用PCR-SSP作HLA-B位点分型及B22亚型分析①
作者：杨颖 冯硊 张雁征 冯明亮 嵇月华 陆琼 许一多
单位：杨 颖(上海血液中心 上海 200051)；冯 硊(上海血液中心 上海 200051)；张雁征(上海血液中心 上海 200051)；冯明亮(上海血液中心 上海 200051)；嵇月华(上海血液中心 上海 200051)；陆 琼(上海血液中心 上海 200051)
关键词：HLA-B；PCR-SSP；分型B22
中国免疫学杂志000214 摘 要：目的：用DNA分型弥补血清学HLA-B位点分型的欠缺并了解南方汉族B22亚型分布情况。 方法：采用标准细胞作参照，建立B位点的PCR-SSP分型方法；并对血清学B22阳性标本进行B22亚型分析。结果：104株标准细胞PCR-SSP分型结果与已知结果完全一致，17例白血病人及同胞分型与血清学一致，1例不符；B22亚型以B*5401最多，B*5601较少，1例分型格局异常，可能为新B22等位基因或错配的DNA双链。结论：PCR-SSP可用于B位点的DNA分型，比血清学更直观精确，操作简便，不受疾病状态影响。
, http://www.100md.com
分类号：R371.33
HLA-B locus genotyping and B22 subtyping by PCR-SSP method
YANG Ying
(Department of Immunogenetics,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
FENG Zhe
(Department of Immunogenetics,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
ZHANG Yan-Zheng
(Department of Immunogenetics,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
, http://www.100md.com
Abstract：Objectives:The purpose of this study is to provide a HLA-B locus genotyping method which is expected to compensate the unsatisfactory serology B locus typing and to explore the distribution of B22 subtypes.Methods:Taking standard cell lines provided by the XIIth International HLA Workshop as reference,the authors established the PCR-SSP method for HLA-B genotyping.By this method,the HLA-B alleles of leukemia patients were typed and 57 individuals previously identified as HLA-B22 by serologic typing were genotyped.Results:The results of B-locus genotyping of 104 cell lines by PCR-SSP and that of reported were completely concordant .Unambiguous results of 17 leukemia patients and their relations were gotten except one discordant from serology which was thought as mistaken serotyping .Out of 57 samples ,55 were confirmed to bear B54 or B55 or B56 allele,respectively ,with B54 being the most common allelic form,and another showed a unique amplifying pattern which was different from any known HLA-B22 alleles so far reported, suggesting a new allele or "mismatched ”DNA double strands which needed further study .Conclusions:PCR-SSP was proven to be a practical genotyping method for B-locus because of its simplicity, rapidity ,accuracy and unvariability with changes of health.
, http://www.100md.com
Key words：HLA-B locus PCR-SSP Genotyping B22▲
HLA相配与否对组织器官移植预后有较大影响[1]，以HLA-A、B、DR尤甚，其中B座位等位基因最多，其高变区序列差别往往只有1～2个碱基[2]，传统的血清学受到血清来源、质量、疾病状态等影响，B位点检测的正确性及多态性显示不尽如人意。B22亚型分为B54，B55，B56，但国内往往由于缺乏良好抗血清，无法检出。本文采用PCR-SSP(Polymerase chain reaction sequence specific primer)方法，根据各等位基因高变区的核苷酸序列不同之处，设计出不同的相对应的引物，从而区分B位点等位基因，并分析B22亚型在南方汉族人中的组成。
1 材料与方法
1.1 标本 12届国际HLA会议提供的104株标准细胞；随机选取白血病家庭5例18人；随机选取江浙沪无关健康供者500名。
, http://www.100md.com
1.2 试剂与仪器 HLA抗血清由美国红十字会提供。引物设计参照文献[3]，见表1，委托中科院上海植物生理研究所合成。Taq酶为PERKIN-ELMER公司产品，扩增仪为M.J.Research公司生产的PTC-100m。
表1 所用引物、鉴别的B位点抗原及等位基因
Tab.1 The list of primers ,identificated antigens and alleles 5’primer
name
3'primer
name
Antigens
Alleles
, 百拇医药
195
220
B8
B*0801，B*0802
280
225
B49，50，4005，2706，2704，45v
