提高长春花冠瘿细胞中吲哚生物碱含量的研究
作者：王淑芳 王宁宁 王 勇 田俊英
单位：南开大学生命科学学院(天津300071)
关键词：长春花冠瘿细胞；外源刺激物；吲哚生物碱
中草药/990227摘 要 研究了长春花冠瘿细胞接种物年龄与接种量对悬浮培养细胞生物产量的影响，探讨了以大丽花轮枝孢菌的匀浆物为外源刺激物处理冠瘿细胞，对细胞生长和吲哚生物碱积累的作用。确立了外源刺激物产生效应的最适条件。
Studies on the Enhancing Accumulation of Indole Alkaloids in Crown
Gall Cells of Madagascar Periwinkle (Catharanthus roseus)
, http://www.100md.com
Wang Shufang, Wang Ningning, Wang Yong, et al
.(College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071)
Abstract Influences of cell age (at inoculation) and the amount inoculated on the biological mass production of cultured cells in Catharanthus roseus (L.) G. Don suspension were investigated. Effects of treatment by Verticillium dahliae homogenate as elicitor on the cell growth and accumulation of indole alkaloids in the crown gall cells were studied and the optimal stimulation conditions were determined.
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Key words Catharanthus roseus (L.) G. Don elicitor indole alkaloids
夹竹桃科植物长春花Catharanthus roseus是一种重要的中草药。从它的根、茎、叶、种子中可分离出70余种生物碱，其中三分之一是属吲哚类化合物。它们均具有抗癌活性，其作用是抑制细胞有丝分裂，阻碍纺锤体形成，使其分裂中期中止。其中长春碱、长春新碱已用于临床治疗急性白血病、绒毛膜上皮癌等，对其它肿瘤也有一定疗效〔1〕。目前这些药物主要是从整体植株获得。但植物中该成分含量很低，生长受自然条件限制，周期长，原料来源困难。因此利用细胞培养技术生产吲哚生物碱的研究倍受国内外专家的高度重视。这方面的工作国外已取得了很大进展，比如加拿大用长春花愈伤细胞培养生产阿吗碱，德国用长春花愈伤细胞生产蛇根碱已达到中试或工业化生产水平。
细胞培养技术中也存在很多亟待解决的问题。其中之一是愈伤细胞培养基中，除加入必需的营养成分外，还需加入适量生长素和细胞分裂素，否则，细胞不能生长。而外源植物激素会干扰植物的次级代谢产物的积累，导致药用成分含量降低。为此，改为以冠瘿细胞为材料更为理想。长春花冠瘿细胞是将长春花愈伤细胞与土壤农杆菌C58共培养时，该细菌中T-DNA片段将会移入到愈伤细胞核DNA中去，长出冠瘿细胞来。因为T-DNA片段中含有对合成生长素和细胞分裂素的必需基因，所以冠瘿细胞在无任何激素培养基中能正常增殖。而且该组织生长迅速不易分化。在适宜条件下，其生长和吲哚生物碱含量比愈伤细胞高得多〔2〕。
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目前，外源刺激物(licitors)对植物次级代谢影响的研究倍受国内外普遍关注。外源刺激物是指一些生物(多为真菌提取物)或非生物的分子(如无机盐等)，它们能够通过信号传 导途径去刺激植物发生防御反应，诱导植物特定的刺激代谢产物的形成和积累。1986年U.Eilert等人研究了不同来源真菌匀浆物对长春花愈伤细胞吲哚生物碱含量的影响，效果很好〔3〕。
本文在原来工作的基础上，进一步探讨了细胞悬浮培养中的接种物最适年龄的接种量，研究了大丽花轮枝孢菌匀浆物对吲哚生物碱积累的影响，以期为大规模细胞培养生产吲哚生物碱提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 长春花冠瘿细胞培养：细胞在加有100 mL MS培养液的500 mL三角瓶中摇床(100～120 r/min)培养，培养液中不加任何植物激素，培养温度为25℃～27℃。
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1.1.2 外源刺激物制备：按照U.Eilert方法〔3〕，将大丽花轮枝孢菌接种于MS培养基中悬浮培养7 d后高压灭菌备用。
1.2 方法
1.2.1 冠瘿细胞生长的测定：收获悬浮培养细胞，真空抽滤至不滴水后称其鲜重(取3瓶细胞鲜重平均值)，表示培养过程中细胞生长的变化。
1.2.2 冠瘿细胞个数的测定：准确吸取细胞均匀分布的悬浮液适当稀释后，放在计算盘中，在显微镜下记数(取3次平均值)。
1.2.3 吲哚生物碱含量的测定：按照Morris等〔4〕的方法测定了细胞内吲哚生物碱的含量。
2 结果与讨论
2.1 接种物年龄及接种量对悬浮培养生物产量的影响：植物细胞培养过程中，接种物年龄和接种量对继代培养生物产量影响很大。为提高细胞生长速率，我们对适宜接种物年龄和接种量进行了选择。
, 百拇医药
2.1.1 适宜悬浮培养接种年龄的选择：取不同天数悬浮培养细胞分别接种于相同量的液体培养基中，使原始细胞密度为10万/毫升左右。悬浮培养18 d后收获，结果如图1所示：悬浮培养细胞年龄为16 d时进行继代扩大培养生物产量最高。
