离细胞，消化时间分别是毛囊间表皮25～30min，毛囊上段20～25min，毛囊下段15～20min，球部15min。所得的细胞悬液加含有5%新生牛血清的DHanks液中止消化，吹散，过筛网，计数，离心。毛囊上段细胞代表毛囊真皮段(除外漏斗部和皮脂腺)的外根鞘细胞，毛囊下段细胞代表除外球部的毛囊皮下组织段之外根鞘细胞，毛球部细胞即毛母质细胞。
, 百拇医药
3.真皮替代物的制作和培养：提前2～5d准备细胞凝胶，方法参见前文[4]报道。成纤维细胞为第15代生长期细胞，如制作无细胞凝胶，只加0.5mL新生牛血清作对照用。凝胶形成后平衡培养1～3d，当凝胶收缩到直径为0.8～1.1cm时，用一玻璃管(内径为0.8或1.0cm)压住凝胶，一是阻止凝胶继续收缩，二是形成了一个小室，可以避免下一步加角质形成细胞悬液时泄漏于凝胶外。
滋养细胞用人真皮成纤维细胞制作，当成纤维细胞出现融合时，加入含有丝裂霉素C(6.7μg/mL)(KyowaHakkoKogyoCo.Ltd，日本)DMEM培养基37℃孵育10h，然后传代，取4×104个细胞到每个培养小室中。
4.器官型培养：分段毛囊上皮和毛囊间表皮的游离角质形成细胞分别加入上述成纤维细胞凝胶和无细胞的凝胶的培养小室中，每孔接种5×105个细胞，约0.5h内待角质形成细胞沉淀于凝胶上并粘附好后即取掉玻璃管。培养物在含有EGF10ng/mL、氢化可的松0.4μg/mL、胰岛素5μg/mL的DMEM培养基中浸没培养1周，然后暴露于气液界面培养，培养2周。每2d换液1次。实验重复3次。
, 百拇医药
5.传代培养：上述4种角质形成细胞培养于人真皮成纤维细胞滋养层上，每25mL培养瓶按5×105个细胞接种，角质形成细胞融合后用0.5%分离酶分离后胰酶消化，进行传代培养，按2×105个细胞/25mL培养瓶接种。
6.组织学检查：每个培养组织的一半用Bouin液固定24h，按常规病理技术操作，切片5μm厚，显微镜下观察。另一半用于电镜观察，2.5%戊二醛固定，常规电镜制片，JEM2000EX透射电镜观察。
结果
在滋养层细胞上进行传代培养，表皮角质形成细胞生长很好，能传2～3代，而上段外根鞘细胞生长非常好，能传3～4代，且融合时间短于毛囊间表皮角质形成细胞，上段细胞3d即可融合，而表皮细胞需要5d。下段毛囊角质形成细胞原代生长较好，长成局灶性克隆但不能融合传代，球部细胞生长很差，即使是原代。从形成克隆形态来看，表皮细胞形成的大克隆，其细胞体积较大；上段毛囊细胞形成较均一的中等克隆，细胞体积较小，克隆数目最多，约占毛囊克隆总数的74%。下段毛囊细胞和球部细胞形成的克隆小，细胞较大，并显示出较高的分化状态，克隆数分别为16%和10%。在下段细胞中还形成了进行性生长的克隆，另外当毛囊下段细胞培养在真皮鞘细胞作的滋养层细胞上时形成了一个特殊的结构，象钉突状，上皮细胞的排列象毛囊球部一样，外层呈栅栏状排列。
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器官型培养时毛囊间表皮与毛囊上段、下段的角质形成细胞形成了层次分明的表皮结构，相似于活体皮肤的表皮层，如有基底层、棘层和角质层，缺乏颗粒层，而两种毛囊外根鞘细胞形成的表皮，其基底层是立方形的，但毛囊间表皮细胞重建成的表皮其基底层是扁平的；其中上段细胞形成的最厚，相当于毛囊间表皮细胞形成的表皮，而且层次结构最好，厚薄均匀一致。但球部生发上皮细胞在头皮或包皮的真皮成纤维细胞胶原凝胶上重建的表皮最薄，基底层和棘层不明显，大约只有3～4层表皮细胞，并有高分化表现，角质层较厚。重建成的表皮，其细胞间为有缺陷的细胞间连接，桥粒长，中间没有致密中线，缺乏紧密连接和缝隙连接。上层角质层为致密的张力微丝组成。没有基底膜形成。
在无细胞凝胶上上段和下段外根鞘角质形成细胞形成了3～5层细胞的表皮结构，其基底层是立方形的，而表层为角质层，然而球部角质形成细胞不能层化且增生差。
讨论
