γ-干扰素在NRK细胞中的表达
作者：高艳青 柳湘 王惠珍 康玉英 程牛亮 牛勃
单位：高艳青(河北医科大学第四医院皮肤科 石家庄 050011);柳湘(上海市肿瘤研究所生化组);王惠珍(山西医科大学生物化学教研室);康玉英(山西医科大学生物化学教研室);程牛亮(山西医科大学生物化学教研室);牛勃(山西医科大学生物化学教研室)
关键词：干扰素 Ⅱ 型；干扰素γ，重组；基因疗法
山西医科大学学报000106 摘要： 以pBS-KS为中间载体，通过一步亚克隆，获得了两端结构为HindⅢ/Xba Ⅰ的γ-IFN cDNA 片段，将该片段与真核表达载体 RC/CMV 进行定向重组，制备出 γ-IFN 真核表达质粒 RC/CMV-IFNγ。转染 NRK 细胞后，经标准 ABC 法检测表明：γ-IFN 在 NRK 细胞中获得稳定表达。这一体系的建立为 γ-IFN 真核基因工程提供了稳定表达的工程细胞株，并为利用 γ-IFN 进行基因治疗提供重要的实验依据。
, 百拇医药
中图分类号： Q784 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0014-04
Expression of human γ-IFN in NRK cells
Gao Yanqing, Liu Xiang,Wang Huizhen, et al
(Dept. of Dermatology, 4th Clinical Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011)
Abstract： To facilitate the insertion of γ-IFN cDNA into the eukaryotic expression vector RC/CMV, γ-IFN cDNA was subcloned from pIFNγ into the cloning vehicle pBS-KS. By this procedure, the plasmid pBSKS-IFN γ has been constructed,from which γ-IFN cDNA containing HindⅢ/Xba Ⅰ cohesive end can be obtained. Then the prepaired γ-IFN cNDA was ligated to the eukaryotic expression vector containing the strong CMV promotor derived from cytomegalovirus genome. γ-IFN stable eukaryotic expression system has been established. The establishment of this system can offer liable cell lines for producing recombinant γ-IFN protein, which is the same as wild γ-IFN protein;it also provides sound scientific basis for research on gene therapy and expression of γ-IFN in the mamalian cell.
, 百拇医药
Key words: InterferontypeⅡ； interferon-gamma； recombiant； gene therapy
γ-干扰素(Interferon-Gamma,γ-IFN)是由活化 T 细胞产生的具有糖基化修饰的免疫细胞因子。由于其明显的抗肿瘤活性和免疫调节功能，因而在临床上得以广泛应用。近年来，γ-IFN 的原核表达体系日趋成熟，但也存在不少问题，如生产的γ-IFN 无糖基化修饰，且多在菌体内形成包含体，不能被分泌至培养基中，给进一步的分离纯化工作带来了困难。为生产出结构和功能与天然 γ-IFN 极其相似的、无热源的 γ-IFN 制剂，我们尝试构建了 γ-IFN 的真核表达质粒，并在 NRK 细胞中获得稳定表达。这一体系的建立不仅为基因工程生产 γ-IFN 开辟了一条新途径，而且为基因治疗和研究 γ-IFN 的真核表达特性提供重要的实验模型。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 菌株 质粒 大肠杆菌 DH5α，山西医科大学生化室保存，JM109 由山西大学生物工程研究室赠送。质粒 pBS-KS 购自华美生物工程公司，pBV220、pIFNγ、RC/CMV-HGF，以上 3 种质粒均由山西医科大学生化室保存。
