线粒体肌病和脑肌病外周血细胞线粒体DNA的定量分析
作者：王朝霞 李晓东△ 陈清棠 贺茂林 吴小晶△△
单位：北京医科大学第一医院神经内科，北京 100034△北京红十字会朝阳医院神经内科 △△空军北京第466医院内科
关键词：线粒体肌病；线粒体脑肌病；DNA；线粒体
990317 摘 要 目的：了解线粒体肌病/脑肌病患者外周血细胞线粒体DNA的拷贝数量有无异常。方法：用分子杂交技术对10例线粒体肌病/脑肌病患者和16例正常对照者的外周血细胞线粒体DNA进行定量分析。结果：在线粒体肌病/脑肌病患者及正常对照者中，均未发现外周血细胞线粒体DNA的片段缺失；但前者线粒体DNA的拷贝数量较后者明显增多。结论：在线粒体肌病/脑肌病患者的外周血细胞中，线粒体DNA的数量较正常人明显增加，与其肌肉中线粒体的异常增生相一致。这一实验方法对线粒体肌病/脑肌病的初筛有一定价值。
中国图书资料分类法分类号 R746.9
, http://www.100md.com
Quantitative analysis of mitochondrial DNA in peripheral
blood cellsof patients with mitochondrial
myopathy/encephalomyopathy
WANG Zhao-Xia#, LI Xiao-Dong, CHEN Qing-Tang, HE Mao-Lin, WU Xiao-Jing
(#Department of Neurology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Mitochondrial myopathies Mitochondrial encephalomyopathies DNA，mitochondrial
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective: To determine the mitochondrial DNA contents in the peripheral blood cells of patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy. Methods: A quantitative analysis was carried out in mitochondrial DNA of peripheral blood cells from patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy and normal controls by Southern blotting. Results: Mitochondrial DNA deletions of peripheral blood cells were not found in patients, and nor in the normal control group. However, the amount of mitochondrial DNA in the peripheral blood cells in the patients was much higher than that in normal controls. Conclusison: In the peripheral blood cells of patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy, the amount of mitochondrial DNA was much higher than that in the normal controls, which was consistent with the mitochondrial proliferation in the muscle cells of these patients. This method is of some value in screening mitochondrial myopathy/encephalomyopathy.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ,1999,31:255-257)
线粒体肌病和脑肌病是一大类以线粒体功能异常为主要病因学的疾病。它包括卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)、慢性进行性眼外肌瘫痪(chronic progressive external ophthalmoplegia , CPEO)、肌阵挛型癫痫伴蓬毛样红纤维( myoclonic epilepsy with ragged-red-fiber, MERRF)、线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidemia and stroke-like episodes, MELAS)及以骨骼肌受累为主的线粒体肌病等。组织病理学检查所见的蓬毛样红纤维(ragged-red-fiber, RRF)和类结晶样包涵体是诊断此病的主要依据之一。最近的分子生物学研究表明此类疾病主要与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的异常有关[1,2]。本试验对线粒体肌病/脑肌病患者及正常对照者的外周血细胞mtDNA进行了定量比较，以了解线粒体肌病/脑肌病患者外周血细胞mtDNA的数量有无变化。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验对象
