原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究
作者：胡聪 韩聚强 修贺明 徐铮 郝晓东
单位：胡聪(中国人民解放军石家庄白求恩军医学院(石家庄 050081)；韩聚强(河北医科大学公共卫生学院流行病学教研室)；修贺明 徐铮 郝晓东(中国人民解放军白求恩国际和平医院)
关键词：肝细胞；分离与提纯；胶原酶消化分离；方法 ；肝细胞；细胞学
河北医科大学学报000403
摘 要 目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Wistar大鼠做为肝细胞供体，分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并进行原代培养；以台盼蓝染色法测细胞存活率，在位相差倒置显微镜下观察细胞形态变化，MTT法测培养细胞活性，并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳，而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分离获取肝细胞的方法优于直接分离法。
, http://www.100md.com
中图号 R329.2+4
COMPARATIVE STUDY ON THE
ISOLATING METHODS OF RAT
HEPATOCYTES FOR PRIMARY CULTURE
Hu Cong
Department of Pharmaceutics,Bethune Military
Medical College of PLA(Shijiazhuang 050081)
Han Juqiang
Department of Epidemiology, the School
, 百拇医药
of Public Health, Hebei Medical University
Xiu Heming Xu Zheng Hao Xiaodong
Department of Central Laboratory, Bethune
International Peace Hospital of PLA
ABSTRACT Objective To explore the isolating methods of rat hepatocytes for primary culture.Methods Rat hepatocytes were isolated by direct insolation and collagenase digestion respectively and were primarily cultured in medium.The viability as assessed by typan blue exclusion and MTT method.The morphologic changes of cultured hepatocytes were observed and the concentrations of albumin in the supernatant in different cultural period were examined.Results Hepatocytes got by the method of direct isolation were not good enough on the viability and function.The cells,however,got by collagenase digestion were intact. The viability and function were good.Conclusion The method of collagenase digestion for the isolation of hepatocytes for primary culture is better than that of direct isolation.
, 百拇医药
MeSH hepatocytes/isol;collagenase digestion/methods;hepatocytes/cytol
肝细胞在体外能否培养成功，分离技术至关重要。常用的分离方法主要有：机械法(包括直接分离法、振荡法等)和酶法(包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法)。机械分离法的优点是操作简单，成本低和所分离的肝细胞膜上的蛋白质成分性质不易发生改变。酶法对肝细胞机械损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白[1]，但酶法操作条件严格，且酶制剂多价格昂贵。因此，采用何种方法能够获取产率高、活性好、功能强的肝细胞，对于进一步的实验研究十分必要。本研究分别采用直接分离法和胶原酶消化法分离大鼠肝细胞并进行原代培养，旨在通过观察细胞形态、活性及功能的变化比较两种方法的优劣。
1 材料和方法