图1 悬浮培养接种物年龄与生物产量的关系
图2 悬浮培养接种量与生物产量的关系
2.1.2 悬浮培养接种量与生物产量的关系：取不同量的培养15天的悬浮培养细胞接种于相同量的液体培养基中，使原始细胞密度(万/毫升)分别为0.4、2.0、5.0、10.0、15.0悬浮培养18 d收获，称鲜重结果如图2所示：初始细胞密度小于2万/毫升时，生物产量很低，密度超过2万/毫升时，细胞增殖速率与接种量呈正相关系，密度超过10万/毫升时，细胞个数不再增加。
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2.2 外源刺激物对悬浮培养细胞的刺激作用：比较几种真菌匀浆物对冠瘿细胞刺激作用，得知以适量大丽花轮枝孢菌制备的外源刺激物能明显提高吲哚生物碱的积累。为确立刺激效果的最适条件，我们作了以下实验。
2.2.1 外源刺激物对不同年龄细胞中吲哚生物碱含量的影响：于悬浮培养不同天数的细胞培养液中分别加入5 mL外源刺激物，对照加5 mL水，继续培养18 h后收获细胞，称其鲜重并进行吲哚生物碱含量的分析。结果表明：外源刺激物对细胞生物产量无多大影响。而吲哚生物碱的含量均有明显提高，如图3所示，一般比对照提高1倍左右，其中以培养15 d的细胞对外源刺激物处理最为敏感，吲哚生物碱积累最多，是对照的2倍。
2.2.2 外源刺激物处理时间对细胞中吲哚生物碱含量的影响：取5 mL外源刺激物加入到培养15 d的细胞培养液中，每隔2 h取样一次测定吲哚生物碱含量。结果如图4所示：处理18 h效果最好，时间增加反而下降，对照变化不大，结果与国外以elicitors刺激长春花愈伤细胞的报道是一致的〔4〕。
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图3 外源刺激物对不同年龄细胞
中吲哚生物碱含量的影响
图4 外源刺激物处理时间对细胞中吲
哚生物碱含量的影响
2.2.3 外源刺激物剂量对细胞中吲哚生物碱含量的影响：取不同剂量的外源刺激物加入到培养15 d龄的细胞培养液中处理18 h，收获细胞并测定吲哚生物碱含量，结果如图5所示。与对照相比，不同剂量的外源刺激物的加入都程度不同地提高了吲哚生物碱的含量。其中以5 mL剂量为最好，细胞中吲哚生物碱含量提高2倍多。
图5 外源刺激物剂量对细胞中吲哚生物碱含量的影响。
从我们这些研究结果可以看出，长春花冠瘿对大丽花轮枝孢菌匀浆物的刺激反应比较敏感，这种外源刺激物的冠瘿细胞的次级代谢活动产生了明显的调节作用。在本文描述的实验条件下，以5 mL外源刺激物加入的培养15 d的细胞培养系统处理18 h，能显著提高细胞中吲哚生物碱含量，比对照提高2倍多，有关外源刺激物提高长春花冠瘿细胞药用成分的研究尚未见过报道。
, 百拇医药
*Address:Wang Shufang,College of Life Sciences ,Nankai Universiity,Tianjin
作者简介：王淑芳，女，1969年毕业于南开大学生物系获学士学位。毕业后留校任教至今，副教授。主讲《植物生理学》，主要科研方向《利用植物细胞培养技术获取贵重药用有效成分》，自1994年以来在国内外生物核心刊物上发表论文18篇。
参 考 文 献
[1] 常敏毅.抗癌药物.长沙：湖南科学技术出版社，1996：118
[2] 王宁宁，等.生物工程学报，1994，10(3)：244
[3] Eilert U,et al.J Plant Physiology， 1986,126:11
[4] Morris P，et al.Plant Cell Culture——a practical approach.1985:127
(1998-08-26收稿), 百拇医药
单位：南开大学生命科学学院(天津300071)
关键词：长春花冠瘿细胞；外源刺激物；吲哚生物碱
中草药/990227摘 要 研究了长春花冠瘿细胞接种物年龄与接种量对悬浮培养细胞生物产量的影响，探讨了以大丽花轮枝孢菌的匀浆物为外源刺激物处理冠瘿细胞，对细胞生长和吲哚生物碱积累的作用。确立了外源刺激物产生效应的最适条件。
Studies on the Enhancing Accumulation of Indole Alkaloids in Crown
Gall Cells of Madagascar Periwinkle (Catharanthus roseus)
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Wang Shufang, Wang Ningning, Wang Yong, et al
.(College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071)
Abstract Influences of cell age (at inoculation) and the amount inoculated on the biological mass production of cultured cells in Catharanthus roseus (L.) G. Don suspension were investigated. Effects of treatment by Verticillium dahliae homogenate as elicitor on the cell growth and accumulation of indole alkaloids in the crown gall cells were studied and the optimal stimulation conditions were determined.
