维甲酸诱导鼠磨牙牙胚midkine基因表达的研究
作者：高玉光 韩建国 史俊南
单位：高玉光(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；史俊南(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；韩建国(市立医院，山 东 枣庄 277101)
关键词：维甲酸； 牙胚； midkine； RT-PCR； Southern 印迹
牙体牙髓牙周病学杂志000202 【摘 要】 目的：探讨RA与midkine (MK)基因 表达在牙胚发育过程中的相互关系。方法：将16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚分别置于含不同浓度的外源性RA(分别为5×10 -8 ，5×10-7 和5×10-6mol/L)的 RPMI 1640半固态培养基表面 。培养2d后分别提取总 RNA，经 RT-PCR 扩增25个循环，采用 Southern 印迹法检测MK mRNA 在牙胚组织中的表达变化。结果：体外培养2d后，对照组(无 外源性 RA )牙胚MK mRNA 的表达为弱阳性；随培养基中外源性 RA浓度的增加，牙胚组织中 MK mRNA 的表达逐渐增强。结论：MK基因在牙 胚发育中的作用可能受RA 调控。
, http://www.100md.com
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0061-02
The effects of retinoic acid on the expression of midkine gene in mouse tooth germ tissues in vitro
GAO Yu-guang, HAN Jian-guo， SHI Jun-nan
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 71 0032)
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of RA on the expression of midkine (MK) gene in mouse molar germs. M ETHODS: The first mandibular molar germs of the 16-day old mouse embr yos were separated and cultured on RPMI-1640 semisolid medium containing differe nt concentrat ion of exogenous RA(5×10-8, 5×10-7 and 5×10-6 mol/L ) for 2 days repectively. After the end of culture, isolating total RNA from cultured tooth germs. Amplication reaction was going on for 25 cycles by RT-PCR . The expression of MK gene in mouse molar germs was investigated by Southern blot. RESULTS: In control medium not containi ng RA, the expression of MK in mouse tooth germs was weak. With the increase of RA concentration i n medium, the expression of MK gene in tooth germs gradully increased. CONCLUSION: This study suggested that the function of MK gene in tooth germ development may be regulated by RA.
, 百拇医药
【Key words】 retinoic acid; tooth germ; midkine; RT-P CR; Southern blot
牙齿发育异常是临床上常见的牙体非龋性疾病， 与遗传、营养以及 某些药物的作用有关。维甲酸(retinoic acid, RA)是维生素A在体内代谢后的 主要活性产物。作为一种脂溶性类固醇激素，RA可直接与细胞核内的维甲酸受体结合，通过 激活核内维甲酸受体而发挥生物学作用[1]。以往研究表明，RA是维持胚胎正常发 育 以及人体正常功能所必需的成分之一。RA缺乏可妨碍鼠磨牙牙胚冠部形态的正常发生以及组 织细胞的分化，但RA调控牙胚发育的分子机制仍然不清[2，3]。mid kine (MK)在胚胎发育的中期呈一过性表达[4]，具体功能尚不清楚。在牙胚发育 过程中，MK在牙胚组织中分布广泛；阻断MK表达，可抑制牙胚正常形态发生和组织细胞的分 化[5]。本研究旨在通过观察RA对钟状期早期的鼠磨牙牙胚MK mRNA表达的诱导 ，探讨RA与MK 在牙胚发育过程中的相互关系。
, 百拇医药
1 材料和方法