1.1 实验动物：Wistar大鼠，雄性，体质量80～100 g,白求恩国际和平医院实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 试剂及仪器：RPMI-1640 购自美国GIBCO公司，台盼蓝、Ⅰ型胶原酶均购自美国Sigma公司，MTT为美国USB公司产品，CO2孵箱(日本SANYO)，DG-3022A型酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)，722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，白蛋白试剂盒(北京北化精细化学品有限责任公司-临床诊断试剂分厂产品)，小牛血清(杭州市四季青生物工程公司)，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 肝细胞分离
1.3.1 直接分离法[2]：实验鼠以乙醚麻醉，无菌操作下开腹，暴露门静脉与下腔静脉，行门静脉穿刺，用预温37 ℃无Ca2+、 Mg2+的D-Hanks液(含0.25 %小牛血清、125 U/ml肝素，pH值调至7.4)进行原位灌注。待肝脏充盈后剪开下腔静脉，放尽积血积液后关闭血管。如此反复灌注20 min，至肝脏表面湿润变软，呈现黄白色时停止灌注。取下肝脏置培养皿中，剪成乳糜状，用适量的含0.25 %小牛血清的平衡盐溶液清洗后，200目铜网过滤，吸取滤液，500 r/min 离心2 min，弃上清。沉积的细胞再以同样条件清洗、离心2～3次。最后以RPMI-1640制成细胞悬液备用。
, 百拇医药
1.3.2 胶原酶消化法[3]：实验大鼠乙醚麻醉，开腹，门脉灌注D-Hanks液。肝脏充盈、变色，剪断下腔静脉，放尽液体后关闭，并灌注 0.03 %Ⅰ型胶原酶10 min。取下肝脏置培养皿中，剪碎，37 ℃消化30 min，RPMI-1640清洗，离心，制备细胞悬液(具体操作方法同直接分离法)。
1.4 肝细胞原代培养[4]：制备好的肝细胞悬液以RPMI-1640为培养基,内含10 %小牛血清,0.1 μmol/L地塞米松，2 mg/L肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF )，调整细胞密度为2×105个/ml,分别接种于培养板中，置37 ℃,5 % CO2条件下培养。每24 h 进行换液。
1.5 形态学观察：接种前及经培养48、72、168 h 的肝细胞，均在位相差倒置显微镜下观察其形态学变化并拍照。
, 百拇医药
1.6 活力检测：接种前用台盼蓝排斥试验检测细胞存活率。培养的肝细胞经MTT法[5]在酶联免疫检测仪上测570 nm吸光度A值(OD值)，判断细胞活力大小。
1.7 功能检测[6]：取接种前及经培养24、48、72、96、120、144 h的肝细胞培养上清用722光栅分光光度计测定白蛋白的含量。
1.8 统计学处理：所有数据用
±s表示，利用SPSS 8.0 软件进行处理。
2 结 果
2.1 接种前用台盼蓝排斥试验分别检测两种分离方法所得细胞的存活率,直接分离法平均为70 %(观察视野n=6)，胶原酶分离法则为85 %(观察视野n=6)。在位相差倒置显微镜下观察其形态发现：直接分离法所得的肝细胞背景干净，细胞呈单个分散状态，球型或多角型(图1)。胶原酶消化法所获取的肝细胞可见2～3个聚集在一起的细胞团，细胞核清晰(图2)。肝细胞经培养48 h后，胶原酶法中可见伸展、变形、拉长的肝细胞，部分可观察到伪足，细胞浆为颗粒状，双核细胞多见(图3)。肝细胞经培养72 h，直接分离法中的肝细胞变化不大，胶原酶消化法中的肝细胞出现肝索状排列及岛状联接(图4)。细胞培养至168 h，直接分离法中的肝细胞体积变小、发黑、核固缩，且出现漂浮和群聚现象;而胶原酶法中可见新生肝细胞，呈透明状，集落生长，融合成片(图5)，其最长生存时间可达数周。
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图1 直接分离法获取的肝细胞 ×200
Figure1 Hepatocytes separated by the direct method
图2 胶原酶消化法获取的肝细胞 ×200
Figure 2 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase
图3 胶原酶消化法获取的肝细胞培养48h ×200
Figure 3 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase after culturing for 48 h
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图4 胶原酶消化法所得肝细胞培养72h ×200
Figure 4 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase after culturing for 72 h
图5 胶原酶消化法所得肝细胞培养168h ×200
Figure 5 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase after culturing for 168 h
2.2 肝细胞经培养24 h，以MTT法检测其细胞活力,胶原酶消化法细胞活力明显大于直接分离法(P<0.01),见表1。
, 百拇医药
表1 2种方法分离所得肝细胞培养24 h活力测定
Table 1 24 h viability of hepatocytes isolated by
two methods
(±s) Methods
n
OD value (absorbance %)
Direct
3
0.12±0.015
, http://www.100md.com
Collagenase
3
