从石蜡包埋的组织中提取DNA进行PCR扩增的方法
作者：胡春萍 黄 健 刘永明
单位：桂林医学院生化教研室 广西桂林市 541001
关键词：石蜡包埋；DNA；聚合酶链式反应
华夏医学990176 肿瘤的分子生物学研究是当今的热门课题之一,但研究者在短期内通常难以获得大量的病例分析的新鲜标本,从而阻碍研究的进程。近年来文献报告从贮存的石蜡包埋组织切片提取DNA,可用于PCR(Polymerae chain reaction)及进一步的基因分析[1～5]。本实验将Rogers[3]报道的方法加以改进,成功地从经甲醛固定、石蜡包埋的肝癌组织切片中提取DNA,用于PCR扩增,解决了肿瘤的分子生物学研究中难以得到大量标本的难题。现将方法介绍如下。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 标本来源
经甲醛固定和石蜡包埋的肝癌组织由本院病理检验科提供。
1.2 试剂和仪器
PCR扩增试剂购自华美生物工程公司。蛋白酶K(Merck公司),引物由美国生命公司合成。二甲苯、乙醇、氯仿等均为国产分析纯试剂。细胞裂解缓冲液、TE缓冲液(pH8.0)等均按经典方法配制。
PTC-100型基因扩增仪,MJ Research,INC公司产品;752紫外光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂。
1.3 DNA的提取及PCR扩增
1.3.1 从经甲醛固定、石蜡包埋的组织中提取DNA
①组织切片的制备 将甲醛固定、石蜡包埋的组织块切成8μm厚的薄片,取4～5片放入1.5ml Eppendorf管中。
, 百拇医药
②脱蜡 (1)每管加入1.0ml二甲苯,振摇混匀30min,溶解石蜡。(2)10 000r/min离心5min,用干净滴管吸去上清,保留沉淀。(3)重复(1)(2)尽可能除去石蜡。(4)加1.0ml无水乙醇,轻轻翻转混匀3min。(5)10 000r/min离心5min,除去上清。(6)重复(4)(5),尽可能除去二甲苯。(7)干燥样品,使乙醇完全挥发。
③DNA的制备
制备DNA的原则是首先使细胞及细胞核溶解,然后利用核酸与蛋白质对有机溶剂的变性作用具有不同的反应性,将蛋白质、脂类、糖类等物质分离除去,同时又要保持DNA分子的完整性。在提取DNA的反应体系中,SDS可将细胞膜、核膜破坏,并将组蛋白从DNA分子上拉开,使核蛋白上的核酸游离。EDTA抑制细胞DNA酶的活性,蛋白酶K可将所有的蛋白降解为小分子肽或氨基酸。样品经上述反应体系保温处理后,再以氯仿抽提,可进一步使蛋白与核酸分开。再经冷无水乙醇沉淀DNA,以除去DNA中残留的氯仿,使得DNA分子尽量完整地分离出来。
, 百拇医药
(1)蛋白酶K消化:每管加100～200μ1含SDS的细胞裂解缓冲液,同时加入蛋白酶K,使其终浓度为200μg/ml。65℃水浴数小时或过夜,不时震摇,至组织消化完全。
(2)氯仿抽提:加入醋酸钾溶液,翻转混匀,4℃静置15min后,加入氯仿,充分震摇后10 000r/min离心10min,将上清液转入一新的Ep管,沉淀弃去。
(3)乙醇沉淀DNA:加3倍体积的冷无水乙醇至DNA溶液中,翻转混匀,在-20℃过夜、10 000r/min离心10min。弃去上清,沉淀以70%乙醇洗涤,再离心弃去上清,将沉淀在室温中干燥。加入50μl TE(pH8.0)溶解DNA,待其完全溶解后,取少量样品以752紫外光栅分光光度计测定DNA含量及纯度,并作0.8%琼脂糖凝胶电泳观察,确定DNA的质量。
1.3.2 新鲜冷冻组织DNA的提取 组织切碎PBS中匀浆后,同上DNA的制备过程处理
, http://www.100md.com
1.3.3 PCR扩增 536bp片段的人β-球蛋白基因常用作一些基因分析的对照扩增,取0.2μmol/L的上游及下游引物,10×PCR缓冲液及dNTP各5μl,模板DNA5μl,加灭菌重蒸水至总体积为50μl。94℃预变性7min,离心,加入1u的多聚酶,混匀,加数滴石蜡油覆盖,于PTC-100型扩增仪中加温循环扩增。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外检测仪观察,照相。
2 结果
2.1 新鲜肝癌组织和石蜡包埋组织中提取DNA比较
从石蜡包埋组织提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳后,显示有的有较明显的降解,有的不明显,跟新鲜组织提取的DNA片段电泳图谱相似,可能与甲醛固定石蜡包埋时间的长短有关(见图1)。
2.2 新鲜组织和石蜡包埋组织提取的DNA PCR扩增结果比较
, 百拇医药
取PCR扩增产物8μl,载样缓冲液2μl经2%琼脂糖凝胶电泳,可见石蜡包埋组织和新鲜组织DNA的扩增区带十分清晰,结果相似,见图2。
图1 模板DNA在0.8%琼脂糖凝胶中电泳的图谱
M:Marker(λDNA/HindⅢ)
1、4、5:石蜡包埋组织 2、3:新鲜组织
图2 PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳的图谱
M:Marker(PBR 322 DNA/MSPI)
1:石蜡包埋组织 2:新鲜组织
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3 讨论