1.2 主要试剂 限制性内切酶、RNA 酶、T4DNA 连接酶、牛肠碱性磷酸酶(CIP)购自华美生物工程公司及美国Promega公司。IPTG、X-gal购自华美生物工程公司。Agrose 及低熔点 Agrose 为美国 Promega 产品 Sephacryl S-1000 购自瑞典 Pharmacia 公司。DMEM、G418 为美国 GIBCO 产品。HEPES 为美国 Sigma 公司产品。小牛血清、胎牛血清购自天津生化制品厂。γ-IFN 单克隆抗体(鼠抗人 1∶5 000)购自上海第二军医大学微生物教研室，生物素标记的兔抗鼠 IgG(1∶200)及有关试剂购自美国 Dako 公司。
, http://www.100md.com 1.3 细胞株 NRK 细胞株：大鼠肾成纤维细胞，购自上海细胞所。
1.4 pBSKS-IFNγ亚克隆的构建 用 EcoRI 酶解质粒 pIFNγ，回收其中的 1.0 kb 片段，与同酶切后经末端去磷酸化处理的线性化载体 pBS-KS 进行连接反应。转化 JM109，用 α 互补现象筛选白色菌落，进行质粒小量快速抽提，酶切鉴定，筛选出带有 γ-IFN 单拷贝序列、插入方向正确的重组质粒 pBSKS-IFNγ。
1.5 γ-IFN 真核表达质粒的构建 用HindⅢ/XbaⅠ分别对 pBSKS-IFNγ 和 RC/CMV-HGF 进行联合酶切，回收其中的 1.0kb 的基因片段及长约 5.4 kb 的载体片段，进行连接反应，转化 DH5α，经质粒小量抽提、酶切鉴定，筛选出正确重组的新质粒 RC/CMV-IFNγ。
1.6 NRK 细胞的转染及筛选 NRK 细胞的转染采用磷酸钙共沉淀法。转染前 24 h 传代，待细胞铺满培养皿 70%～80%时，弃旧培养基，将预先配制好的磷酸钙-DNA 沉淀加至细胞表面。转染时间 6 h。用 G418 抗性筛选阳性克隆，选择压力为 600 mg/L，维持浓度 200 mg/L。阳性克隆的挑取采用胰酶局部消化法。
, 百拇医药
1.7 表达产物的免疫检测 采用标准 ABC 法。获转染阳性的克隆后，一部分转入盖玻片生长，待玻片长满细胞后，取出，PBS 洗两遍，丙酮固定，加 γ-IFN 单抗温育 1.5 h，PBS 清洗两遍后加生物素标记的二抗。最后 DAB 显色。
2 结果
2.1 pBSKS-IFNγ 亚克隆质粒的构建及酶切鉴定 用 EcoRI 酶解质粒 pIFNγ，回收含γ-IFN cDNA 序列的片段，与同酶切的经末端去磷酸化的线性 pBS-KS 进行了连接反应，转化 JM109,用 α 互补现象筛选得到 30 余个白色菌落，经质粒小量抽提，酶切鉴定，最终筛选出了带有 γ-IFN 单拷贝序列、插入方向正确的新质粒 pBSKS-IFNγ，见图1、图2。
图1 质粒 pBSKS-IFNγ的构建过程
, 百拇医药
1，8. λDNA/HindⅢ marker 2.pBS-KS EcoRⅠ digested
3.EcoRⅠ 4.SalⅠ 5.PstⅠ 6.SalⅠ/NcoⅠ 7.HindⅢ/XbaⅠ
图2 质粒 pBSKS-IFNγ 酶切鉴定电泳结果
2.2 γ-IFN 真核表达质粒的构建及酶切鉴定 用 HindⅢ/XbaⅠ 分别酶解质粒 pBSKS-IFNγ 和 RC/CMV-HGF，将回收的长约 1.0 kb 的 γ-IFN 基因片段与长约 5.4 kb 的载体进行了定向重组，转化了 DH5α，经质粒小量快速抽提，酶切鉴定，获得了含完整 γ-IFN cNDA 片段的真核表达质粒 RC/CMV-IFNγ，见图3、图4。
, 百拇医药
1，7.λDNA/HindⅢ marker 2.EcoRV 3.XbaⅠ 4.EcoRⅠ 5.HindⅢ/XbaⅠ
6.NcoⅠ 8.RC/CMV-HGF HindⅢ/XbaⅠ digested
图3 γ-IFN 真核表达质粒的构建
图4 质粒 RC/CMV-IFNγ 酶切鉴定电泳结果
2.3 RC/CMV-IFNγ在 NRK 细胞中的表达及免疫检测 将 RC/CMV-IFNγ 采用磷酸钙共沉淀法转染了 NRK 细胞。600 mg/L 筛选至第 14 d，存活的细胞呈克隆化生长，G418 维持 200 mg/L 继续培养。