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Key words Catharanthus roseus (L.) G. Don elicitor indole alkaloids
夹竹桃科植物长春花Catharanthus roseus是一种重要的中草药。从它的根、茎、叶、种子中可分离出70余种生物碱，其中三分之一是属吲哚类化合物。它们均具有抗癌活性，其作用是抑制细胞有丝分裂，阻碍纺锤体形成，使其分裂中期中止。其中长春碱、长春新碱已用于临床治疗急性白血病、绒毛膜上皮癌等，对其它肿瘤也有一定疗效〔1〕。目前这些药物主要是从整体植株获得。但植物中该成分含量很低，生长受自然条件限制，周期长，原料来源困难。因此利用细胞培养技术生产吲哚生物碱的研究倍受国内外专家的高度重视。这方面的工作国外已取得了很大进展，比如加拿大用长春花愈伤细胞培养生产阿吗碱，德国用长春花愈伤细胞生产蛇根碱已达到中试或工业化生产水平。
细胞培养技术中也存在很多亟待解决的问题。其中之一是愈伤细胞培养基中，除加入必需的营养成分外，还需加入适量生长素和细胞分裂素，否则，细胞不能生长。而外源植物激素会干扰植物的次级代谢产物的积累，导致药用成分含量降低。为此，改为以冠瘿细胞为材料更为理想。长春花冠瘿细胞是将长春花愈伤细胞与土壤农杆菌C58共培养时，该细菌中T-DNA片段将会移入到愈伤细胞核DNA中去，长出冠瘿细胞来。因为T-DNA片段中含有对合成生长素和细胞分裂素的必需基因，所以冠瘿细胞在无任何激素培养基中能正常增殖。而且该组织生长迅速不易分化。在适宜条件下，其生长和吲哚生物碱含量比愈伤细胞高得多〔2〕。
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目前，外源刺激物(licitors)对植物次级代谢影响的研究倍受国内外普遍关注。外源刺激物是指一些生物(多为真菌提取物)或非生物的分子(如无机盐等)，它们能够通过信号传 导途径去刺激植物发生防御反应，诱导植物特定的刺激代谢产物的形成和积累。1986年U.Eilert等人研究了不同来源真菌匀浆物对长春花愈伤细胞吲哚生物碱含量的影响，效果很好〔3〕。
本文在原来工作的基础上，进一步探讨了细胞悬浮培养中的接种物最适年龄的接种量，研究了大丽花轮枝孢菌匀浆物对吲哚生物碱积累的影响，以期为大规模细胞培养生产吲哚生物碱提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 长春花冠瘿细胞培养：细胞在加有100 mL MS培养液的500 mL三角瓶中摇床(100～120 r/min)培养，培养液中不加任何植物激素，培养温度为25℃～27℃。
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1.1.2 外源刺激物制备：按照U.Eilert方法〔3〕，将大丽花轮枝孢菌接种于MS培养基中悬浮培养7 d后高压灭菌备用。
1.2 方法
1.2.1 冠瘿细胞生长的测定：收获悬浮培养细胞，真空抽滤至不滴水后称其鲜重(取3瓶细胞鲜重平均值)，表示培养过程中细胞生长的变化。
1.2.2 冠瘿细胞个数的测定：准确吸取细胞均匀分布的悬浮液适当稀释后，放在计算盘中，在显微镜下记数(取3次平均值)。
1.2.3 吲哚生物碱含量的测定：按照Morris等〔4〕的方法测定了细胞内吲哚生物碱的含量。
2 结果与讨论
2.1 接种物年龄及接种量对悬浮培养生物产量的影响：植物细胞培养过程中，接种物年龄和接种量对继代培养生物产量影响很大。为提高细胞生长速率，我们对适宜接种物年龄和接种量进行了选择。
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2.1.1 适宜悬浮培养接种年龄的选择：取不同天数悬浮培养细胞分别接种于相同量的液体培养基中，使原始细胞密度为10万/毫升左右。悬浮培养18 d后收获，结果如图1所示：悬浮培养细胞年龄为16 d时进行继代扩大培养生物产量最高。