实验对象分为线粒体肌病/脑肌病组和对照组。线粒体肌病/脑肌病组男、女各5例，23～55岁，来自1995～1997年本院神经内科门诊及住院病人；包括线粒体肌病6例，CPEO2例，MERRF2例，患者的临床特点均符合线粒体肌病/脑肌病临床诊断标准[3]，除1例CPEO未做肌活检外，其余9例均经肌肉病理检查证实。正常对照组16例，其年龄分布与病例组相比差异无显著性，均来自本院工作人员中自愿献血者。
1.2 主要实验材料
限制性内切酶PvuⅡ、蛋白酶K等生化试剂购自华美生物工程公司。α-32P-dCTP购自亚辉生物技术公司。尼龙膜为美国Amersham公司产品。随机引物标记试剂盒购自美国Promega公司。mtDNA全长探针由美国华盛顿大学姜新生博士赠送，18SrDNA质粒由美国哥伦比亚大学Schon博士赠送。
, 百拇医药
1.3 实验方法
提取外周血细胞总DNA：取肘静脉血5～10ml，38g.L-1抗凝后，常规酚/氯仿法提取DNA。制备探针：mtDNA全长探针约16.6kb，18SrDNA探针约为5.8kb。Southern杂交：将2～5μg总DNA用Pvu Ⅱ内切酶酶切后，8g.L-1琼脂糖凝胶分离，转膜、杂交、放射自显影。将膜进行两次杂交，第1次只与mtDNA全长探针杂交，第2次则与mtDNA全长探针及18 SrDNA探针(32P标记)同时杂交。密度扫描：用激光扫描仪扫描X光片上的2个杂交条带，去除本底后，获取相对值。统计学处理：用成组比较t检验法将所得数据进行统计学处理。
2 结果
, http://www.100md.com 当只用mtDNA全长探针进行杂交时，杂交片上只显示一条16.6kb的正常片段，未发现其它异常条带(结果未显示)。当与两个探针(mtDNA全长探针和18SrDNA探针)同时杂交时，杂交片上每个泳道显示两个杂交带(图1、2)，长度分别为16.6kb及12.0kb,前者密度代表mtDNA含量，后者是18SrDNA与核DNA的杂交带，其密度代表核DNA含量，将X光片用激光扫描仪进行二维扫描，得出两个条带各自的吸光系数乘以条带面积的积分值。二者的比值即为mtDNA的相对含量(表1)。由表1可见，线粒体肌病患者外周血mtDNA的数量与正常人相比，有显著性差异，前者约为后者的2.8倍。
1-4，7，10， mitochondrial myopathy; 5,8, CPEO; 6,9， MERRF.
图1 线粒体肌病/脑肌病组外周血细胞DNA的Southern杂交图谱
, http://www.100md.com
Figure 1 Autoradiograms of Southern blot
of total DNA in peripheral blood cells from patients
with mitochondrial myopathy/encephalomyopathies
表1 病例组和对照组外周血细胞线粒体DNA数量的统计学分析
Table 1 Statistical analysis of mtDNA amount
in peripheral blood cells between patient group and control one Groups
, 百拇医药
s
t
P
Patients
Control
0.76
0.27
0.21
0.17
5.98
<0.01
图2 正常对照组外周血细胞DNA的Southern杂交图谱
, 百拇医药
Figure 2 Autoradiograms of Southern blots of total DNA
in peripheral blood cells from normal controls
3 讨论
我们的实验结果表明，在线粒体肌病/脑肌病患者的外周血细胞中，用Southernblot法未发现mtDNA的缺失，与文献报道一致[4]。此因mtDNA具有异质性和有丝分离性(mitoticsegregation)，即野生型和突变型mtDNA可存在于同一类细胞中，但它们可随细胞分裂而分配到不同细胞，最终可能达到同质性。分裂旺盛的细胞(如血细胞)往往有排斥突变mtDNA的趋势，朝着具有全部正常型mtDNA的方向发展；而分裂不旺盛的细胞(如肌细胞)则会逐渐累积突变型的mtDNA，朝着具有全部突变型mtDNA的方向发展。所以在有突变的病人中，不同组织间野生型和突变型mtDNA的比例相差很悬殊，肌肉、脑、肝、肾所含的突变mtDNA比例较高，这些组织可用Southernblot检测到缺失；而外周血中缺失型mtDNA的比例很少，极少报道用Southernblot检测到外周血中mtDNA的缺失(除了Pearson's综合征患者，其外周血mtDNA缺失的比例很高，可用Southernblot检测到缺失的存在)[5]。
