胆固醇在壳聚糖珠上的吸附
作者：刘筱虹 刘满英 蔡广铭
单位：河北医科大学基础医学院医用化学教研室(石家庄050017)
关键词：壳聚糖；吸附剂；氨基酸，胆固醇；吸附作用；脂蛋白类
河北医科大学学报990428
中图号 R446.1
本文采用壳聚糖和修饰壳聚糖作为吸附剂,考察其对胆固醇的吸附作用,以期寻找脂蛋白胆固醇血液灌流选择性吸附剂。
1 资料与方法
1.1 试剂及材料:壳聚糖(成都智达公司)脱乙酰度85%,50%戊二醛(天津医药公司),胆固醇(北京化工厂),苯丙氨酸(军事医学科学院药材供应站),色氨酸(中国上海第二军医大学)。
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1.2 壳聚糖珠制备:在100 ml透平油中加入3%～4%的壳聚糖醋酸溶液25 ml,搅拌分散成珠,加入计算量的1%戊二醛溶液(加入戊二醛的量是壳聚糖自由氨基量的一半为半交联壳聚糖,加入戊二醛的量与壳聚糖自由氨基量相等为全交联壳聚糖)。升温40 ℃并恒温1 h,再加入NaOH稀溶液,调pH值在9～10,升温60～70 ℃,反应3 h后,抽滤;分别用石油醚,丙酮和乙醇洗涤,再用去离子水洗至中性,50 ℃干燥,得壳聚糖珠。
1.3 氨基酸修饰壳聚糖珠制备:称取1 g壳聚糖珠加入30 ml的氨基酸溶液中,在30 ℃恒温吸附达平衡后,抽滤;将该壳聚糖珠再加入30 ml的1 %戊二醛溶液,30 ℃恒温1 h,然后用pH为7.4的磷酸缓冲液洗涤,再重复加入氨基酸溶液,吸附达平衡后,抽滤干燥,得氨基酸修饰壳聚糖珠。
氨基酸接枝在壳聚糖珠上的量近似为壳聚糖珠吸附氨基酸的量,由氨基酸溶液浓度的降低确定。接枝苯丙氨酸的壳聚糖称为PheCTS85,接枝色氨酸的称为TryCTS85,接枝苯丙氨酸与色氨酸混合氨基酸的称为PheTryCTS85。氨基酸浓度的测定方法按文献[1]进行。
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1.4 在壳聚糖珠上胆固醇的吸附:准确称取不同吸附剂壳聚糖珠100 mg,加入胆固醇异丙醇标准溶液10 ml,25 ℃恒温振荡吸附。用甲醛法[2]测定溶液浓度的变化,计算吸附量。绘制吸附等温线。
1.5 血清脂蛋白凝胶电泳:以琼脂糖凝胶法分离不同脂蛋白,以磷钨酸钙溶液显色,观察各种珠对三类脂蛋白(高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,极低密度脂蛋白)的吸附情况。
2 结果
2.1 氨基酸的结合量:氨基酸接在壳聚糖珠上的量由溶液吸光度随时间变化表示(图1),实验结果见表1。通过计算,壳聚糖珠对苯丙氨酸最大吸附量为37.72 mg/g,对色氨酸的最大吸附量为26.59 mg/g,对混合氨基酸最大吸附量约为32.05 mg/g。
表1 氨基酸溶液吸光度变化
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氨基酸质量浓度(ρB/mg*ml-1)
吸光度
(A)
0 min
15 min
30 min
50 min
120 min
180 min
苯丙氨酸(Phe)
12.347
1
, 百拇医药
0.102
0.051
0.045
0.040
0.039
0.040
色氨酸(Try)
4.332
2
0.051
0.041
0.038
0.038
, 百拇医药
0.039
0.037
混合氨基酸(Phe Try)
12.347
3
0.077
0.040
0.036
0.034
0.031
0.032
4.332