0.39±0.013*
*P<0.01 vs direct by t test2.3 肝细胞培养上清中白蛋白含量测定：直接分离法中的白蛋白含量随培养时间的延长略呈递减趋势，144 h后减退;而胶原酶消化法中白蛋白含量随培养时间的延长，递增明显(图6)。
图6 2种方法获得肝细胞培养上清中白蛋白的含量
Figure 6 ALB amount in the supernatants of hepatocytes
by two isolating methods
, 百拇医药
3 讨 论
肝细胞直接分离法是利用机械方法将肝细胞与肝内结缔组织及Glisson鞘等相分离。由此法分离获取的肝细胞产量较高，镜下观察细胞形态完整，分散度好，背景干净，杂质少。但经测定其细胞活性不佳，功能较差，虽尚能满足48 h 以内的检测试验，如胰岛素受体结合试验等，但随着细胞培养时间的延长，其活性及功能逐渐下降，故不适于一些持续时间较长的实验研究。而胶原酶消化法所获取的肝细胞产量虽不如直接分离法高且背景常有细小碎片等杂质，但经检测细胞活性好，功能强，且能维持较长时间。分析其原因主要有：①胶原酶消化法对肝细胞损伤较小,虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害,但经培养24 h后即可完全修复,而直接分离法所得到的肝细胞虽膜蛋白性质不变，但其细胞在分离过程中所受到的机械损伤却难以修复。②胶原酶在消化肝脏的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体[7],因此有利于肝细胞的培养。由此分析得知：直接分离法不仅对肝细胞损伤较大，更重要的是其缺少肝脏在消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种适应性改变，而这些改变对离体后的肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用。因此，若要获取理想的肝细胞，酶消化这一重要环节不可缺少。当然，使用胶原酶成本较高是其缺憾，但可参考文献采取循环灌注及二步灌注等方法，即可大大减少胶原酶的用量，降低成本。肝细胞的分离技术除上面已讨论的两种方法外，还有螯合法、胰蛋白酶消化法等。螯合法是用可结合Ca2+、Mg2+的螯合剂分离肝细胞,常用的螯合剂单独使用效果并不好，常需与酶法结合使用。胰蛋白酶消化法也属于酶法，但此法对酶浓度及作用时间要求十分严格，且由于胰蛋白酶是1种强蛋白质消化酶，对肝细胞膜破坏严重，因而易造成肝细胞死亡，导致分离失败[8]。
, 百拇医药
随着科学技术的不断发展,建立规范化的体外肝细胞分离与培养方法，对诸多离体试验，如病毒转染、药物筛检、疗效评价及组合性人工肝等各方面的研究有着非常重要的价值，经实验比较，作者认为分离获取肝细胞并进行培养，胶原酶消化法应为首选。
(本文图见插图第3页)
参考文献
1.Alpini G,Phillips JO,Vroman B,et al.Recent advances in the isolation of liver cells.Hepatology,1994,20(2):495
2.吴喜贵，许霖水.肝细胞的直接分离与培养. 第三军医大学学报，1996，18(3):169
3.张蒙，苏映军，陈壁,等.大鼠肝细胞原代长期培养的形态学观察. 第四军医大学学报，1995,16(6):418
, 百拇医药
4.Musat AI,Satter CA,Satter GL,et al. Re-establishment of cell polarity of rat hepatocytes in primary culture. Hepatology,1993,18(7):198
5.RaKba N,Melhaoui A,Loyer P,et al. Bgugaine, a pyrrolidine alkaloid from Arisarum vulgare,is a strong hepatotoxin in rat and human liver cell cultures. Toxicol Lett,1999,104(3):239
6.陈柯，高毅，潘玉先，等.原代猪肝细胞的分离获取及培养. 世界华人消化杂志，1999,7(3)：200
7.Liu ML, Mars WM, Zarnegar R,et al . Collagenase pretreatment and the mitogenic effects of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-α in adult rat liver. Hepatology,1994,19(6):1521
8.Rozga J,Williams F,Ro MS,et al.Development of a bioartificial liver :properties and function of a follow-fiber module inoculated with liver cells. Hepatology,1993,17(2):258
(1999-11-25 收稿), 百拇医药
单位：胡聪(中国人民解放军石家庄白求恩军医学院(石家庄 050081)；韩聚强(河北医科大学公共卫生学院流行病学教研室)；修贺明 徐铮 郝晓东(中国人民解放军白求恩国际和平医院)
关键词：肝细胞；分离与提纯；胶原酶消化分离；方法 ；肝细胞；细胞学
河北医科大学学报000403