本实验所用昆明小鼠由第四军医大学动物实验中心提供。小鼠胎龄以交配后次日见到阴道栓 的时间为0d。将胎龄为16d的昆明小鼠断颈处死，浸入750ml/L(v/v)乙醇中消毒15s。取胎 鼠下颌骨，体式显微镜下于Hanks液(含青霉素100U/ml, 链霉素100μɡ/ml)中分离下颌第一 磨牙牙胚。牙胚在预冷至4℃的Hanks液中充分洗涤后, 置于含不同浓度外源性RA (全反式； 5×10-8，5×10-7 和5×10-6mol/L)的RPMI 1640半固态培养基(含 100ml/L胎牛血清，50U/ml青霉素, 50μɡ/ml链霉素, 200μɡ/ml维生素C, 5g/L琼脂)表 面,以无外源性RA的培养基作为对照,于37℃,含50ml/L CO2的恒温恒湿培养箱中继续培养4 8h。 培养结束后分别用TRIzol RNA提取试剂盒(GIBCO)提取总RNA;用RT-PCR试剂盒(GIBCO)扩增25 个循环(具体操作步骤依据试剂盒要求进行),同时以肌动蛋白(actin)为内参照cDNA。采用So ut hern印迹法(探针为Digoxigenin标记的寡核甘酸探针)检测MK mRNA在体外培养牙胚组织 中的表达变化。
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2 结果
Southern印迹的图像密度分析结果显示：在无外源性RA的培养基中，MK基因在牙胚组织 中呈弱表达；当外源性RA以不同浓度加入培养基后，MK基因在牙胚组织中的表达随培养 基中RA浓度的增加(5×10-8，5×10-7和5×10-6mol/L) 明显 增强(图1)。
图1 维甲酸诱导鼠磨牙牙胚MK基因表达的研究
E/C表示图像密度分析的灰度值之比 E：实验组 C：对照
3 讨论
MK作为一种肝素结合(heparin-binding)生长因子，在胚胎发育的中期发挥多方面的生 物学功能，如调节细胞的增殖与分化等。在牙胚发育过程中，MK基因呈时空表达：在牙 胚发育的早期阶段，MK基因主要在牙乳头细胞中表达；当牙胚的硬组织开始形成之后， MK基因在牙乳头细胞中的表达逐渐降低；将抗MK抗体加入培养基中，可抑制牙胚正 常形态的发生和组织细胞的分化，表明MK是牙胚早期发育所必需的生长因子之一。RA是 一种类固醇激素，与细胞 核内的维甲酸受体结合后，通过激活核内维甲酸受体而发挥生物学作用，是牙胚正常形态发 生和细胞分化所必需的成分之一。
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牙胚发育是一个连续的生物学过程，小鼠磨牙牙胚的体外培养是研究这一生物学过程的良 好模型[6]。16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚处于钟状期早期，MK基因在牙胚 组织，尤其在牙乳头细胞中表达广泛；而维甲酸受体(RARs)在钟状期早期的牙胚组织中也 有广泛分布。因此采用钟状期早期的小鼠磨牙牙胚研究RA与MK基因表达的相互关系比较 适宜。
在牙胚发育过程中，MK与RA有某些相似的生物学功能，均可诱导牙胚形态发生和组织 细胞分化，但在牙胚发育过程中RA与MK基因表达的相互关系仍不十分清楚。我们的研究 结果显示，随外源性RA浓度的增加，MK基因在牙胚组织中的的表达逐渐增强，表明外源 性RA能够诱导牙胚组织中MK基因的表达。我们还发现在无外源性RA 的培养基中MK 基因仍有弱表达，表明MK不仅受RA调控，还可能受到其它一些未知因子的调控。
本研究的结果提示在牙胚发育过程中MK基因的作用受RA调控。
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【参考文献】
[1] Bloch-Zupan A, Decimo D, Loriot M, et al. Expression of nu clear retinoic acid nuclear receptors during mouse odontogenesis. Differentiation, 1994, 57(3): 195
[2] 韩建国，高玉光，樊明文. 维甲酸缺乏对鼠磨牙牙胚冠部形态发生的影响 . 牙体牙髓牙周病学杂志， 1998，9(2)： 93
[3] Bloch-Zupan A, Leveillard T, Gorry P, et al. Expression of p 21WAF1/CIP1 during mouse odontogenesis. Eur J Oral Sci,1998, 106(suppl): 93
, 百拇医药
[4] Matsubara S, Tomomura M, Kadomatsu K, et al. Structure of ret inoic acid-responsive gene, MK, which is transiently activated during the di fferentiation of embryonal carcinoma cells and the mid-gestation period of mouse embryogenesis. J Biol Chem, 1990, 265(16): 9441
[5] Mitsiadis TA, Muramatsu T, Muramatsu H, et al. Midk ine(MK), a heparin-binding growth/differentiation factor, is regulated by retinoic acid and epithelial-mesenchymal interaction in the developing mouse tooth, and affects cell proliferation and morphogenesis. J Cell Biol,1995, 129(1 ): 267
[6] 高玉光，樊明文，边专, 等. 维甲酸对鼠磨牙牙胚冠部形态发生的影响. 中华口腔医学杂志， 1998,33(6)：258
[7] 黄培堂,译. PCR技术实验指南. 北京：科学出版社，1998. 205
收稿日期：1999-10-19, http://www.100md.com