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图1 氨基酸溶液吸光度随时间变化图
2.2 壳聚糖对胆固醇的吸附作用:用脱乙酰度为85 %的壳聚糖制备壳聚糖珠,经苯丙氨酸和色氨酸修饰后,分别得到不同种类修饰吸附剂,它们对胆固醇的吸附性能如下。
2.2.1 胆固醇浓度对吸附的影响:胆固醇标准溶液浓度增加,胆固醇在吸附剂上的吸附量增加,吸附达平衡的时间延长。25 ℃,胆固醇浓度为2.194 mg/ml时,PheCTS85珠的最大吸附量可达42.67 mg/g,平衡时间在10 h以上;胆固醇浓度为1.187 mg/ml时,其最大吸附量为23.07 mg/g,平衡时间在6 h以上(图2)。
图2 胆固醇浓度对吸附量的影响(25℃)
2.2.2 胆固醇在不同吸附剂上的吸附作用:各种不同吸附剂在25 ℃时对胆固醇吸附等温线(图3),由图可知交联壳聚糖对胆固醇吸附能力最低。交联珠经不同氨基酸修饰后吸附能力提高,其中半交联修饰珠比全交联修饰珠吸附能力高,而且苯丙氨酸修饰的珠比色氨酸修饰的珠吸附能力高,各种吸附剂达平衡的时间大约在9 h以上。
, 百拇医药
图3 胆固醇在不同吸附剂上的吸附等温线(25℃)
2.2.3 壳聚糖珠对人血清脂蛋白的吸附:用PheCTS85,TryCTS85及PheTryCTS85珠对人血清脂蛋白胆固醇的直接吸附进行了考察,当血清总胆固醇含量在4.93 mol/L,吸附剂与血清之比为1∶10(1 mg/10 ml); 37 ℃,吸附1 h,胆固醇去除率分别为16 %、21 %和11 %,色氨酸修饰珠吸附效果最好。琼脂糖电泳结果表明:用氨基酸修饰后的壳聚糖珠对血清中脂蛋白有很好的吸附效果,但对3种不同脂蛋白吸附选择性较差。
3 讨论
壳聚糖珠对苯丙氨酸和色氨酸的吸附行为十分相似,都在40 min左右可达平衡,这说明用这两种混合氨基酸修饰壳聚糖珠是可行的。
壳聚糖经氨基酸修饰后,对胆固醇的吸附作用提高,这是由于壳聚糖珠经苯丙氨酸和色氨酸修饰后,其疏水作用增强[3],对胆固醇的吸附能力提高。用苯丙氨酸修饰的珠比用色氨酸修饰的珠吸附效果更好,这可能是由于苯丙氨酸的苯环比色氨酸的吲哚基有更强的疏水性,这就说明吸附剂疏水作用对胆固醇的吸附起重要作用。壳聚糖珠的交联程度对胆固醇的吸附有很大影响,胆固醇的分子量比较大,吸附剂交联度越高、空隙越小,其有效吸附越小,故吸附量减小。
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修饰壳聚糖珠对人血清脂蛋白的吸附实验结果还表明:①色氨酸修饰珠对血清脂蛋白胆固醇吸附效果好于苯丙氨酸修饰珠。②不同吸附剂对血清中的胆固醇吸附量明显低于标准溶液的胆固醇吸附量,这是由于血清胆固醇与标准溶液中的胆固醇从组成结构到存在状态都完全不同外,血清中的其他复杂成份也阻碍了脂蛋白胆固醇的吸附。
参考文献
1.阮伸.茚三酮比色法测定氨基酸的改良.化学世界,1986,27(8):357
2.黄载周.新法测定血清总胆固醇甲醛法.中华医学检验杂志,1982,5(1):64
3.Beena MS,Thomas CH,Chandra P.Sharna Phenylalanine,tryptophan immobilized chitosan beads as adsorbents for selective removal of immunoproteins.J Biomater Appl,1994,8(4):385
(1998-06-16 收稿), 百拇医药
单位：河北医科大学基础医学院医用化学教研室(石家庄050017)
关键词：壳聚糖；吸附剂；氨基酸，胆固醇；吸附作用；脂蛋白类