用标准 ABC 法对传至盖玻片上生长的细胞进行检测后显微镜下可见，经 RC/CMV-IFNγ 转染的 NRK 细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，而未经转染的 NRK 细胞胞浆较为透亮，未出现棕黄色改变。说明经 RC/CMV-IFNγ 转染的 NRK 细胞表达出 γ-IFN 蛋白，并与 γ-IFN 单抗发生了特异反应。
, 百拇医药
3 讨论
由于 pIFNγ 中的γ-IFN cDNA 片段两侧缺乏合适的酶切位点，难以直接插入到真核表达载体 RC/CMV 中，因而我们首先利用一个中间载体 pBS-KS 进行了一步亚克隆。PBSKS-IFNγ亚克隆的构建成功地改变了 γ-IFN cDNA 片段两侧的酶切位点，为其真核表达质粒的构建提供了良好的中间媒介，而且为 γ-IFN 基因片段作好了亚克隆储备。结合 RC/CMV-HGF 上的多克隆位点，选择 HindⅢ/XbaⅠ 对 RC/CMV-HGF 和 pBSKS-IFNγ 分别进行联合酶切，将回收的 RC/CMV 载体片段与 γ-IFN cDNA 片段进行定向重组，得到了 γ-IFN 的真核表达质粒 RC/CMV-IFNγ。
图5 标准 ABC 法检测转染阳性的 NRK 细胞
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图6 标准 ABC 法检测未经转染的 NRK 细胞
该质粒转染 NRK 后，经免疫学检测，获得了稳定表达。由于巨细胞病毒在自然界有广泛的宿主细胞，带有 CMV 启动子的真核表达载体便可在多种真核细胞有效地工作。近年来，γ-IFN 的原核表达体系日趋成熟。同真核基因工程相比，人们对原核表达体系研究得较为充分，实际应用也很广泛，但原核细胞缺乏真核细胞翻译后的加工系统，如不能进行糖基化修饰、产生的蛋白不能正确折叠等。虽然经传统测活方法表明：经原核表达体系产生的这种无糖基化修饰的 γ-IFN 与天然 γ-IFN 相比，生物活性并无明显降低，但在临床应用中，前者的疗效远不如后者。此外，利用大肠杆菌产生的 γ-IFN 往往在胞浆内形成包含体，不能被分泌至培养基中，给进一步的分离纯化、复性增加了困难。解决上述问题的方法就是将克隆化基因通过真核表达载体导入真核细胞进行表达，产生出与天然蛋白无论在结构和功能都极其相似的蛋白，且利用真核细胞表达的蛋白可以被分泌至培养中，纯化工艺简单，热源少。但目前为止，利用真核细胞表达 γ-IFN 与原核表达体系相比还存在着产量相对较低、成本高等不利因素。这些问题的解决有赖于建立 γ-IFN 的高效真核表达体系和行之有效的分离纯化方法，目前这些工作正在进一步探索中。γ-IFN 真核表达体系的建立还为我们研究 γ-IFN 的真核表达特性提供了重要的实验室模型。
, 百拇医药
另外，由于 γ-IFN 具有明显的抗肿瘤活性和免疫调节功能，从 70 年代末开始即有人把它用于恶性肿瘤的治疗并取得了一定的疗效。但其半衰期短，代谢快，造成临床上不得不连续大剂量投入而导致疲劳、共济失调等全身副作用的发生，加之价格较为昂贵，限制了它的广泛应用。近年来，随着现代分子生物学的迅速发展，利用细胞因子对恶性肿瘤进行基因治疗日益引起人们的关注[1，2]。Nagak 等曾用逆转录病毒载体将人 γ-IFN 基因成功导入肿瘤细胞[3]，虽然尚处于实验阶段，但成果是令人鼓舞的。国内张腾飞等[4]也开展了这方面的工作，与国外取得了类似的结果。为探索将 γ-IFN 基因导入 TIL (肿瘤浸润淋巴细胞)或肿瘤细胞的可行性，我们构建成功了 γ-IFN 真核表达质粒，并在 NRK 细胞中获得稳定表达。进一步我们可以尝试将该质粒转染 TIL 或肿瘤细胞，继而用于恶性肿瘤的治疗。
综上所述，γ-IFN 真核表达体系的建立不仅为基因工程生产 γ-IFN 开辟了一条新途径，而且为研究 γ-IFN 的真核表达特性，进而阐明其基因表达的调控，提供重要的实验模型。γ-IFN 真核表达质粒的构建成功，为γ-IFN 的基因治疗奠定了坚实的实验和理论基础。
, http://www.100md.com
作者简介： 高艳青，女，1967年生，硕士，主治医师
参考文献：
[1] Hwu P, Rosenberg SA. The use of gene-modified tumor-infiltrating lymphocytes for cancer therapy[J].Ann NY Acad Sci,1994, 716 (5): 188～197.