, 百拇医药
近10年的分子生物学研究表明，在线粒体肌病/脑肌病中，KSS和CPEO与mtDNA的4977bp片段缺失有关，MERRF和MELAS则与mtDNA的点突变有关(前者与nt8344、nt8356，后者与nt3243、nt3271有关)[3]。但关于mtDNA的拷贝数量的变化，尤其是mtDNA与线粒体二者数量的增加是否同步，文献报道较少。Moraes等对200多名不同类型线粒体脑肌病和线粒体肌病患者的肌肉进行了Southern杂交分析，发现与肌纤维内线粒体的增生相一致的是，大部分患者的mtDNA的拷贝数量亦增加。我们采用以前介绍的方法[6]，对mtDNA进行定量，结果表明，在线粒体肌病和脑肌病患者中，不但肌纤维内线粒体异常增殖(RRF)，其外周血细胞mtDNA的拷贝数量亦比正常人明显增加，且前者的均值约为后者的两倍。我们尚未发现对线粒体肌病/脑肌病的外周血细胞mtDNA进行定量分析的文献报道。有关mtDNA拷贝数量的异常，可发生于不同病理或生理情况下(如在正常人mtDNA拷贝数量随年龄增加亦有增高趋势)，以满足不同情况下细胞能量代谢的需要。在本实验中，因为未发现mtDNA有片段缺失，所以我们推测在这些患者的外周血细胞中，mtDNA全部为野生型(但不能除外有无点突变，需进一步检测)。结合文献，我们分析线粒体肌病/脑肌病外周血细胞mtDNA拷贝数量增多的原因，可能有以下几方面：一是可能存在一个代谢反馈环路，当正常线粒体功能受损时，细胞通过刺激线粒体及mtDNA增殖来代偿减少的氧化磷酸化能力，因突变型mtDNA亦具有复制能力，所以野生型和突变型的数量均增多，但因为血细胞有排斥突变型mtDNA的趋势，最终导致在外周血细胞中只有野生型或仅有极少量的突变型mtDNA；二是野生型mtDNA顺式控制作用，因为野生型mtDNA因基因突变而被抑制或失活，这样突变型mtDNA的量就超过野生型，导致与细胞能量状态及代谢需要无关的突变型的过度增殖[7]。进一步加重了线粒体功能的损害。
, http://www.100md.com
我们的实验结果表明，在线粒体肌病/脑肌病患者中，虽然用Southern杂交的方法未检测出外周血细胞mtDNA存在片段缺失，但利用杂交的方法对mtDNA进行初步定量分析，则发现病例组与对照组有显著的统计学差异，鉴于目前样本量较少，还有待加大样本量，进行各年龄组间的配对检验。所以当怀疑为线粒体(脑)肌病而患者又因某些原因不能行肌肉活检时，可以用此方法进行初筛，因为本法创伤性小，易于为患者接受。若能同时进行外周血mtDNA的PCR检测[8]，则可对线粒体肌病/脑肌病的诊断提供更充分的依据。
参考文献
1 Shoffner JM, Lott MT, Lezza AMS, et al. Myoclonic epilepsy and ragged-red fiber disease(MERRF) is associated with a mitochondrial DNA tRNALys mutation. Cell, 1990,61:931-937
, http://www.100md.com
2 Moraes CT, Ricci E, Bonilla E, et al. The mitochondrial tRNALys(UUR) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am J Hum Genet, 1992,50:934-949
3 Dimauro S, Moraes CT. Mitochondrial encephalomyopathies. Arch Neurol, 1993, 50: 1197-1208
4 Zeviani M, Anotokzzi C. Defects of mitochondrial DNA. Brain Pathol, 1992, 2:121-132
, 百拇医药
5 Poulton J, Deadman ME, Ramacharan S, et al. Germ-line deletions of mtDNA in mitochondrial myopathy. Am J Hum Genet, 1991, 48: 649-653
6 李晓东, 陈清棠, 吴小晶, 等. 帕金森病白细胞线粒体DNA定量分析. 中华神经科杂志, 1997, 30: 211-213
7 Shoubridge EA, Karpati G, Hastings KEM. Deletion mutants are functionally dominant over wild type mitochondrial genomes in skeletal muscle fiber segments in mitochondrial disease. Cell, 1990, 62: 43-49
8 李晓东, 王朝霞， 高 枫, 等. 线粒体肌病和脑肌病白细胞线粒体DNA缺失分析. 中国神经精神疾病杂志, 1998, 24: 297-298