毛囊间表皮、毛囊上段、下段和球部的角质形成细胞培养在滋养层细胞上表现出不同的增生能力。我们的结果提示从含有隆突部毛囊上皮来的角质形成细胞比毛囊间表皮、毛囊下段和球部细胞有更长的寿命和快速增长的能力，此结果与Yang[5]和Moll[6]的结果相符，显示毛囊上段含有一群体外增生潜能极强的细胞亚群。从克隆形态来看，我们的结果显示，上段毛囊细胞的克隆数最多，活力最强。Kobayashi等[7]研究显示的大鼠触须隆突部细胞所形成的克隆数占毛囊细胞总克隆数的95%以上，高于我们的上段与下段克隆数之和。与Moll[6]结果略有差异，B3段克隆数高于上段，B2和B1段克隆数低于下段和球部，这可能与取材不同有关，他们取的为拔出的毛囊，部分下段和球部细胞仍会遗留在体内。我们在游离毛囊培养中的结果也显示毛囊上段是上皮细胞最早的生长点，此点与Regauer[8]和Yang[5]结果一致，总之，这些结果支持毛囊干细胞定位于隆突部的假说。
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另一结果显示，下段细胞当培养在由真皮鞘细胞做成的滋养细胞上时形成了一个钉突状结构，提示下段毛囊细胞能向毛母质细胞分化，真皮鞘细胞对外根鞘细胞的分化具有诱导作用。这相似于Reynolds[1]的研究工作。钉突状结构的形成可能是某些特殊的因子如真皮鞘细胞分泌的生长因子或是两种细胞直接紧密接触作用结果。也说明毛囊上皮细胞在诱导过程中是主动参与者，所以我们认为毛囊真皮成分和上皮成分的相互作用必须是双向的。
毛母质细胞在毛囊生长期表现出显著的增生活性，我们的培养结果为仅极少数毛母质角质形成细胞能够形成克隆，似乎不能解释其细胞的分裂活动，也不能因为真皮鞘细胞作滋养细胞时而改善，更未能形成复杂结构，这还有待于进一步研究。在培养和移植模型中证实真皮或间质成分对角质形成细胞的生长和分化是非常重要的，同时已知真皮成分中的细胞与细胞外基质一样能够调节角质形成细胞增生分化[9]。我们采用分段毛囊上皮细胞分别与间质细胞凝胶进行器官型培养。我们的结果显示，与在无细胞凝胶上培养的角质形成细胞比较，当分段毛囊上皮的角质形成细胞培养在真皮替代物上时，上皮细胞的生长、形态发生了非常显著的改善，表明间质细胞对表皮细胞及毛囊上皮细胞具有促增生作用和诱导分化的能力。实验结果清楚地表明了在包皮或头皮真皮的成纤维细胞凝胶上培养时，上段毛囊外根鞘细胞具有高度增生潜能和较好的分化能力，球部细胞在包皮成纤维细胞胶原凝胶上培养时表现出差的增生潜能，这些结果有力地支持隆突激活假说。提示毛囊上段在伤口愈合和皮肤溃疡的再上皮化过程中起重要作用。虽然有报道毛囊上皮细胞重建表皮中有颗粒层，但本研究重建的表皮中缺乏颗粒层，可能是器官型培养时上皮细胞的分化仍相似于体内毛囊上皮细胞的分化过程。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助课题(39500131)
参考文献
1 Reynolds AJ, Jahoda CAB. Hair follicle stem cells? A distinct germinative epidermal cell population is activated in vitro by the presence of hair dermal papilla cells. J Cell Sci, 1991,99:373- 385.
2 Cotsarelis G, Sun T T, Lavker RM. Label retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell, 1990,61:1329- 1337.
, http://www.100md.com
3 伍津津，刘荣卿，叶庆佾，等.重建毛囊的组织学研究.第三军医大学学报,1998,20:114-117.
4 伍津津，刘荣卿，叶庆佾，等.真皮替代物培养模型的建立.中华皮肤科杂志,1998,31:256.
5 Yang J S, Lavker RM, Sun T T. Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential. J Invest Dermatol, 1993,101:652- 659.
6 Moll I. Proliferative potential of different keratinocytes of plucked human hair follicles. J Invest Dermatol, 1995,105:14- 21.