[2] Hwu P, Rosenberg SA. The genetic modification of T cells for cancer therapy: an overview of laboratory and clinical trials[J]. Cancer Detect Prev, 1994, 18 (1): 43～50.
[3] Nayak SK, Han LJ, Gangavalli R, et al. Transduction of human renal carcinoma cells with human gamma-interferon gene via retroviral vetor[J]. Cancer Gene Ther, 1996, 3 (3): 143～150.
[4] 张腾飞，陈诗书.γ-IFN 基因修饰人肿瘤细胞的研究[J].中国免疫学杂志， 1996， 12 (1)： 25～27.
[收稿日期： 1999-07-15], http://www.100md.com
单位：高艳青(河北医科大学第四医院皮肤科 石家庄 050011);柳湘(上海市肿瘤研究所生化组);王惠珍(山西医科大学生物化学教研室);康玉英(山西医科大学生物化学教研室);程牛亮(山西医科大学生物化学教研室);牛勃(山西医科大学生物化学教研室)
关键词：干扰素 Ⅱ 型；干扰素γ，重组；基因疗法
山西医科大学学报000106 摘要： 以pBS-KS为中间载体，通过一步亚克隆，获得了两端结构为HindⅢ/Xba Ⅰ的γ-IFN cDNA 片段，将该片段与真核表达载体 RC/CMV 进行定向重组，制备出 γ-IFN 真核表达质粒 RC/CMV-IFNγ。转染 NRK 细胞后，经标准 ABC 法检测表明：γ-IFN 在 NRK 细胞中获得稳定表达。这一体系的建立为 γ-IFN 真核基因工程提供了稳定表达的工程细胞株，并为利用 γ-IFN 进行基因治疗提供重要的实验依据。
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中图分类号： Q784 文献标识码： A
文章编号： 1007-6611(2000)01-0014-04
Expression of human γ-IFN in NRK cells
Gao Yanqing, Liu Xiang,Wang Huizhen, et al
(Dept. of Dermatology, 4th Clinical Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011)
Abstract： To facilitate the insertion of γ-IFN cDNA into the eukaryotic expression vector RC/CMV, γ-IFN cDNA was subcloned from pIFNγ into the cloning vehicle pBS-KS. By this procedure, the plasmid pBSKS-IFN γ has been constructed,from which γ-IFN cDNA containing HindⅢ/Xba Ⅰ cohesive end can be obtained. Then the prepaired γ-IFN cNDA was ligated to the eukaryotic expression vector containing the strong CMV promotor derived from cytomegalovirus genome. γ-IFN stable eukaryotic expression system has been established. The establishment of this system can offer liable cell lines for producing recombinant γ-IFN protein, which is the same as wild γ-IFN protein;it also provides sound scientific basis for research on gene therapy and expression of γ-IFN in the mamalian cell.