B*4901，5001，4005，2704，2706，B45v
208
215
B49，59
B*4901，5901
, http://www.100md.com
192
220
B41
B*4101，4102
192
247
B60，61，4005，41，48
B*4801，40011-4006
272
218
B60，61，47
B*40011-4004，4006-8，4701
, http://www.100md.com
280
229
B60
B*40011，40012，4007
243
215
B13
B*13001-3
194
213
B58
B*5801-3
194
, 百拇医药
224
B57
B*5701-3
187
214
B18
B*1801-2
209
236
B55，56，73，3906
B*5501-2，5601-2,7301,39061-2
203
, 百拇医药
238
B56
B*5601-2
395
236
B54
B*5401
280
281
B27
B*2701-9
282
367
, 百拇医药
236
B73
B*7301
203
220
B42
B*4201，42v
194
225
B63
B*1516-17
240
241
, http://www.100md.com
B46
B*4601
192
214
B62，76，72，4802，4003
B*1501，1503-7，1512，1514，1519-20，1524-25，4802，4003
243
250
B62，62v，75，76，1521
B*1501-2，1504-8，1511-12，1514-15，1519-21，1525，1526n，1528
, http://www.100md.com
271
223
B4802
B*4802
209
214
B72,72v,4802,3907
B*1503,1518,1523,1529,4802,3907,72v
271
238
B4802，71，70，72，72v
B*4802，1503，1509-10，1518，1523，1529，72v
, 百拇医药
208
217
B38
B*3801-2
435
209
217
B38，39，67
B*3801-2，3901-8，6701
193
221
B7
B*0702-05，8101
, http://www.100md.com
312
221
B0703
B*0703
207
219
B45，76
B*4501，45v，1514
202
393
B44
B*4002-6
272
, 百拇医药
285
272
276
B49，50，4005，61，41，44，45，47
B*4002,4006，4008，41012，4501，45v，4901，5001，4402-5，4701
197
127
B64，65
B*1401-2
205
232
, 百拇医药
B65，3904
B*1402，3904
207
217
B39，67
B*3901-3908，6701
206
217
B67
B*67011-12
242
215
, 百拇医药 B54，55，56，45，50
B*5401，5501-2，5601，4501，45v，5001
189
238
B71，70，1521，1523
B*1509-10，1518，1521，1523
243
219
B76
B*1512，1514，1519
244
, http://www.100md.com
193
223
B35，53，75，77，5104，B*3501-9(not3505)，3511，1521，4406
5301，1502，1513，5104，1521，4406
188
237
B35，18，78，1522
B*3501-13，18，7801-2，1522
195
213
B35，53
, http://www.100md.com
B*3501-9，3511，5301
277
207
216
B78，1509
B*7801-2，1509
208
216
B51，52
B*5101-5，51v，52011-12
193
216
, 百拇医药
B51，78，1509
B*5101-5，51v，7801-2，1509
192
216
B52
B*52011-12
209
229
B4801，B8101
B*4801，8101
246
215
, http://www.100md.com
B45，49，50
B*4501，45v，4901，5001
188
212
B37，4406
B*3701，4406，51v
192
392
B37，3902，3908
B*37，3902，3908
192
228
, 百拇医药
B47
B*4701
1.3 方法
1.3.1 对上述个体均用微量淋巴细胞毒试验作HLA-A、B分型[4]。
1.3.2 取500名无关供者中血清学检定为B22阳性者，用PCR-SSP法作B22亚型分析，与血清学结果不符者作B位点全套PCR-SSP分型，即包含所有血清学能检测的B位点特异性。5个白血病家庭成员，包括白血病人5名共18人作B位点全套PCR-SSP分型。
1.3.3 PCR-SSP方法 1)DNA抽提，酚-氯仿法。2)PCR扩增，参数为：94℃，2 min;94℃，50 s;70℃，1 min;72℃,1 min,5个循环；95℃，1 min；65℃，1 min;72℃,1 min,24个循环；95℃，1 min;55℃,1 min;72℃,1 min,5个循环；72℃，5 min。3)检测：2%琼脂糖电泳后，紫外灯下观察，根据各引物对是否有对应PCR特异扩增条带，判读结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 104株标准细胞PCR-SSP法B位分型结果 与已知结果一致，符合率为100%，证实该法能够应用于B位点DNA分型，分辨力超过血清水平。由于
本室所有的标准细胞DNA中无B50，B49、B47，B*4802，B*5602，B81，B71，B65，B64，B77，B78，故无法对PCR-SSP能否检出这些少见特异性作出评估。
2.2 18名白血病家庭成员PCR-SSP分型结果 17例与血清结果一致，另1例血清学分型为B46，B22，PCR-SSP分型结果为B46，B67(图1)。
图1 1例血清学结果不符的个体PCR-SSP B位点分型结果
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Fig.1 HLA-B locus genotyping results by PCR-SSP in one individual whose serotyping results was in discrepancy with that of PCR-SSP