图1 悬浮培养接种物年龄与生物产量的关系
图2 悬浮培养接种量与生物产量的关系
2.1.2 悬浮培养接种量与生物产量的关系：取不同量的培养15天的悬浮培养细胞接种于相同量的液体培养基中，使原始细胞密度(万/毫升)分别为0.4、2.0、5.0、10.0、15.0悬浮培养18 d收获，称鲜重结果如图2所示：初始细胞密度小于2万/毫升时，生物产量很低，密度超过2万/毫升时，细胞增殖速率与接种量呈正相关系，密度超过10万/毫升时，细胞个数不再增加。
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2.2 外源刺激物对悬浮培养细胞的刺激作用：比较几种真菌匀浆物对冠瘿细胞刺激作用，得知以适量大丽花轮枝孢菌制备的外源刺激物能明显提高吲哚生物碱的积累。为确立刺激效果的最适条件，我们作了以下实验。
2.2.1 外源刺激物对不同年龄细胞中吲哚生物碱含量的影响：于悬浮培养不同天数的细胞培养液中分别加入5 mL外源刺激物，对照加5 mL水，继续培养18 h后收获细胞，称其鲜重并进行吲哚生物碱含量的分析。结果表明：外源刺激物对细胞生物产量无多大影响。而吲哚生物碱的含量均有明显提高，如图3所示，一般比对照提高1倍左右，其中以培养15 d的细胞对外源刺激物处理最为敏感，吲哚生物碱积累最多，是对照的2倍。
2.2.2 外源刺激物处理时间对细胞中吲哚生物碱含量的影响：取5 mL外源刺激物加入到培养15 d的细胞培养液中，每隔2 h取样一次测定吲哚生物碱含量。结果如图4所示：处理18 h效果最好，时间增加反而下降，对照变化不大，结果与国外以elicitors刺激长春花愈伤细胞的报道是一致的〔4〕。
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图3 外源刺激物对不同年龄细胞
中吲哚生物碱含量的影响
图4 外源刺激物处理时间对细胞中吲
哚生物碱含量的影响
2.2.3 外源刺激物剂量对细胞中吲哚生物碱含量的影响：取不同剂量的外源刺激物加入到培养15 d龄的细胞培养液中处理18 h，收获细胞并测定吲哚生物碱含量，结果如图5所示。与对照相比，不同剂量的外源刺激物的加入都程度不同地提高了吲哚生物碱的含量。其中以5 mL剂量为最好，细胞中吲哚生物碱含量提高2倍多。
图5 外源刺激物剂量对细胞中吲哚生物碱含量的影响。
从我们这些研究结果可以看出，长春花冠瘿对大丽花轮枝孢菌匀浆物的刺激反应比较敏感，这种外源刺激物的冠瘿细胞的次级代谢活动产生了明显的调节作用。在本文描述的实验条件下，以5 mL外源刺激物加入的培养15 d的细胞培养系统处理18 h，能显著提高细胞中吲哚生物碱含量，比对照提高2倍多，有关外源刺激物提高长春花冠瘿细胞药用成分的研究尚未见过报道。
, 百拇医药
*Address:Wang Shufang,College of Life Sciences ,Nankai Universiity,Tianjin
作者简介：王淑芳，女，1969年毕业于南开大学生物系获学士学位。毕业后留校任教至今，副教授。主讲《植物生理学》，主要科研方向《利用植物细胞培养技术获取贵重药用有效成分》，自1994年以来在国内外生物核心刊物上发表论文18篇。
参 考 文 献
[1] 常敏毅.抗癌药物.长沙：湖南科学技术出版社，1996：118
[2] 王宁宁，等.生物工程学报，1994，10(3)：244
[3] Eilert U,et al.J Plant Physiology， 1986,126:11
[4] Morris P，et al.Plant Cell Culture——a practical approach.1985:127
(1998-08-26收稿), 百拇医药