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Key words: InterferontypeⅡ； interferon-gamma； recombiant； gene therapy
γ-干扰素(Interferon-Gamma,γ-IFN)是由活化 T 细胞产生的具有糖基化修饰的免疫细胞因子。由于其明显的抗肿瘤活性和免疫调节功能，因而在临床上得以广泛应用。近年来，γ-IFN 的原核表达体系日趋成熟，但也存在不少问题，如生产的γ-IFN 无糖基化修饰，且多在菌体内形成包含体，不能被分泌至培养基中，给进一步的分离纯化工作带来了困难。为生产出结构和功能与天然 γ-IFN 极其相似的、无热源的 γ-IFN 制剂，我们尝试构建了 γ-IFN 的真核表达质粒，并在 NRK 细胞中获得稳定表达。这一体系的建立不仅为基因工程生产 γ-IFN 开辟了一条新途径，而且为基因治疗和研究 γ-IFN 的真核表达特性提供重要的实验模型。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 菌株 质粒 大肠杆菌 DH5α，山西医科大学生化室保存，JM109 由山西大学生物工程研究室赠送。质粒 pBS-KS 购自华美生物工程公司，pBV220、pIFNγ、RC/CMV-HGF，以上 3 种质粒均由山西医科大学生化室保存。
1.2 主要试剂 限制性内切酶、RNA 酶、T4DNA 连接酶、牛肠碱性磷酸酶(CIP)购自华美生物工程公司及美国Promega公司。IPTG、X-gal购自华美生物工程公司。Agrose 及低熔点 Agrose 为美国 Promega 产品 Sephacryl S-1000 购自瑞典 Pharmacia 公司。DMEM、G418 为美国 GIBCO 产品。HEPES 为美国 Sigma 公司产品。小牛血清、胎牛血清购自天津生化制品厂。γ-IFN 单克隆抗体(鼠抗人 1∶5 000)购自上海第二军医大学微生物教研室，生物素标记的兔抗鼠 IgG(1∶200)及有关试剂购自美国 Dako 公司。
, http://www.100md.com 1.3 细胞株 NRK 细胞株：大鼠肾成纤维细胞，购自上海细胞所。
1.4 pBSKS-IFNγ亚克隆的构建 用 EcoRI 酶解质粒 pIFNγ，回收其中的 1.0 kb 片段，与同酶切后经末端去磷酸化处理的线性化载体 pBS-KS 进行连接反应。转化 JM109，用 α 互补现象筛选白色菌落，进行质粒小量快速抽提，酶切鉴定，筛选出带有 γ-IFN 单拷贝序列、插入方向正确的重组质粒 pBSKS-IFNγ。
1.5 γ-IFN 真核表达质粒的构建 用HindⅢ/XbaⅠ分别对 pBSKS-IFNγ 和 RC/CMV-HGF 进行联合酶切，回收其中的 1.0kb 的基因片段及长约 5.4 kb 的载体片段，进行连接反应，转化 DH5α，经质粒小量抽提、酶切鉴定，筛选出正确重组的新质粒 RC/CMV-IFNγ。
1.6 NRK 细胞的转染及筛选 NRK 细胞的转染采用磷酸钙共沉淀法。转染前 24 h 传代，待细胞铺满培养皿 70%～80%时，弃旧培养基，将预先配制好的磷酸钙-DNA 沉淀加至细胞表面。转染时间 6 h。用 G418 抗性筛选阳性克隆，选择压力为 600 mg/L，维持浓度 200 mg/L。阳性克隆的挑取采用胰酶局部消化法。
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1.7 表达产物的免疫检测 采用标准 ABC 法。获转染阳性的克隆后，一部分转入盖玻片生长，待玻片长满细胞后，取出，PBS 洗两遍，丙酮固定，加 γ-IFN 单抗温育 1.5 h，PBS 清洗两遍后加生物素标记的二抗。最后 DAB 显色。