, http://www.100md.com
7 Kobayashi K, Rochat A, Barrandon Y. Segregation of keratinocyte colony forming cells in the bulge of the rat vibrissa. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:7391- 7395.
8 Regauer S, Compton CC. Cultured keratinocyte sheets enhance spontaneous reepithelialization in a dermal explant model of partial thickness wound healing. J Invest Dermatol, 1990,95:341- 346.
9 Limat A, Hunziker T, Breitkreutz D, et al. Organotypic cocultures as models to study cell cell and cell matrix interactions of human hair follicle cells. Skin Pharmacol, 1994,7:47- 54.
(收稿：1998-06-16修回：1999-01-18), 百拇医药
单位：伍津津(现在第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科) 刘荣卿 唐书谦 钟白玉 叶庆佾 400042重庆，第三军医大学西南医院皮肤科
关键词：毛囊干细胞
中华皮肤科杂志990310
【摘要】目的 阐明分段毛囊上皮细胞之间的生物学特性和毛囊干细胞的定位。方法 将毛囊上皮细胞分成上段、下段和球部，分别培养于人成纤维细胞滋养层上，然后传代，或在成纤维细胞胶原凝胶上行器官型培养。结果 上段细胞传代次数最多，形成的克隆数最多，细胞生长活力最强；而球部细胞的生长能力最差，下段细胞有少数能形成进行性生长克隆。在间质细胞胶原凝胶上上段细胞形成了层次结构清楚的表皮，下段细胞次之，球部细胞较差。结论 毛囊上段细胞的增生能力最强，分化能力最好，支持毛囊干细胞定位于隆突部的假说。
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Comparison of the Proliferative Potential of Keratinocytes from
Different Fragment of Hair Follicle
WU Jinjin, LIU Rongqin,YIE Qinyi,et al. Department of Dermatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【 Abstract】 Objective To investigate the biological characteristics of epithelial cells from different segments of hair follicle and localization of follicular stem cells. Methods The epithelial cells of hair follicles were cut into three parts:upper segment, lower segment and bulb, they were dispersed to single cells by 0.125% trypsin and 0.02% EDTA, then cultured respectively on a feeder cell layer of human dermal fibroblasts, and passaged or organotypically cultured on collagen gel of fibroblasts. Results The keratinocytes from upper segment grew best, with the most numerous colonies and passage times. The bulb cells grew worst.A few of keratinocytes from lower segment showed continuing growth colonies. When cocultured on collagen gel of fibroblasts, the keratinocytes from upper segment formed a piece of well differentiated epidermis.Conclusion The keratinocytes from the upper segment of hair follicle have the strongest proliferative potential and best differentiation ability which support the hypothesis that the stem cells of follicle are localized in the bulge area.
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【 Key words】 Hair follicle Stem cell