摘 要 目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Wistar大鼠做为肝细胞供体，分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并进行原代培养；以台盼蓝染色法测细胞存活率，在位相差倒置显微镜下观察细胞形态变化，MTT法测培养细胞活性，并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳，而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分离获取肝细胞的方法优于直接分离法。
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中图号 R329.2+4
COMPARATIVE STUDY ON THE
ISOLATING METHODS OF RAT
HEPATOCYTES FOR PRIMARY CULTURE
Hu Cong
Department of Pharmaceutics,Bethune Military
Medical College of PLA(Shijiazhuang 050081)
Han Juqiang
Department of Epidemiology, the School
, 百拇医药
of Public Health, Hebei Medical University
Xiu Heming Xu Zheng Hao Xiaodong
Department of Central Laboratory, Bethune
International Peace Hospital of PLA
ABSTRACT Objective To explore the isolating methods of rat hepatocytes for primary culture.Methods Rat hepatocytes were isolated by direct insolation and collagenase digestion respectively and were primarily cultured in medium.The viability as assessed by typan blue exclusion and MTT method.The morphologic changes of cultured hepatocytes were observed and the concentrations of albumin in the supernatant in different cultural period were examined.Results Hepatocytes got by the method of direct isolation were not good enough on the viability and function.The cells,however,got by collagenase digestion were intact. The viability and function were good.Conclusion The method of collagenase digestion for the isolation of hepatocytes for primary culture is better than that of direct isolation.
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MeSH hepatocytes/isol;collagenase digestion/methods;hepatocytes/cytol
肝细胞在体外能否培养成功，分离技术至关重要。常用的分离方法主要有：机械法(包括直接分离法、振荡法等)和酶法(包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法)。机械分离法的优点是操作简单，成本低和所分离的肝细胞膜上的蛋白质成分性质不易发生改变。酶法对肝细胞机械损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白[1]，但酶法操作条件严格，且酶制剂多价格昂贵。因此，采用何种方法能够获取产率高、活性好、功能强的肝细胞，对于进一步的实验研究十分必要。本研究分别采用直接分离法和胶原酶消化法分离大鼠肝细胞并进行原代培养，旨在通过观察细胞形态、活性及功能的变化比较两种方法的优劣。
1 材料和方法
1.1 实验动物：Wistar大鼠，雄性，体质量80～100 g,白求恩国际和平医院实验动物中心提供。
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1.2 试剂及仪器：RPMI-1640 购自美国GIBCO公司，台盼蓝、Ⅰ型胶原酶均购自美国Sigma公司，MTT为美国USB公司产品，CO2孵箱(日本SANYO)，DG-3022A型酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)，722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，白蛋白试剂盒(北京北化精细化学品有限责任公司-临床诊断试剂分厂产品)，小牛血清(杭州市四季青生物工程公司)，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 肝细胞分离