2 结果
2.1 pBSKS-IFNγ 亚克隆质粒的构建及酶切鉴定 用 EcoRI 酶解质粒 pIFNγ，回收含γ-IFN cDNA 序列的片段，与同酶切的经末端去磷酸化的线性 pBS-KS 进行了连接反应，转化 JM109,用 α 互补现象筛选得到 30 余个白色菌落，经质粒小量抽提，酶切鉴定，最终筛选出了带有 γ-IFN 单拷贝序列、插入方向正确的新质粒 pBSKS-IFNγ，见图1、图2。
图1 质粒 pBSKS-IFNγ的构建过程
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1，8. λDNA/HindⅢ marker 2.pBS-KS EcoRⅠ digested
3.EcoRⅠ 4.SalⅠ 5.PstⅠ 6.SalⅠ/NcoⅠ 7.HindⅢ/XbaⅠ
图2 质粒 pBSKS-IFNγ 酶切鉴定电泳结果
2.2 γ-IFN 真核表达质粒的构建及酶切鉴定 用 HindⅢ/XbaⅠ 分别酶解质粒 pBSKS-IFNγ 和 RC/CMV-HGF，将回收的长约 1.0 kb 的 γ-IFN 基因片段与长约 5.4 kb 的载体进行了定向重组，转化了 DH5α，经质粒小量快速抽提，酶切鉴定，获得了含完整 γ-IFN cNDA 片段的真核表达质粒 RC/CMV-IFNγ，见图3、图4。
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1，7.λDNA/HindⅢ marker 2.EcoRV 3.XbaⅠ 4.EcoRⅠ 5.HindⅢ/XbaⅠ
6.NcoⅠ 8.RC/CMV-HGF HindⅢ/XbaⅠ digested
图3 γ-IFN 真核表达质粒的构建
图4 质粒 RC/CMV-IFNγ 酶切鉴定电泳结果
2.3 RC/CMV-IFNγ在 NRK 细胞中的表达及免疫检测 将 RC/CMV-IFNγ 采用磷酸钙共沉淀法转染了 NRK 细胞。600 mg/L 筛选至第 14 d，存活的细胞呈克隆化生长，G418 维持 200 mg/L 继续培养。
用标准 ABC 法对传至盖玻片上生长的细胞进行检测后显微镜下可见，经 RC/CMV-IFNγ 转染的 NRK 细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，而未经转染的 NRK 细胞胞浆较为透亮，未出现棕黄色改变。说明经 RC/CMV-IFNγ 转染的 NRK 细胞表达出 γ-IFN 蛋白，并与 γ-IFN 单抗发生了特异反应。
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3 讨论
由于 pIFNγ 中的γ-IFN cDNA 片段两侧缺乏合适的酶切位点，难以直接插入到真核表达载体 RC/CMV 中，因而我们首先利用一个中间载体 pBS-KS 进行了一步亚克隆。PBSKS-IFNγ亚克隆的构建成功地改变了 γ-IFN cDNA 片段两侧的酶切位点，为其真核表达质粒的构建提供了良好的中间媒介，而且为 γ-IFN 基因片段作好了亚克隆储备。结合 RC/CMV-HGF 上的多克隆位点，选择 HindⅢ/XbaⅠ 对 RC/CMV-HGF 和 pBSKS-IFNγ 分别进行联合酶切，将回收的 RC/CMV 载体片段与 γ-IFN cDNA 片段进行定向重组，得到了 γ-IFN 的真核表达质粒 RC/CMV-IFNγ。
图5 标准 ABC 法检测转染阳性的 NRK 细胞
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图6 标准 ABC 法检测未经转染的 NRK 细胞