Note:Pos.reactions:19,23,24,36 SSP type:B46,B67,lane 19 show B46 positive ,lane 23,24,36 show B67 positive,and a 256 bp control is used.In front of 26 bp are primer-dimer bands.Size of MW bands are 237,377,515,695,994,1 543 base pairs respectively
2.3 区分B22亚型 采用上述方法中的4对引物区分出B54(B*5401)，B55(B*5501，B*5002)，B*5601(因本室无B*5602标准品，对此特异性无法评估)。具体亚型分布见表2。500名供者中血清学B22阳性者为57人，PCR-SSP分型证实非B22者1人，B22阳性者56人，其中1例B22阳性者，血清学分型为B40，B22，PCR-SSP分型为B*4001，B*220X，其B22无法确定亚型，可能为新等位基因(图2)。PCR-SSP与血清学分型结果符合率为98.24%。表2 500名无关人群中B22亚型分布情况
, 百拇医药
Tab.2 The distribution of B22 subtypes in 500 unrelated individuals Sero-specificity
Allele
Number
Gene frequency
(%)
Antigen frequency
(%)
B22
B*5401
34
, 百拇医药 3.4
6.8
B22
B*550X
20
2.0
4.0
B22
B*5601
1
0.1
0.2
B22
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B22variant
1
B22
nonB22
1
Non B22
443
Total
500
图2 1例疑为B22新等位基因或嵌合体的PCR-SSP B位点分型
Fig.2 HLA-B locus genotyping results by PCR-SSP in one individual whose B22 allele was suspected as new or “mismatched”double-strand DNA
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Note:Pos.reaction:5,6,7,12,14,27,35；lane 5,6,7,27 show B60(B*4001),lane 12 show B54,lane 14 show B55,lane 35 show B22,a 256 bp control is used as internal control.In front of 256 bp are primer-dimer bands.Size of MW bands are 237,377,515,695,994, 1 543 base pairs respectively
3 讨论
由于HLA-B位点各等位基因间高变区核苷酸顺序差别往往只有一至几个碱基，分型比其它位点困难。本实验用PCR-SSP作HLA-B位点DNA分型，证实PCR-SSP法可正确直接地反映结果，而用时更短，一般可在2～5 h内完成，适应了临床快速及小样本的需求，在大规模供者筛选中，可作为血清学的补充手段，提高分型准确与精细程度。白血病人往往由于化疗、疾病状态等影响，不能及时进行血清学分型，或分型困难，而PCR-SSP法不受此限，且结果判别容易，重复性好，取材广泛，不限于新鲜外周血。对血清学而言，B22抗原与B42，B7，B27，B40等抗原属同一交叉反应组，B22很容易与其他抗血清产生交叉反应，而B22抗血清也易与其他抗原产生交叉反应，导致了结果的难辨性。在B22亚型中，只有B54具备特异的抗原决定簇，其它两种(B55、B56)，即使是“单抗”血清也往往与其它抗原产生交叉反应[5]，本实验中1例血清学B22阳性，基因分型证实为B*6701(图1)，其原因可能就在于B67表现为与B39，B22抗血清交叉反应而导致的血清学分型错误。另1例疑为新基因(图2)者，其血清学分型为B40，B22，其PCR-SSP分型为B*4001，B22“多价”(包括B54，B55，B56)扩增阳性，B*5401，B*550x阳性，B*560x阴性，说明该个体一条染色体上B位点为B*4001(B40的一种)，另一条染色体上B位点为B22，但亚型无法确定，重复实验以及与标准细胞DNA(分别含B*5401，B*5501-2，B*5601)同时扩增，其结果肯定了以上结论，因为不同引物对设计是针对序列不同部位，说明该个体的B22可能为新等位基因，或者DNA双链有错配现象，最终结论有待测序研究。
, 百拇医药
在B22亚型分析中，本实验结论为B*5401最多，B*550x次之，B*5601最少，B*5602空缺，11届国际HLA会议的统计资料中汉族人B22各亚型抗原频率(B54：B55：B56=8.6%:6.7%:1.2%)均偏高，尤以B56最明显，而12届HLA国际会议资料中北方汉族人B54，B55，B56基因频率依次为1.8%，2.6%，0.9%[6]，以B55最多，与我们的结果明显不同，这些差异可能因为取样不同(我们取样主要来自于南方汉族江浙沪人群)，且后者样本(n=77)又偏小。
由于PCR-SSP法中引物设计往往只有一个碱基差异，故容易在同源性极高的等位基因间也能扩增出较淡的非特异条带，这一点在判别结果时需引起注意，但采用高特异耐热DNA聚合酶及多对引物扩增指定一个等位基因，在一定程度上弥补了这方面的不足。
致谢：本文承蒙上海免疫学研究所陆佩华、王福庆老师指教，在此表示真诚谢意。■
, http://www.100md.com
①上海市卫生局青年科研基金课题(编号 131954Y4)
作者简介：杨 颖，女，31岁，硕士，助理研究员，主要从事免疫遗传及移植免疫研究
作者单位：许一多(白求恩医科大学第三临床医院 长春 130021)
参考文献：
[1]Cho Y W,Cecka J M,Terasaki P I.HLA matching effects:better survival rates and graft quality.In:Terasaki P I,Cecka J M E ed.Clinical Transplants 1994.Los Angeles：UCLA tissue typing laboraory,1995:435-449
[2]Arnett K L ,Peter Parham.HLA class I nucleotide sequences,1995.Tissue Antigens,1995;45:217
, http://www.100md.com