(1999-03-12收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学第一医院神经内科，北京 100034△北京红十字会朝阳医院神经内科 △△空军北京第466医院内科
关键词：线粒体肌病；线粒体脑肌病；DNA；线粒体
990317 摘 要 目的：了解线粒体肌病/脑肌病患者外周血细胞线粒体DNA的拷贝数量有无异常。方法：用分子杂交技术对10例线粒体肌病/脑肌病患者和16例正常对照者的外周血细胞线粒体DNA进行定量分析。结果：在线粒体肌病/脑肌病患者及正常对照者中，均未发现外周血细胞线粒体DNA的片段缺失；但前者线粒体DNA的拷贝数量较后者明显增多。结论：在线粒体肌病/脑肌病患者的外周血细胞中，线粒体DNA的数量较正常人明显增加，与其肌肉中线粒体的异常增生相一致。这一实验方法对线粒体肌病/脑肌病的初筛有一定价值。
中国图书资料分类法分类号 R746.9
, http://www.100md.com
Quantitative analysis of mitochondrial DNA in peripheral
blood cellsof patients with mitochondrial
myopathy/encephalomyopathy
WANG Zhao-Xia#, LI Xiao-Dong, CHEN Qing-Tang, HE Mao-Lin, WU Xiao-Jing
(#Department of Neurology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Mitochondrial myopathies Mitochondrial encephalomyopathies DNA，mitochondrial
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective: To determine the mitochondrial DNA contents in the peripheral blood cells of patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy. Methods: A quantitative analysis was carried out in mitochondrial DNA of peripheral blood cells from patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy and normal controls by Southern blotting. Results: Mitochondrial DNA deletions of peripheral blood cells were not found in patients, and nor in the normal control group. However, the amount of mitochondrial DNA in the peripheral blood cells in the patients was much higher than that in normal controls. Conclusison: In the peripheral blood cells of patients with mitochondrial myopathy/encephalomyopathy, the amount of mitochondrial DNA was much higher than that in the normal controls, which was consistent with the mitochondrial proliferation in the muscle cells of these patients. This method is of some value in screening mitochondrial myopathy/encephalomyopathy.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ,1999,31:255-257)
线粒体肌病和脑肌病是一大类以线粒体功能异常为主要病因学的疾病。它包括卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)、慢性进行性眼外肌瘫痪(chronic progressive external ophthalmoplegia , CPEO)、肌阵挛型癫痫伴蓬毛样红纤维( myoclonic epilepsy with ragged-red-fiber, MERRF)、线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidemia and stroke-like episodes, MELAS)及以骨骼肌受累为主的线粒体肌病等。组织病理学检查所见的蓬毛样红纤维(ragged-red-fiber, RRF)和类结晶样包涵体是诊断此病的主要依据之一。最近的分子生物学研究表明此类疾病主要与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的异常有关[1,2]。本试验对线粒体肌病/脑肌病患者及正常对照者的外周血细胞mtDNA进行了定量比较，以了解线粒体肌病/脑肌病患者外周血细胞mtDNA的数量有无变化。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验对象