理论上PCR对原始材料的要求很低,不一定要较纯的DNA样品,但如通过某些方法使组织DNA暴露,引物能更好地结合,无疑将促进酶促反应的顺利进行。对于石蜡包埋组织尤其如此,一般认为PCR扩增石蜡包埋组织中的DNA敏感性与固定时间和扩增的目的基因的长短有关。通常固定时间越长,DNA链断裂越严重,扩增的目的基因越短,对维持PCR的敏感性越有利。本实验结果亦显示,石蜡包埋组织提取的DNA,蜡块存放时间越短,DNA降解越少,蜡块存放时间越长,降解越明显。
但对于PCR扩增产物只有100～500bp的DNA片段的研究,石蜡包埋组织提取的DNA能有效地扩增。扩增结果与新鲜组织提取的DNA结果一致,提示只要提取、纯化方法得当,石蜡包埋组织在分子生物学的研究领域中将有重要的应用价值。
参考文献
[1] Goelz SE,Hamilton SR,Vogelstein B.Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue.Biochem Biophys Res Commun,1985,130(1):118
, http://www.100md.com
[2] Louis DN,Deimling AV,Seizinger BR.A(CA) n dinucleotide repeat assay for eraluating loss of allelic heterozygosity in small and archival human brain tumor Specimens.Am J pathol,1992,141(4):777
[3] Rogers BB,Alpert LC,Hine EAS,et al.Analysis of DNA in fresh and fixed tissue by the polymerase chain reaction.Am J pathol,1990,136(3):541
[4] Joseph JT,Lisle DK,Jacoby LB,et al.NF2 gene analysis distinguishes hemangiopericytoma from meningioma.Am J pathol,1995,147(5):1450
[5] Platz A,Hansson J,Mansson-Brahme E,et al.Screeing of germline mutations in the CDKN2A and CDKN2B genes in Swedish families with hereditary cutaneous melanoma.J Natl Cancer Inst,1997,89(10):967
(收稿 1998-12-04), http://www.100md.com
单位：桂林医学院生化教研室 广西桂林市 541001
关键词：石蜡包埋；DNA；聚合酶链式反应
华夏医学990176 肿瘤的分子生物学研究是当今的热门课题之一,但研究者在短期内通常难以获得大量的病例分析的新鲜标本,从而阻碍研究的进程。近年来文献报告从贮存的石蜡包埋组织切片提取DNA,可用于PCR(Polymerae chain reaction)及进一步的基因分析[1～5]。本实验将Rogers[3]报道的方法加以改进,成功地从经甲醛固定、石蜡包埋的肝癌组织切片中提取DNA,用于PCR扩增,解决了肿瘤的分子生物学研究中难以得到大量标本的难题。现将方法介绍如下。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 标本来源
经甲醛固定和石蜡包埋的肝癌组织由本院病理检验科提供。
1.2 试剂和仪器
PCR扩增试剂购自华美生物工程公司。蛋白酶K(Merck公司),引物由美国生命公司合成。二甲苯、乙醇、氯仿等均为国产分析纯试剂。细胞裂解缓冲液、TE缓冲液(pH8.0)等均按经典方法配制。
PTC-100型基因扩增仪,MJ Research,INC公司产品;752紫外光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂。
1.3 DNA的提取及PCR扩增
1.3.1 从经甲醛固定、石蜡包埋的组织中提取DNA
①组织切片的制备 将甲醛固定、石蜡包埋的组织块切成8μm厚的薄片,取4～5片放入1.5ml Eppendorf管中。
, 百拇医药
②脱蜡 (1)每管加入1.0ml二甲苯,振摇混匀30min,溶解石蜡。(2)10 000r/min离心5min,用干净滴管吸去上清,保留沉淀。(3)重复(1)(2)尽可能除去石蜡。(4)加1.0ml无水乙醇,轻轻翻转混匀3min。(5)10 000r/min离心5min,除去上清。(6)重复(4)(5),尽可能除去二甲苯。(7)干燥样品,使乙醇完全挥发。
③DNA的制备
制备DNA的原则是首先使细胞及细胞核溶解,然后利用核酸与蛋白质对有机溶剂的变性作用具有不同的反应性,将蛋白质、脂类、糖类等物质分离除去,同时又要保持DNA分子的完整性。在提取DNA的反应体系中,SDS可将细胞膜、核膜破坏,并将组蛋白从DNA分子上拉开,使核蛋白上的核酸游离。EDTA抑制细胞DNA酶的活性,蛋白酶K可将所有的蛋白降解为小分子肽或氨基酸。样品经上述反应体系保温处理后,再以氯仿抽提,可进一步使蛋白与核酸分开。再经冷无水乙醇沉淀DNA,以除去DNA中残留的氯仿,使得DNA分子尽量完整地分离出来。
, 百拇医药