传统认为毛囊干细胞位于毛球部[1]，近年来孙同天等[2]提出了隆突激活假说，认为毛囊干细胞位于毛囊隆突部，即立毛肌附着点附近，因此将毛囊上皮部分分段，进行生长分化能力和重建表皮能力的比较，有助于阐明分段毛囊上皮细胞之间的生物学特性和毛囊干细胞的定位。
材料和方法
1.头皮或包皮成纤维细胞培养：采用的标本为正常人头皮，取自急性创伤青年患者尸体或良性头皮肿瘤边缘的正常头皮，或是去皱整形的正常头皮，包皮取自包皮环切术后的正常包皮，头皮或包皮的真皮成纤维细胞培养按我科常规采用组织块培养法进行。
2.分段毛囊上皮细胞的游离：头皮处理如前文[3]报道，从真皮-皮下组织交界处剪开的头皮条用0.5%分离酶(Sigma)4℃下孵育6～18h，然后用尖细镊子分离表皮、真皮。部分毛囊上皮组织的真皮段(即毛囊上段)随表皮分离下来，用剪刀将其剪下，挤出留在真皮组织中的毛囊上段；下部毛囊的上皮组织从皮下组织中挤出，然后在显微解剖镜下分成下段和球部。上述4种上皮组织采用0.125%胰酶+0.02%EDTA在37℃下消化成游离细胞，消化时间分别是毛囊间表皮25～30min，毛囊上段20～25min，毛囊下段15～20min，球部15min。所得的细胞悬液加含有5%新生牛血清的DHanks液中止消化，吹散，过筛网，计数，离心。毛囊上段细胞代表毛囊真皮段(除外漏斗部和皮脂腺)的外根鞘细胞，毛囊下段细胞代表除外球部的毛囊皮下组织段之外根鞘细胞，毛球部细胞即毛母质细胞。
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3.真皮替代物的制作和培养：提前2～5d准备细胞凝胶，方法参见前文[4]报道。成纤维细胞为第15代生长期细胞，如制作无细胞凝胶，只加0.5mL新生牛血清作对照用。凝胶形成后平衡培养1～3d，当凝胶收缩到直径为0.8～1.1cm时，用一玻璃管(内径为0.8或1.0cm)压住凝胶，一是阻止凝胶继续收缩，二是形成了一个小室，可以避免下一步加角质形成细胞悬液时泄漏于凝胶外。
滋养细胞用人真皮成纤维细胞制作，当成纤维细胞出现融合时，加入含有丝裂霉素C(6.7μg/mL)(KyowaHakkoKogyoCo.Ltd，日本)DMEM培养基37℃孵育10h，然后传代，取4×104个细胞到每个培养小室中。
4.器官型培养：分段毛囊上皮和毛囊间表皮的游离角质形成细胞分别加入上述成纤维细胞凝胶和无细胞的凝胶的培养小室中，每孔接种5×105个细胞，约0.5h内待角质形成细胞沉淀于凝胶上并粘附好后即取掉玻璃管。培养物在含有EGF10ng/mL、氢化可的松0.4μg/mL、胰岛素5μg/mL的DMEM培养基中浸没培养1周，然后暴露于气液界面培养，培养2周。每2d换液1次。实验重复3次。
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5.传代培养：上述4种角质形成细胞培养于人真皮成纤维细胞滋养层上，每25mL培养瓶按5×105个细胞接种，角质形成细胞融合后用0.5%分离酶分离后胰酶消化，进行传代培养，按2×105个细胞/25mL培养瓶接种。
6.组织学检查：每个培养组织的一半用Bouin液固定24h，按常规病理技术操作，切片5μm厚，显微镜下观察。另一半用于电镜观察，2.5%戊二醛固定，常规电镜制片，JEM2000EX透射电镜观察。
结果
在滋养层细胞上进行传代培养，表皮角质形成细胞生长很好，能传2～3代，而上段外根鞘细胞生长非常好，能传3～4代，且融合时间短于毛囊间表皮角质形成细胞，上段细胞3d即可融合，而表皮细胞需要5d。下段毛囊角质形成细胞原代生长较好，长成局灶性克隆但不能融合传代，球部细胞生长很差，即使是原代。从形成克隆形态来看，表皮细胞形成的大克隆，其细胞体积较大；上段毛囊细胞形成较均一的中等克隆，细胞体积较小，克隆数目最多，约占毛囊克隆总数的74%。下段毛囊细胞和球部细胞形成的克隆小，细胞较大，并显示出较高的分化状态，克隆数分别为16%和10%。在下段细胞中还形成了进行性生长的克隆，另外当毛囊下段细胞培养在真皮鞘细胞作的滋养层细胞上时形成了一个特殊的结构，象钉突状，上皮细胞的排列象毛囊球部一样，外层呈栅栏状排列。
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器官型培养时毛囊间表皮与毛囊上段、下段的角质形成细胞形成了层次分明的表皮结构，相似于活体皮肤的表皮层，如有基底层、棘层和角质层，缺乏颗粒层，而两种毛囊外根鞘细胞形成的表皮，其基底层是立方形的，但毛囊间表皮细胞重建成的表皮其基底层是扁平的；其中上段细胞形成的最厚，相当于毛囊间表皮细胞形成的表皮，而且层次结构最好，厚薄均匀一致。但球部生发上皮细胞在头皮或包皮的真皮成纤维细胞胶原凝胶上重建的表皮最薄，基底层和棘层不明显，大约只有3～4层表皮细胞，并有高分化表现，角质层较厚。重建成的表皮，其细胞间为有缺陷的细胞间连接，桥粒长，中间没有致密中线，缺乏紧密连接和缝隙连接。上层角质层为致密的张力微丝组成。没有基底膜形成。
在无细胞凝胶上上段和下段外根鞘角质形成细胞形成了3～5层细胞的表皮结构，其基底层是立方形的，而表层为角质层，然而球部角质形成细胞不能层化且增生差。
讨论
毛囊间表皮、毛囊上段、下段和球部的角质形成细胞培养在滋养层细胞上表现出不同的增生能力。我们的结果提示从含有隆突部毛囊上皮来的角质形成细胞比毛囊间表皮、毛囊下段和球部细胞有更长的寿命和快速增长的能力，此结果与Yang[5]和Moll[6]的结果相符，显示毛囊上段含有一群体外增生潜能极强的细胞亚群。从克隆形态来看，我们的结果显示，上段毛囊细胞的克隆数最多，活力最强。Kobayashi等[7]研究显示的大鼠触须隆突部细胞所形成的克隆数占毛囊细胞总克隆数的95%以上，高于我们的上段与下段克隆数之和。与Moll[6]结果略有差异，B3段克隆数高于上段，B2和B1段克隆数低于下段和球部，这可能与取材不同有关，他们取的为拔出的毛囊，部分下段和球部细胞仍会遗留在体内。我们在游离毛囊培养中的结果也显示毛囊上段是上皮细胞最早的生长点，此点与Regauer[8]和Yang[5]结果一致，总之，这些结果支持毛囊干细胞定位于隆突部的假说。