1.3.1 直接分离法[2]：实验鼠以乙醚麻醉，无菌操作下开腹，暴露门静脉与下腔静脉，行门静脉穿刺，用预温37 ℃无Ca2+、 Mg2+的D-Hanks液(含0.25 %小牛血清、125 U/ml肝素，pH值调至7.4)进行原位灌注。待肝脏充盈后剪开下腔静脉，放尽积血积液后关闭血管。如此反复灌注20 min，至肝脏表面湿润变软，呈现黄白色时停止灌注。取下肝脏置培养皿中，剪成乳糜状，用适量的含0.25 %小牛血清的平衡盐溶液清洗后，200目铜网过滤，吸取滤液，500 r/min 离心2 min，弃上清。沉积的细胞再以同样条件清洗、离心2～3次。最后以RPMI-1640制成细胞悬液备用。
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1.3.2 胶原酶消化法[3]：实验大鼠乙醚麻醉，开腹，门脉灌注D-Hanks液。肝脏充盈、变色，剪断下腔静脉，放尽液体后关闭，并灌注 0.03 %Ⅰ型胶原酶10 min。取下肝脏置培养皿中，剪碎，37 ℃消化30 min，RPMI-1640清洗，离心，制备细胞悬液(具体操作方法同直接分离法)。
1.4 肝细胞原代培养[4]：制备好的肝细胞悬液以RPMI-1640为培养基,内含10 %小牛血清,0.1 μmol/L地塞米松，2 mg/L肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF )，调整细胞密度为2×105个/ml,分别接种于培养板中，置37 ℃,5 % CO2条件下培养。每24 h 进行换液。
1.5 形态学观察：接种前及经培养48、72、168 h 的肝细胞，均在位相差倒置显微镜下观察其形态学变化并拍照。
, 百拇医药
1.6 活力检测：接种前用台盼蓝排斥试验检测细胞存活率。培养的肝细胞经MTT法[5]在酶联免疫检测仪上测570 nm吸光度A值(OD值)，判断细胞活力大小。
1.7 功能检测[6]：取接种前及经培养24、48、72、96、120、144 h的肝细胞培养上清用722光栅分光光度计测定白蛋白的含量。
1.8 统计学处理：所有数据用
±s表示，利用SPSS 8.0 软件进行处理。2 结 果
2.1 接种前用台盼蓝排斥试验分别检测两种分离方法所得细胞的存活率,直接分离法平均为70 %(观察视野n=6)，胶原酶分离法则为85 %(观察视野n=6)。在位相差倒置显微镜下观察其形态发现：直接分离法所得的肝细胞背景干净，细胞呈单个分散状态，球型或多角型(图1)。胶原酶消化法所获取的肝细胞可见2～3个聚集在一起的细胞团，细胞核清晰(图2)。肝细胞经培养48 h后，胶原酶法中可见伸展、变形、拉长的肝细胞，部分可观察到伪足，细胞浆为颗粒状，双核细胞多见(图3)。肝细胞经培养72 h，直接分离法中的肝细胞变化不大，胶原酶消化法中的肝细胞出现肝索状排列及岛状联接(图4)。细胞培养至168 h，直接分离法中的肝细胞体积变小、发黑、核固缩，且出现漂浮和群聚现象;而胶原酶法中可见新生肝细胞，呈透明状，集落生长，融合成片(图5)，其最长生存时间可达数周。
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图1 直接分离法获取的肝细胞 ×200
Figure1 Hepatocytes separated by the direct method
图2 胶原酶消化法获取的肝细胞 ×200
Figure 2 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase
图3 胶原酶消化法获取的肝细胞培养48h ×200
Figure 3 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase after culturing for 48 h
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图4 胶原酶消化法所得肝细胞培养72h ×200
Figure 4 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase after culturing for 72 h
图5 胶原酶消化法所得肝细胞培养168h ×200
Figure 5 Hepatocytes separated by the digest method of collagenase after culturing for 168 h
2.2 肝细胞经培养24 h，以MTT法检测其细胞活力,胶原酶消化法细胞活力明显大于直接分离法(P<0.01),见表1。
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表1 2种方法分离所得肝细胞培养24 h活力测定
Table 1 24 h viability of hepatocytes isolated by
two methods
(
±s) Methodsn
OD value (absorbance %)
Direct
3
0.12±0.015
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Collagenase
3