[3]Bunce M,O'neill C M,Barnardo MCNM et al. Phototyping comprehensive DNA typing for HLA-A，B，C，DRB1，DRB3，DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers(PCR-SSP).Tissue Antigens,1995;46:355
[4]赵桐茂.HLA分型原理和应用.上海：上海科学技术出版社，1984：275-276
[5]Park M S,Lau M,Geer L I et al.UCLA international sera exchange analyses in relation to DNA sequences:Summary report from 1990 to 1994. In:Terasaki P I,Cecka J M ed. Clinical Transplants 1994.Los Angeles:UCLA tissue typing laboratory,1995:489-508
, 百拇医药
[6]Tanaka H,Tokunaga K,Inoko H et al. Distribution of HLA-A，B，and DRB1 alleles and haplotypes in Northeast Asia .In Charron D ed.Genetics diversity of HLA functional and medical implication.Paris,France:EDK Medical and Scientific International Publisher,1997:285-291
收稿日期：1998-07-12
修回日期：1998-10-23, 百拇医药
单位：杨 颖(上海血液中心 上海 200051)；冯 硊(上海血液中心 上海 200051)；张雁征(上海血液中心 上海 200051)；冯明亮(上海血液中心 上海 200051)；嵇月华(上海血液中心 上海 200051)；陆 琼(上海血液中心 上海 200051)
关键词：HLA-B；PCR-SSP；分型B22
中国免疫学杂志000214 摘 要：目的：用DNA分型弥补血清学HLA-B位点分型的欠缺并了解南方汉族B22亚型分布情况。 方法：采用标准细胞作参照，建立B位点的PCR-SSP分型方法；并对血清学B22阳性标本进行B22亚型分析。结果：104株标准细胞PCR-SSP分型结果与已知结果完全一致，17例白血病人及同胞分型与血清学一致，1例不符；B22亚型以B*5401最多，B*5601较少，1例分型格局异常，可能为新B22等位基因或错配的DNA双链。结论：PCR-SSP可用于B位点的DNA分型，比血清学更直观精确，操作简便，不受疾病状态影响。
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分类号：R371.33
HLA-B locus genotyping and B22 subtyping by PCR-SSP method
YANG Ying
(Department of Immunogenetics,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
FENG Zhe
(Department of Immunogenetics,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
ZHANG Yan-Zheng
(Department of Immunogenetics,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
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Abstract：Objectives:The purpose of this study is to provide a HLA-B locus genotyping method which is expected to compensate the unsatisfactory serology B locus typing and to explore the distribution of B22 subtypes.Methods:Taking standard cell lines provided by the XIIth International HLA Workshop as reference,the authors established the PCR-SSP method for HLA-B genotyping.By this method,the HLA-B alleles of leukemia patients were typed and 57 individuals previously identified as HLA-B22 by serologic typing were genotyped.Results:The results of B-locus genotyping of 104 cell lines by PCR-SSP and that of reported were completely concordant .Unambiguous results of 17 leukemia patients and their relations were gotten except one discordant from serology which was thought as mistaken serotyping .Out of 57 samples ,55 were confirmed to bear B54 or B55 or B56 allele,respectively ,with B54 being the most common allelic form,and another showed a unique amplifying pattern which was different from any known HLA-B22 alleles so far reported, suggesting a new allele or "mismatched ”DNA double strands which needed further study .Conclusions:PCR-SSP was proven to be a practical genotyping method for B-locus because of its simplicity, rapidity ,accuracy and unvariability with changes of health.