河北医科大学学报990428
中图号 R446.1
本文采用壳聚糖和修饰壳聚糖作为吸附剂,考察其对胆固醇的吸附作用,以期寻找脂蛋白胆固醇血液灌流选择性吸附剂。
1 资料与方法
1.1 试剂及材料:壳聚糖(成都智达公司)脱乙酰度85%,50%戊二醛(天津医药公司),胆固醇(北京化工厂),苯丙氨酸(军事医学科学院药材供应站),色氨酸(中国上海第二军医大学)。
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1.2 壳聚糖珠制备:在100 ml透平油中加入3%～4%的壳聚糖醋酸溶液25 ml,搅拌分散成珠,加入计算量的1%戊二醛溶液(加入戊二醛的量是壳聚糖自由氨基量的一半为半交联壳聚糖,加入戊二醛的量与壳聚糖自由氨基量相等为全交联壳聚糖)。升温40 ℃并恒温1 h,再加入NaOH稀溶液,调pH值在9～10,升温60～70 ℃,反应3 h后,抽滤;分别用石油醚,丙酮和乙醇洗涤,再用去离子水洗至中性,50 ℃干燥,得壳聚糖珠。
1.3 氨基酸修饰壳聚糖珠制备:称取1 g壳聚糖珠加入30 ml的氨基酸溶液中,在30 ℃恒温吸附达平衡后,抽滤;将该壳聚糖珠再加入30 ml的1 %戊二醛溶液,30 ℃恒温1 h,然后用pH为7.4的磷酸缓冲液洗涤,再重复加入氨基酸溶液,吸附达平衡后,抽滤干燥,得氨基酸修饰壳聚糖珠。
氨基酸接枝在壳聚糖珠上的量近似为壳聚糖珠吸附氨基酸的量,由氨基酸溶液浓度的降低确定。接枝苯丙氨酸的壳聚糖称为PheCTS85,接枝色氨酸的称为TryCTS85,接枝苯丙氨酸与色氨酸混合氨基酸的称为PheTryCTS85。氨基酸浓度的测定方法按文献[1]进行。
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1.4 在壳聚糖珠上胆固醇的吸附:准确称取不同吸附剂壳聚糖珠100 mg,加入胆固醇异丙醇标准溶液10 ml,25 ℃恒温振荡吸附。用甲醛法[2]测定溶液浓度的变化,计算吸附量。绘制吸附等温线。
1.5 血清脂蛋白凝胶电泳:以琼脂糖凝胶法分离不同脂蛋白,以磷钨酸钙溶液显色,观察各种珠对三类脂蛋白(高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,极低密度脂蛋白)的吸附情况。
2 结果
2.1 氨基酸的结合量:氨基酸接在壳聚糖珠上的量由溶液吸光度随时间变化表示(图1),实验结果见表1。通过计算,壳聚糖珠对苯丙氨酸最大吸附量为37.72 mg/g,对色氨酸的最大吸附量为26.59 mg/g,对混合氨基酸最大吸附量约为32.05 mg/g。
表1 氨基酸溶液吸光度变化
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氨基酸质量浓度(ρB/mg*ml-1)
吸光度
(A)
0 min
15 min
30 min
50 min
120 min
180 min
苯丙氨酸(Phe)
12.347
1
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0.102
0.051
0.045
0.040
0.039
0.040
色氨酸(Try)
4.332
2
0.051
0.041
0.038
0.038
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0.039
0.037
混合氨基酸(Phe Try)
12.347
3
0.077
0.040
0.036
0.034
0.031
0.032
4.332