实验对象分为线粒体肌病/脑肌病组和对照组。线粒体肌病/脑肌病组男、女各5例，23～55岁，来自1995～1997年本院神经内科门诊及住院病人；包括线粒体肌病6例，CPEO2例，MERRF2例，患者的临床特点均符合线粒体肌病/脑肌病临床诊断标准[3]，除1例CPEO未做肌活检外，其余9例均经肌肉病理检查证实。正常对照组16例，其年龄分布与病例组相比差异无显著性，均来自本院工作人员中自愿献血者。
1.2 主要实验材料
限制性内切酶PvuⅡ、蛋白酶K等生化试剂购自华美生物工程公司。α-32P-dCTP购自亚辉生物技术公司。尼龙膜为美国Amersham公司产品。随机引物标记试剂盒购自美国Promega公司。mtDNA全长探针由美国华盛顿大学姜新生博士赠送，18SrDNA质粒由美国哥伦比亚大学Schon博士赠送。
, 百拇医药
1.3 实验方法
提取外周血细胞总DNA：取肘静脉血5～10ml，38g.L-1抗凝后，常规酚/氯仿法提取DNA。制备探针：mtDNA全长探针约16.6kb，18SrDNA探针约为5.8kb。Southern杂交：将2～5μg总DNA用Pvu Ⅱ内切酶酶切后，8g.L-1琼脂糖凝胶分离，转膜、杂交、放射自显影。将膜进行两次杂交，第1次只与mtDNA全长探针杂交，第2次则与mtDNA全长探针及18 SrDNA探针(32P标记)同时杂交。密度扫描：用激光扫描仪扫描X光片上的2个杂交条带，去除本底后，获取相对值。统计学处理：用成组比较t检验法将所得数据进行统计学处理。
2 结果
, http://www.100md.com 当只用mtDNA全长探针进行杂交时，杂交片上只显示一条16.6kb的正常片段，未发现其它异常条带(结果未显示)。当与两个探针(mtDNA全长探针和18SrDNA探针)同时杂交时，杂交片上每个泳道显示两个杂交带(图1、2)，长度分别为16.6kb及12.0kb,前者密度代表mtDNA含量，后者是18SrDNA与核DNA的杂交带，其密度代表核DNA含量，将X光片用激光扫描仪进行二维扫描，得出两个条带各自的吸光系数乘以条带面积的积分值。二者的比值即为mtDNA的相对含量(表1)。由表1可见，线粒体肌病患者外周血mtDNA的数量与正常人相比，有显著性差异，前者约为后者的2.8倍。
1-4，7，10， mitochondrial myopathy; 5,8, CPEO; 6,9， MERRF.
图1 线粒体肌病/脑肌病组外周血细胞DNA的Southern杂交图谱
, http://www.100md.com
Figure 1 Autoradiograms of Southern blot
of total DNA in peripheral blood cells from patients
with mitochondrial myopathy/encephalomyopathies
表1 病例组和对照组外周血细胞线粒体DNA数量的统计学分析
Table 1 Statistical analysis of mtDNA amount
in peripheral blood cells between patient group and control one Groups
, 百拇医药
s
t
P
Patients
Control
0.76
0.27
0.21
0.17
5.98
<0.01
图2 正常对照组外周血细胞DNA的Southern杂交图谱
, 百拇医药
Figure 2 Autoradiograms of Southern blots of total DNA
in peripheral blood cells from normal controls
3 讨论
我们的实验结果表明，在线粒体肌病/脑肌病患者的外周血细胞中，用Southernblot法未发现mtDNA的缺失，与文献报道一致[4]。此因mtDNA具有异质性和有丝分离性(mitoticsegregation)，即野生型和突变型mtDNA可存在于同一类细胞中，但它们可随细胞分裂而分配到不同细胞，最终可能达到同质性。分裂旺盛的细胞(如血细胞)往往有排斥突变mtDNA的趋势，朝着具有全部正常型mtDNA的方向发展；而分裂不旺盛的细胞(如肌细胞)则会逐渐累积突变型的mtDNA，朝着具有全部突变型mtDNA的方向发展。所以在有突变的病人中，不同组织间野生型和突变型mtDNA的比例相差很悬殊，肌肉、脑、肝、肾所含的突变mtDNA比例较高，这些组织可用Southernblot检测到缺失；而外周血中缺失型mtDNA的比例很少，极少报道用Southernblot检测到外周血中mtDNA的缺失(除了Pearson's综合征患者，其外周血mtDNA缺失的比例很高，可用Southernblot检测到缺失的存在)[5]。