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Key words：HLA-B locus PCR-SSP Genotyping B22▲
HLA相配与否对组织器官移植预后有较大影响[1]，以HLA-A、B、DR尤甚，其中B座位等位基因最多，其高变区序列差别往往只有1～2个碱基[2]，传统的血清学受到血清来源、质量、疾病状态等影响，B位点检测的正确性及多态性显示不尽如人意。B22亚型分为B54，B55，B56，但国内往往由于缺乏良好抗血清，无法检出。本文采用PCR-SSP(Polymerase chain reaction sequence specific primer)方法，根据各等位基因高变区的核苷酸序列不同之处，设计出不同的相对应的引物，从而区分B位点等位基因，并分析B22亚型在南方汉族人中的组成。
1 材料与方法
1.1 标本 12届国际HLA会议提供的104株标准细胞；随机选取白血病家庭5例18人；随机选取江浙沪无关健康供者500名。
, http://www.100md.com
1.2 试剂与仪器 HLA抗血清由美国红十字会提供。引物设计参照文献[3]，见表1，委托中科院上海植物生理研究所合成。Taq酶为PERKIN-ELMER公司产品，扩增仪为M.J.Research公司生产的PTC-100m。
表1 所用引物、鉴别的B位点抗原及等位基因
Tab.1 The list of primers ,identificated antigens and alleles 5’primer
name
3'primer
name
Antigens
Alleles
, 百拇医药
195
220
B8
B*0801，B*0802
280
225
B49，50，4005，2706，2704，45v
B*4901，5001，4005，2704，2706，B45v
208
215
B49，59
B*4901，5901
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192
220
B41
B*4101，4102
192
247
B60，61，4005，41，48
B*4801，40011-4006
272
218
B60，61，47
B*40011-4004，4006-8，4701
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280
229
B60
B*40011，40012，4007
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B13
B*13001-3
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B58
B*5801-3
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B57
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B18
B*1801-2
209
236
B55，56，73，3906
B*5501-2，5601-2,7301,39061-2
203
, 百拇医药
238
B56
B*5601-2
395
236
B54
B*5401
280
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236
B73
B*7301
203
220
B42
B*4201，42v
194
225
B63
B*1516-17
240
241
, http://www.100md.com
B46
B*4601
192
214
B62，76，72，4802，4003
B*1501，1503-7，1512，1514，1519-20，1524-25，4802，4003
243
250
B62，62v，75，76，1521
B*1501-2，1504-8，1511-12，1514-15，1519-21，1525，1526n，1528
, http://www.100md.com
271
223
B4802
B*4802
209
214
B72,72v,4802,3907
B*1503,1518,1523,1529,4802,3907,72v
271
238
B4802，71，70，72，72v
B*4802，1503，1509-10，1518，1523，1529，72v
, 百拇医药
208
217
B38
B*3801-2
435
209
217
B38，39，67
B*3801-2，3901-8，6701
193
221
B7
B*0702-05，8101
, http://www.100md.com
312
221
B0703
B*0703
207
219
B45，76
B*4501，45v，1514
202
393
B44
B*4002-6
272
, 百拇医药
285
272
276
B49，50，4005，61，41，44，45，47
B*4002,4006，4008，41012，4501，45v，4901，5001，4402-5，4701
197
127
B64，65
B*1401-2
205
232
, 百拇医药
B65，3904
B*1402，3904
207
217
B39，67
B*3901-3908，6701
206
217
B67
B*67011-12
242
215
, 百拇医药 B54，55，56，45，50
B*5401，5501-2，5601，4501，45v，5001
189
238
B71，70，1521，1523
B*1509-10，1518，1521，1523
243
219
B76
B*1512，1514，1519
244
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193
223
B35，53，75，77，5104，B*3501-9(not3505)，3511，1521，4406
5301，1502，1513，5104，1521，4406
188
237