单位：高玉光(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；史俊南(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；韩建国(市立医院，山 东 枣庄 277101)
关键词：维甲酸； 牙胚； midkine； RT-PCR； Southern 印迹
牙体牙髓牙周病学杂志000202 【摘 要】 目的：探讨RA与midkine (MK)基因 表达在牙胚发育过程中的相互关系。方法：将16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚分别置于含不同浓度的外源性RA(分别为5×10 -8 ，5×10-7 和5×10-6mol/L)的 RPMI 1640半固态培养基表面 。培养2d后分别提取总 RNA，经 RT-PCR 扩增25个循环，采用 Southern 印迹法检测MK mRNA 在牙胚组织中的表达变化。结果：体外培养2d后，对照组(无 外源性 RA )牙胚MK mRNA 的表达为弱阳性；随培养基中外源性 RA浓度的增加，牙胚组织中 MK mRNA 的表达逐渐增强。结论：MK基因在牙 胚发育中的作用可能受RA 调控。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0061-02
The effects of retinoic acid on the expression of midkine gene in mouse tooth germ tissues in vitro
GAO Yu-guang, HAN Jian-guo， SHI Jun-nan
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 71 0032)
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of RA on the expression of midkine (MK) gene in mouse molar germs. M ETHODS: The first mandibular molar germs of the 16-day old mouse embr yos were separated and cultured on RPMI-1640 semisolid medium containing differe nt concentrat ion of exogenous RA(5×10-8, 5×10-7 and 5×10-6 mol/L ) for 2 days repectively. After the end of culture, isolating total RNA from cultured tooth germs. Amplication reaction was going on for 25 cycles by RT-PCR . The expression of MK gene in mouse molar germs was investigated by Southern blot. RESULTS: In control medium not containi ng RA, the expression of MK in mouse tooth germs was weak. With the increase of RA concentration i n medium, the expression of MK gene in tooth germs gradully increased. CONCLUSION: This study suggested that the function of MK gene in tooth germ development may be regulated by RA.
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【Key words】 retinoic acid; tooth germ; midkine; RT-P CR; Southern blot
牙齿发育异常是临床上常见的牙体非龋性疾病， 与遗传、营养以及 某些药物的作用有关。维甲酸(retinoic acid, RA)是维生素A在体内代谢后的 主要活性产物。作为一种脂溶性类固醇激素，RA可直接与细胞核内的维甲酸受体结合，通过 激活核内维甲酸受体而发挥生物学作用[1]。以往研究表明，RA是维持胚胎正常发 育 以及人体正常功能所必需的成分之一。RA缺乏可妨碍鼠磨牙牙胚冠部形态的正常发生以及组 织细胞的分化，但RA调控牙胚发育的分子机制仍然不清[2，3]。mid kine (MK)在胚胎发育的中期呈一过性表达[4]，具体功能尚不清楚。在牙胚发育 过程中，MK在牙胚组织中分布广泛；阻断MK表达，可抑制牙胚正常形态发生和组织细胞的分 化[5]。本研究旨在通过观察RA对钟状期早期的鼠磨牙牙胚MK mRNA表达的诱导 ，探讨RA与MK 在牙胚发育过程中的相互关系。
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1 材料和方法