(1)蛋白酶K消化:每管加100～200μ1含SDS的细胞裂解缓冲液,同时加入蛋白酶K,使其终浓度为200μg/ml。65℃水浴数小时或过夜,不时震摇,至组织消化完全。
(2)氯仿抽提:加入醋酸钾溶液,翻转混匀,4℃静置15min后,加入氯仿,充分震摇后10 000r/min离心10min,将上清液转入一新的Ep管,沉淀弃去。
(3)乙醇沉淀DNA:加3倍体积的冷无水乙醇至DNA溶液中,翻转混匀,在-20℃过夜、10 000r/min离心10min。弃去上清,沉淀以70%乙醇洗涤,再离心弃去上清,将沉淀在室温中干燥。加入50μl TE(pH8.0)溶解DNA,待其完全溶解后,取少量样品以752紫外光栅分光光度计测定DNA含量及纯度,并作0.8%琼脂糖凝胶电泳观察,确定DNA的质量。
1.3.2 新鲜冷冻组织DNA的提取 组织切碎PBS中匀浆后,同上DNA的制备过程处理
, http://www.100md.com
1.3.3 PCR扩增 536bp片段的人β-球蛋白基因常用作一些基因分析的对照扩增,取0.2μmol/L的上游及下游引物,10×PCR缓冲液及dNTP各5μl,模板DNA5μl,加灭菌重蒸水至总体积为50μl。94℃预变性7min,离心,加入1u的多聚酶,混匀,加数滴石蜡油覆盖,于PTC-100型扩增仪中加温循环扩增。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外检测仪观察,照相。
2 结果
2.1 新鲜肝癌组织和石蜡包埋组织中提取DNA比较
从石蜡包埋组织提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳后,显示有的有较明显的降解,有的不明显,跟新鲜组织提取的DNA片段电泳图谱相似,可能与甲醛固定石蜡包埋时间的长短有关(见图1)。
2.2 新鲜组织和石蜡包埋组织提取的DNA PCR扩增结果比较
, 百拇医药
取PCR扩增产物8μl,载样缓冲液2μl经2%琼脂糖凝胶电泳,可见石蜡包埋组织和新鲜组织DNA的扩增区带十分清晰,结果相似,见图2。
图1 模板DNA在0.8%琼脂糖凝胶中电泳的图谱
M:Marker(λDNA/HindⅢ)
1、4、5:石蜡包埋组织 2、3:新鲜组织
图2 PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳的图谱
M:Marker(PBR 322 DNA/MSPI)
1:石蜡包埋组织 2:新鲜组织
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3 讨论
理论上PCR对原始材料的要求很低,不一定要较纯的DNA样品,但如通过某些方法使组织DNA暴露,引物能更好地结合,无疑将促进酶促反应的顺利进行。对于石蜡包埋组织尤其如此,一般认为PCR扩增石蜡包埋组织中的DNA敏感性与固定时间和扩增的目的基因的长短有关。通常固定时间越长,DNA链断裂越严重,扩增的目的基因越短,对维持PCR的敏感性越有利。本实验结果亦显示,石蜡包埋组织提取的DNA,蜡块存放时间越短,DNA降解越少,蜡块存放时间越长,降解越明显。
但对于PCR扩增产物只有100～500bp的DNA片段的研究,石蜡包埋组织提取的DNA能有效地扩增。扩增结果与新鲜组织提取的DNA结果一致,提示只要提取、纯化方法得当,石蜡包埋组织在分子生物学的研究领域中将有重要的应用价值。
参考文献
[1] Goelz SE,Hamilton SR,Vogelstein B.Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue.Biochem Biophys Res Commun,1985,130(1):118
, http://www.100md.com
[2] Louis DN,Deimling AV,Seizinger BR.A(CA) n dinucleotide repeat assay for eraluating loss of allelic heterozygosity in small and archival human brain tumor Specimens.Am J pathol,1992,141(4):777
[3] Rogers BB,Alpert LC,Hine EAS,et al.Analysis of DNA in fresh and fixed tissue by the polymerase chain reaction.Am J pathol,1990,136(3):541
[4] Joseph JT,Lisle DK,Jacoby LB,et al.NF2 gene analysis distinguishes hemangiopericytoma from meningioma.Am J pathol,1995,147(5):1450
[5] Platz A,Hansson J,Mansson-Brahme E,et al.Screeing of germline mutations in the CDKN2A and CDKN2B genes in Swedish families with hereditary cutaneous melanoma.J Natl Cancer Inst,1997,89(10):967
(收稿 1998-12-04), http://www.100md.com