B35，18，78，1522
B*3501-13，18，7801-2，1522
195
213
B35，53
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B*3501-9，3511，5301
277
207
216
B78，1509
B*7801-2，1509
208
216
B51，52
B*5101-5，51v，52011-12
193
216
, 百拇医药
B51，78，1509
B*5101-5，51v，7801-2，1509
192
216
B52
B*52011-12
209
229
B4801，B8101
B*4801，8101
246
215
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B45，49，50
B*4501，45v，4901，5001
188
212
B37，4406
B*3701，4406，51v
192
392
B37，3902，3908
B*37，3902，3908
192
228
, 百拇医药
B47
B*4701
1.3 方法
1.3.1 对上述个体均用微量淋巴细胞毒试验作HLA-A、B分型[4]。
1.3.2 取500名无关供者中血清学检定为B22阳性者，用PCR-SSP法作B22亚型分析，与血清学结果不符者作B位点全套PCR-SSP分型，即包含所有血清学能检测的B位点特异性。5个白血病家庭成员，包括白血病人5名共18人作B位点全套PCR-SSP分型。
1.3.3 PCR-SSP方法 1)DNA抽提，酚-氯仿法。2)PCR扩增，参数为：94℃，2 min;94℃，50 s;70℃，1 min;72℃,1 min,5个循环；95℃，1 min；65℃，1 min;72℃,1 min,24个循环；95℃，1 min;55℃,1 min;72℃,1 min,5个循环；72℃，5 min。3)检测：2%琼脂糖电泳后，紫外灯下观察，根据各引物对是否有对应PCR特异扩增条带，判读结果。
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2 结果
2.1 104株标准细胞PCR-SSP法B位分型结果 与已知结果一致，符合率为100%，证实该法能够应用于B位点DNA分型，分辨力超过血清水平。由于
本室所有的标准细胞DNA中无B50，B49、B47，B*4802，B*5602，B81，B71，B65，B64，B77，B78，故无法对PCR-SSP能否检出这些少见特异性作出评估。
2.2 18名白血病家庭成员PCR-SSP分型结果 17例与血清结果一致，另1例血清学分型为B46，B22，PCR-SSP分型结果为B46，B67(图1)。
图1 1例血清学结果不符的个体PCR-SSP B位点分型结果
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Fig.1 HLA-B locus genotyping results by PCR-SSP in one individual whose serotyping results was in discrepancy with that of PCR-SSP
Note:Pos.reactions:19,23,24,36 SSP type:B46,B67,lane 19 show B46 positive ,lane 23,24,36 show B67 positive,and a 256 bp control is used.In front of 26 bp are primer-dimer bands.Size of MW bands are 237,377,515,695,994,1 543 base pairs respectively
2.3 区分B22亚型 采用上述方法中的4对引物区分出B54(B*5401)，B55(B*5501，B*5002)，B*5601(因本室无B*5602标准品，对此特异性无法评估)。具体亚型分布见表2。500名供者中血清学B22阳性者为57人，PCR-SSP分型证实非B22者1人，B22阳性者56人，其中1例B22阳性者，血清学分型为B40，B22，PCR-SSP分型为B*4001，B*220X，其B22无法确定亚型，可能为新等位基因(图2)。PCR-SSP与血清学分型结果符合率为98.24%。表2 500名无关人群中B22亚型分布情况
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Tab.2 The distribution of B22 subtypes in 500 unrelated individuals Sero-specificity
Allele
Number
Gene frequency
(%)
Antigen frequency
(%)
B22
B*5401
34
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6.8
B22
B*550X
20
2.0
4.0
B22
B*5601
1
0.1
0.2
B22
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B22variant
1
B22
nonB22
1
Non B22
443
Total
500
图2 1例疑为B22新等位基因或嵌合体的PCR-SSP B位点分型
Fig.2 HLA-B locus genotyping results by PCR-SSP in one individual whose B22 allele was suspected as new or “mismatched”double-strand DNA