, 百拇医药
近10年的分子生物学研究表明，在线粒体肌病/脑肌病中，KSS和CPEO与mtDNA的4977bp片段缺失有关，MERRF和MELAS则与mtDNA的点突变有关(前者与nt8344、nt8356，后者与nt3243、nt3271有关)[3]。但关于mtDNA的拷贝数量的变化，尤其是mtDNA与线粒体二者数量的增加是否同步，文献报道较少。Moraes等对200多名不同类型线粒体脑肌病和线粒体肌病患者的肌肉进行了Southern杂交分析，发现与肌纤维内线粒体的增生相一致的是，大部分患者的mtDNA的拷贝数量亦增加。我们采用以前介绍的方法[6]，对mtDNA进行定量，结果表明，在线粒体肌病和脑肌病患者中，不但肌纤维内线粒体异常增殖(RRF)，其外周血细胞mtDNA的拷贝数量亦比正常人明显增加，且前者的均值约为后者的两倍。我们尚未发现对线粒体肌病/脑肌病的外周血细胞mtDNA进行定量分析的文献报道。有关mtDNA拷贝数量的异常，可发生于不同病理或生理情况下(如在正常人mtDNA拷贝数量随年龄增加亦有增高趋势)，以满足不同情况下细胞能量代谢的需要。在本实验中，因为未发现mtDNA有片段缺失，所以我们推测在这些患者的外周血细胞中，mtDNA全部为野生型(但不能除外有无点突变，需进一步检测)。结合文献，我们分析线粒体肌病/脑肌病外周血细胞mtDNA拷贝数量增多的原因，可能有以下几方面：一是可能存在一个代谢反馈环路，当正常线粒体功能受损时，细胞通过刺激线粒体及mtDNA增殖来代偿减少的氧化磷酸化能力，因突变型mtDNA亦具有复制能力，所以野生型和突变型的数量均增多，但因为血细胞有排斥突变型mtDNA的趋势，最终导致在外周血细胞中只有野生型或仅有极少量的突变型mtDNA；二是野生型mtDNA顺式控制作用，因为野生型mtDNA因基因突变而被抑制或失活，这样突变型mtDNA的量就超过野生型，导致与细胞能量状态及代谢需要无关的突变型的过度增殖[7]。进一步加重了线粒体功能的损害。
, http://www.100md.com
我们的实验结果表明，在线粒体肌病/脑肌病患者中，虽然用Southern杂交的方法未检测出外周血细胞mtDNA存在片段缺失，但利用杂交的方法对mtDNA进行初步定量分析，则发现病例组与对照组有显著的统计学差异，鉴于目前样本量较少，还有待加大样本量，进行各年龄组间的配对检验。所以当怀疑为线粒体(脑)肌病而患者又因某些原因不能行肌肉活检时，可以用此方法进行初筛，因为本法创伤性小，易于为患者接受。若能同时进行外周血mtDNA的PCR检测[8]，则可对线粒体肌病/脑肌病的诊断提供更充分的依据。
参考文献
1 Shoffner JM, Lott MT, Lezza AMS, et al. Myoclonic epilepsy and ragged-red fiber disease(MERRF) is associated with a mitochondrial DNA tRNALys mutation. Cell, 1990,61:931-937
, http://www.100md.com
2 Moraes CT, Ricci E, Bonilla E, et al. The mitochondrial tRNALys(UUR) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am J Hum Genet, 1992,50:934-949
3 Dimauro S, Moraes CT. Mitochondrial encephalomyopathies. Arch Neurol, 1993, 50: 1197-1208
4 Zeviani M, Anotokzzi C. Defects of mitochondrial DNA. Brain Pathol, 1992, 2:121-132
, 百拇医药
5 Poulton J, Deadman ME, Ramacharan S, et al. Germ-line deletions of mtDNA in mitochondrial myopathy. Am J Hum Genet, 1991, 48: 649-653
6 李晓东, 陈清棠, 吴小晶, 等. 帕金森病白细胞线粒体DNA定量分析. 中华神经科杂志, 1997, 30: 211-213
7 Shoubridge EA, Karpati G, Hastings KEM. Deletion mutants are functionally dominant over wild type mitochondrial genomes in skeletal muscle fiber segments in mitochondrial disease. Cell, 1990, 62: 43-49
8 李晓东, 王朝霞， 高 枫, 等. 线粒体肌病和脑肌病白细胞线粒体DNA缺失分析. 中国神经精神疾病杂志, 1998, 24: 297-298
(1999-03-12收稿), 百拇医药