0.39±0.013*
*P<0.01 vs direct by t test2.3 肝细胞培养上清中白蛋白含量测定：直接分离法中的白蛋白含量随培养时间的延长略呈递减趋势，144 h后减退;而胶原酶消化法中白蛋白含量随培养时间的延长，递增明显(图6)。
图6 2种方法获得肝细胞培养上清中白蛋白的含量
Figure 6 ALB amount in the supernatants of hepatocytes
by two isolating methods
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3 讨 论
肝细胞直接分离法是利用机械方法将肝细胞与肝内结缔组织及Glisson鞘等相分离。由此法分离获取的肝细胞产量较高，镜下观察细胞形态完整，分散度好，背景干净，杂质少。但经测定其细胞活性不佳，功能较差，虽尚能满足48 h 以内的检测试验，如胰岛素受体结合试验等，但随着细胞培养时间的延长，其活性及功能逐渐下降，故不适于一些持续时间较长的实验研究。而胶原酶消化法所获取的肝细胞产量虽不如直接分离法高且背景常有细小碎片等杂质，但经检测细胞活性好，功能强，且能维持较长时间。分析其原因主要有：①胶原酶消化法对肝细胞损伤较小,虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害,但经培养24 h后即可完全修复,而直接分离法所得到的肝细胞虽膜蛋白性质不变，但其细胞在分离过程中所受到的机械损伤却难以修复。②胶原酶在消化肝脏的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体[7],因此有利于肝细胞的培养。由此分析得知：直接分离法不仅对肝细胞损伤较大，更重要的是其缺少肝脏在消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种适应性改变，而这些改变对离体后的肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用。因此，若要获取理想的肝细胞，酶消化这一重要环节不可缺少。当然，使用胶原酶成本较高是其缺憾，但可参考文献采取循环灌注及二步灌注等方法，即可大大减少胶原酶的用量，降低成本。肝细胞的分离技术除上面已讨论的两种方法外，还有螯合法、胰蛋白酶消化法等。螯合法是用可结合Ca2+、Mg2+的螯合剂分离肝细胞,常用的螯合剂单独使用效果并不好，常需与酶法结合使用。胰蛋白酶消化法也属于酶法，但此法对酶浓度及作用时间要求十分严格，且由于胰蛋白酶是1种强蛋白质消化酶，对肝细胞膜破坏严重，因而易造成肝细胞死亡，导致分离失败[8]。
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随着科学技术的不断发展,建立规范化的体外肝细胞分离与培养方法，对诸多离体试验，如病毒转染、药物筛检、疗效评价及组合性人工肝等各方面的研究有着非常重要的价值，经实验比较，作者认为分离获取肝细胞并进行培养，胶原酶消化法应为首选。
(本文图见插图第3页)
参考文献
1.Alpini G,Phillips JO,Vroman B,et al.Recent advances in the isolation of liver cells.Hepatology,1994,20(2):495
2.吴喜贵，许霖水.肝细胞的直接分离与培养. 第三军医大学学报，1996，18(3):169
3.张蒙，苏映军，陈壁,等.大鼠肝细胞原代长期培养的形态学观察. 第四军医大学学报，1995,16(6):418
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4.Musat AI,Satter CA,Satter GL,et al. Re-establishment of cell polarity of rat hepatocytes in primary culture. Hepatology,1993,18(7):198
5.RaKba N,Melhaoui A,Loyer P,et al. Bgugaine, a pyrrolidine alkaloid from Arisarum vulgare,is a strong hepatotoxin in rat and human liver cell cultures. Toxicol Lett,1999,104(3):239
6.陈柯，高毅，潘玉先，等.原代猪肝细胞的分离获取及培养. 世界华人消化杂志，1999,7(3)：200
7.Liu ML, Mars WM, Zarnegar R,et al . Collagenase pretreatment and the mitogenic effects of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-α in adult rat liver. Hepatology,1994,19(6):1521
8.Rozga J,Williams F,Ro MS,et al.Development of a bioartificial liver :properties and function of a follow-fiber module inoculated with liver cells. Hepatology,1993,17(2):258
(1999-11-25 收稿), 百拇医药