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Note:Pos.reaction:5,6,7,12,14,27,35；lane 5,6,7,27 show B60(B*4001),lane 12 show B54,lane 14 show B55,lane 35 show B22,a 256 bp control is used as internal control.In front of 256 bp are primer-dimer bands.Size of MW bands are 237,377,515,695,994, 1 543 base pairs respectively
3 讨论
由于HLA-B位点各等位基因间高变区核苷酸顺序差别往往只有一至几个碱基，分型比其它位点困难。本实验用PCR-SSP作HLA-B位点DNA分型，证实PCR-SSP法可正确直接地反映结果，而用时更短，一般可在2～5 h内完成，适应了临床快速及小样本的需求，在大规模供者筛选中，可作为血清学的补充手段，提高分型准确与精细程度。白血病人往往由于化疗、疾病状态等影响，不能及时进行血清学分型，或分型困难，而PCR-SSP法不受此限，且结果判别容易，重复性好，取材广泛，不限于新鲜外周血。对血清学而言，B22抗原与B42，B7，B27，B40等抗原属同一交叉反应组，B22很容易与其他抗血清产生交叉反应，而B22抗血清也易与其他抗原产生交叉反应，导致了结果的难辨性。在B22亚型中，只有B54具备特异的抗原决定簇，其它两种(B55、B56)，即使是“单抗”血清也往往与其它抗原产生交叉反应[5]，本实验中1例血清学B22阳性，基因分型证实为B*6701(图1)，其原因可能就在于B67表现为与B39，B22抗血清交叉反应而导致的血清学分型错误。另1例疑为新基因(图2)者，其血清学分型为B40，B22，其PCR-SSP分型为B*4001，B22“多价”(包括B54，B55，B56)扩增阳性，B*5401，B*550x阳性，B*560x阴性，说明该个体一条染色体上B位点为B*4001(B40的一种)，另一条染色体上B位点为B22，但亚型无法确定，重复实验以及与标准细胞DNA(分别含B*5401，B*5501-2，B*5601)同时扩增，其结果肯定了以上结论，因为不同引物对设计是针对序列不同部位，说明该个体的B22可能为新等位基因，或者DNA双链有错配现象，最终结论有待测序研究。
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在B22亚型分析中，本实验结论为B*5401最多，B*550x次之，B*5601最少，B*5602空缺，11届国际HLA会议的统计资料中汉族人B22各亚型抗原频率(B54：B55：B56=8.6%:6.7%:1.2%)均偏高，尤以B56最明显，而12届HLA国际会议资料中北方汉族人B54，B55，B56基因频率依次为1.8%，2.6%，0.9%[6]，以B55最多，与我们的结果明显不同，这些差异可能因为取样不同(我们取样主要来自于南方汉族江浙沪人群)，且后者样本(n=77)又偏小。
由于PCR-SSP法中引物设计往往只有一个碱基差异，故容易在同源性极高的等位基因间也能扩增出较淡的非特异条带，这一点在判别结果时需引起注意，但采用高特异耐热DNA聚合酶及多对引物扩增指定一个等位基因，在一定程度上弥补了这方面的不足。
致谢：本文承蒙上海免疫学研究所陆佩华、王福庆老师指教，在此表示真诚谢意。■
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①上海市卫生局青年科研基金课题(编号 131954Y4)
作者简介：杨 颖，女，31岁，硕士，助理研究员，主要从事免疫遗传及移植免疫研究
作者单位：许一多(白求恩医科大学第三临床医院 长春 130021)
参考文献：
[1]Cho Y W,Cecka J M,Terasaki P I.HLA matching effects:better survival rates and graft quality.In:Terasaki P I,Cecka J M E ed.Clinical Transplants 1994.Los Angeles：UCLA tissue typing laboraory,1995:435-449
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[3]Bunce M,O'neill C M,Barnardo MCNM et al. Phototyping comprehensive DNA typing for HLA-A，B，C，DRB1，DRB3，DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers(PCR-SSP).Tissue Antigens,1995;46:355
[4]赵桐茂.HLA分型原理和应用.上海：上海科学技术出版社，1984：275-276
[5]Park M S,Lau M,Geer L I et al.UCLA international sera exchange analyses in relation to DNA sequences:Summary report from 1990 to 1994. In:Terasaki P I,Cecka J M ed. Clinical Transplants 1994.Los Angeles:UCLA tissue typing laboratory,1995:489-508
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[6]Tanaka H,Tokunaga K,Inoko H et al. Distribution of HLA-A，B，and DRB1 alleles and haplotypes in Northeast Asia .In Charron D ed.Genetics diversity of HLA functional and medical implication.Paris,France:EDK Medical and Scientific International Publisher,1997:285-291
收稿日期：1998-07-12
修回日期：1998-10-23, 百拇医药