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另一结果显示，下段细胞当培养在由真皮鞘细胞做成的滋养细胞上时形成了一个钉突状结构，提示下段毛囊细胞能向毛母质细胞分化，真皮鞘细胞对外根鞘细胞的分化具有诱导作用。这相似于Reynolds[1]的研究工作。钉突状结构的形成可能是某些特殊的因子如真皮鞘细胞分泌的生长因子或是两种细胞直接紧密接触作用结果。也说明毛囊上皮细胞在诱导过程中是主动参与者，所以我们认为毛囊真皮成分和上皮成分的相互作用必须是双向的。
毛母质细胞在毛囊生长期表现出显著的增生活性，我们的培养结果为仅极少数毛母质角质形成细胞能够形成克隆，似乎不能解释其细胞的分裂活动，也不能因为真皮鞘细胞作滋养细胞时而改善，更未能形成复杂结构，这还有待于进一步研究。在培养和移植模型中证实真皮或间质成分对角质形成细胞的生长和分化是非常重要的，同时已知真皮成分中的细胞与细胞外基质一样能够调节角质形成细胞增生分化[9]。我们采用分段毛囊上皮细胞分别与间质细胞凝胶进行器官型培养。我们的结果显示，与在无细胞凝胶上培养的角质形成细胞比较，当分段毛囊上皮的角质形成细胞培养在真皮替代物上时，上皮细胞的生长、形态发生了非常显著的改善，表明间质细胞对表皮细胞及毛囊上皮细胞具有促增生作用和诱导分化的能力。实验结果清楚地表明了在包皮或头皮真皮的成纤维细胞凝胶上培养时，上段毛囊外根鞘细胞具有高度增生潜能和较好的分化能力，球部细胞在包皮成纤维细胞胶原凝胶上培养时表现出差的增生潜能，这些结果有力地支持隆突激活假说。提示毛囊上段在伤口愈合和皮肤溃疡的再上皮化过程中起重要作用。虽然有报道毛囊上皮细胞重建表皮中有颗粒层，但本研究重建的表皮中缺乏颗粒层，可能是器官型培养时上皮细胞的分化仍相似于体内毛囊上皮细胞的分化过程。
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参考文献
1 Reynolds AJ, Jahoda CAB. Hair follicle stem cells? A distinct germinative epidermal cell population is activated in vitro by the presence of hair dermal papilla cells. J Cell Sci, 1991,99:373- 385.
2 Cotsarelis G, Sun T T, Lavker RM. Label retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell, 1990,61:1329- 1337.
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3 伍津津，刘荣卿，叶庆佾，等.重建毛囊的组织学研究.第三军医大学学报,1998,20:114-117.
4 伍津津，刘荣卿，叶庆佾，等.真皮替代物培养模型的建立.中华皮肤科杂志,1998,31:256.
5 Yang J S, Lavker RM, Sun T T. Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential. J Invest Dermatol, 1993,101:652- 659.
6 Moll I. Proliferative potential of different keratinocytes of plucked human hair follicles. J Invest Dermatol, 1995,105:14- 21.
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7 Kobayashi K, Rochat A, Barrandon Y. Segregation of keratinocyte colony forming cells in the bulge of the rat vibrissa. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:7391- 7395.
8 Regauer S, Compton CC. Cultured keratinocyte sheets enhance spontaneous reepithelialization in a dermal explant model of partial thickness wound healing. J Invest Dermatol, 1990,95:341- 346.
9 Limat A, Hunziker T, Breitkreutz D, et al. Organotypic cocultures as models to study cell cell and cell matrix interactions of human hair follicle cells. Skin Pharmacol, 1994,7:47- 54.
(收稿：1998-06-16修回：1999-01-18), 百拇医药