本实验所用昆明小鼠由第四军医大学动物实验中心提供。小鼠胎龄以交配后次日见到阴道栓 的时间为0d。将胎龄为16d的昆明小鼠断颈处死，浸入750ml/L(v/v)乙醇中消毒15s。取胎 鼠下颌骨，体式显微镜下于Hanks液(含青霉素100U/ml, 链霉素100μɡ/ml)中分离下颌第一 磨牙牙胚。牙胚在预冷至4℃的Hanks液中充分洗涤后, 置于含不同浓度外源性RA (全反式； 5×10-8，5×10-7 和5×10-6mol/L)的RPMI 1640半固态培养基(含 100ml/L胎牛血清，50U/ml青霉素, 50μɡ/ml链霉素, 200μɡ/ml维生素C, 5g/L琼脂)表 面,以无外源性RA的培养基作为对照,于37℃,含50ml/L CO2的恒温恒湿培养箱中继续培养4 8h。 培养结束后分别用TRIzol RNA提取试剂盒(GIBCO)提取总RNA;用RT-PCR试剂盒(GIBCO)扩增25 个循环(具体操作步骤依据试剂盒要求进行),同时以肌动蛋白(actin)为内参照cDNA。采用So ut hern印迹法(探针为Digoxigenin标记的寡核甘酸探针)检测MK mRNA在体外培养牙胚组织 中的表达变化。
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2 结果
Southern印迹的图像密度分析结果显示：在无外源性RA的培养基中，MK基因在牙胚组织 中呈弱表达；当外源性RA以不同浓度加入培养基后，MK基因在牙胚组织中的表达随培养 基中RA浓度的增加(5×10-8，5×10-7和5×10-6mol/L) 明显 增强(图1)。
图1 维甲酸诱导鼠磨牙牙胚MK基因表达的研究
E/C表示图像密度分析的灰度值之比 E：实验组 C：对照
3 讨论
MK作为一种肝素结合(heparin-binding)生长因子，在胚胎发育的中期发挥多方面的生 物学功能，如调节细胞的增殖与分化等。在牙胚发育过程中，MK基因呈时空表达：在牙 胚发育的早期阶段，MK基因主要在牙乳头细胞中表达；当牙胚的硬组织开始形成之后， MK基因在牙乳头细胞中的表达逐渐降低；将抗MK抗体加入培养基中，可抑制牙胚正 常形态的发生和组织细胞的分化，表明MK是牙胚早期发育所必需的生长因子之一。RA是 一种类固醇激素，与细胞 核内的维甲酸受体结合后，通过激活核内维甲酸受体而发挥生物学作用，是牙胚正常形态发 生和细胞分化所必需的成分之一。
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牙胚发育是一个连续的生物学过程，小鼠磨牙牙胚的体外培养是研究这一生物学过程的良 好模型[6]。16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚处于钟状期早期，MK基因在牙胚 组织，尤其在牙乳头细胞中表达广泛；而维甲酸受体(RARs)在钟状期早期的牙胚组织中也 有广泛分布。因此采用钟状期早期的小鼠磨牙牙胚研究RA与MK基因表达的相互关系比较 适宜。
在牙胚发育过程中，MK与RA有某些相似的生物学功能，均可诱导牙胚形态发生和组织 细胞分化，但在牙胚发育过程中RA与MK基因表达的相互关系仍不十分清楚。我们的研究 结果显示，随外源性RA浓度的增加，MK基因在牙胚组织中的的表达逐渐增强，表明外源 性RA能够诱导牙胚组织中MK基因的表达。我们还发现在无外源性RA 的培养基中MK 基因仍有弱表达，表明MK不仅受RA调控，还可能受到其它一些未知因子的调控。
本研究的结果提示在牙胚发育过程中MK基因的作用受RA调控。
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【参考文献】
[1] Bloch-Zupan A, Decimo D, Loriot M, et al. Expression of nu clear retinoic acid nuclear receptors during mouse odontogenesis. Differentiation, 1994, 57(3): 195
[2] 韩建国，高玉光，樊明文. 维甲酸缺乏对鼠磨牙牙胚冠部形态发生的影响 . 牙体牙髓牙周病学杂志， 1998，9(2)： 93
[3] Bloch-Zupan A, Leveillard T, Gorry P, et al. Expression of p 21WAF1/CIP1 during mouse odontogenesis. Eur J Oral Sci,1998, 106(suppl): 93
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[4] Matsubara S, Tomomura M, Kadomatsu K, et al. Structure of ret inoic acid-responsive gene, MK, which is transiently activated during the di fferentiation of embryonal carcinoma cells and the mid-gestation period of mouse embryogenesis. J Biol Chem, 1990, 265(16): 9441
[5] Mitsiadis TA, Muramatsu T, Muramatsu H, et al. Midk ine(MK), a heparin-binding growth/differentiation factor, is regulated by retinoic acid and epithelial-mesenchymal interaction in the developing mouse tooth, and affects cell proliferation and morphogenesis. J Cell Biol,1995, 129(1 ): 267
[6] 高玉光，樊明文，边专, 等. 维甲酸对鼠磨牙牙胚冠部形态发生的影响. 中华口腔医学杂志， 1998,33(6)：258
[7] 黄培堂,译. PCR技术实验指南. 北京：科学出版社，1998. 205
收稿日期：1999-10-19, http://www.100md.com