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图1 氨基酸溶液吸光度随时间变化图
2.2 壳聚糖对胆固醇的吸附作用:用脱乙酰度为85 %的壳聚糖制备壳聚糖珠,经苯丙氨酸和色氨酸修饰后,分别得到不同种类修饰吸附剂,它们对胆固醇的吸附性能如下。
2.2.1 胆固醇浓度对吸附的影响:胆固醇标准溶液浓度增加,胆固醇在吸附剂上的吸附量增加,吸附达平衡的时间延长。25 ℃,胆固醇浓度为2.194 mg/ml时,PheCTS85珠的最大吸附量可达42.67 mg/g,平衡时间在10 h以上;胆固醇浓度为1.187 mg/ml时,其最大吸附量为23.07 mg/g,平衡时间在6 h以上(图2)。
图2 胆固醇浓度对吸附量的影响(25℃)
2.2.2 胆固醇在不同吸附剂上的吸附作用:各种不同吸附剂在25 ℃时对胆固醇吸附等温线(图3),由图可知交联壳聚糖对胆固醇吸附能力最低。交联珠经不同氨基酸修饰后吸附能力提高,其中半交联修饰珠比全交联修饰珠吸附能力高,而且苯丙氨酸修饰的珠比色氨酸修饰的珠吸附能力高,各种吸附剂达平衡的时间大约在9 h以上。
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图3 胆固醇在不同吸附剂上的吸附等温线(25℃)
2.2.3 壳聚糖珠对人血清脂蛋白的吸附:用PheCTS85,TryCTS85及PheTryCTS85珠对人血清脂蛋白胆固醇的直接吸附进行了考察,当血清总胆固醇含量在4.93 mol/L,吸附剂与血清之比为1∶10(1 mg/10 ml); 37 ℃,吸附1 h,胆固醇去除率分别为16 %、21 %和11 %,色氨酸修饰珠吸附效果最好。琼脂糖电泳结果表明:用氨基酸修饰后的壳聚糖珠对血清中脂蛋白有很好的吸附效果,但对3种不同脂蛋白吸附选择性较差。
3 讨论
壳聚糖珠对苯丙氨酸和色氨酸的吸附行为十分相似,都在40 min左右可达平衡,这说明用这两种混合氨基酸修饰壳聚糖珠是可行的。
壳聚糖经氨基酸修饰后,对胆固醇的吸附作用提高,这是由于壳聚糖珠经苯丙氨酸和色氨酸修饰后,其疏水作用增强[3],对胆固醇的吸附能力提高。用苯丙氨酸修饰的珠比用色氨酸修饰的珠吸附效果更好,这可能是由于苯丙氨酸的苯环比色氨酸的吲哚基有更强的疏水性,这就说明吸附剂疏水作用对胆固醇的吸附起重要作用。壳聚糖珠的交联程度对胆固醇的吸附有很大影响,胆固醇的分子量比较大,吸附剂交联度越高、空隙越小,其有效吸附越小,故吸附量减小。
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修饰壳聚糖珠对人血清脂蛋白的吸附实验结果还表明:①色氨酸修饰珠对血清脂蛋白胆固醇吸附效果好于苯丙氨酸修饰珠。②不同吸附剂对血清中的胆固醇吸附量明显低于标准溶液的胆固醇吸附量,这是由于血清胆固醇与标准溶液中的胆固醇从组成结构到存在状态都完全不同外,血清中的其他复杂成份也阻碍了脂蛋白胆固醇的吸附。
参考文献
1.阮伸.茚三酮比色法测定氨基酸的改良.化学世界,1986,27(8):357
2.黄载周.新法测定血清总胆固醇甲醛法.中华医学检验杂志,1982,5(1):64
3.Beena MS,Thomas CH,Chandra P.Sharna Phenylalanine,tryptophan immobilized chitosan beads as adsorbents for selective removal of immunoproteins.J Biomater Appl,1994,8(4):385
(1998-06-16 收稿), 百拇医药