该质粒转染 NRK 后，经免疫学检测，获得了稳定表达。由于巨细胞病毒在自然界有广泛的宿主细胞，带有 CMV 启动子的真核表达载体便可在多种真核细胞有效地工作。近年来，γ-IFN 的原核表达体系日趋成熟。同真核基因工程相比，人们对原核表达体系研究得较为充分，实际应用也很广泛，但原核细胞缺乏真核细胞翻译后的加工系统，如不能进行糖基化修饰、产生的蛋白不能正确折叠等。虽然经传统测活方法表明：经原核表达体系产生的这种无糖基化修饰的 γ-IFN 与天然 γ-IFN 相比，生物活性并无明显降低，但在临床应用中，前者的疗效远不如后者。此外，利用大肠杆菌产生的 γ-IFN 往往在胞浆内形成包含体，不能被分泌至培养基中，给进一步的分离纯化、复性增加了困难。解决上述问题的方法就是将克隆化基因通过真核表达载体导入真核细胞进行表达，产生出与天然蛋白无论在结构和功能都极其相似的蛋白，且利用真核细胞表达的蛋白可以被分泌至培养中，纯化工艺简单，热源少。但目前为止，利用真核细胞表达 γ-IFN 与原核表达体系相比还存在着产量相对较低、成本高等不利因素。这些问题的解决有赖于建立 γ-IFN 的高效真核表达体系和行之有效的分离纯化方法，目前这些工作正在进一步探索中。γ-IFN 真核表达体系的建立还为我们研究 γ-IFN 的真核表达特性提供了重要的实验室模型。
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另外，由于 γ-IFN 具有明显的抗肿瘤活性和免疫调节功能，从 70 年代末开始即有人把它用于恶性肿瘤的治疗并取得了一定的疗效。但其半衰期短，代谢快，造成临床上不得不连续大剂量投入而导致疲劳、共济失调等全身副作用的发生，加之价格较为昂贵，限制了它的广泛应用。近年来，随着现代分子生物学的迅速发展，利用细胞因子对恶性肿瘤进行基因治疗日益引起人们的关注[1，2]。Nagak 等曾用逆转录病毒载体将人 γ-IFN 基因成功导入肿瘤细胞[3]，虽然尚处于实验阶段，但成果是令人鼓舞的。国内张腾飞等[4]也开展了这方面的工作，与国外取得了类似的结果。为探索将 γ-IFN 基因导入 TIL (肿瘤浸润淋巴细胞)或肿瘤细胞的可行性，我们构建成功了 γ-IFN 真核表达质粒，并在 NRK 细胞中获得稳定表达。进一步我们可以尝试将该质粒转染 TIL 或肿瘤细胞，继而用于恶性肿瘤的治疗。
综上所述，γ-IFN 真核表达体系的建立不仅为基因工程生产 γ-IFN 开辟了一条新途径，而且为研究 γ-IFN 的真核表达特性，进而阐明其基因表达的调控，提供重要的实验模型。γ-IFN 真核表达质粒的构建成功，为γ-IFN 的基因治疗奠定了坚实的实验和理论基础。
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作者简介： 高艳青，女，1967年生，硕士，主治医师
参考文献：
[1] Hwu P, Rosenberg SA. The use of gene-modified tumor-infiltrating lymphocytes for cancer therapy[J].Ann NY Acad Sci,1994, 716 (5): 188～197.
[2] Hwu P, Rosenberg SA. The genetic modification of T cells for cancer therapy: an overview of laboratory and clinical trials[J]. Cancer Detect Prev, 1994, 18 (1): 43～50.
[3] Nayak SK, Han LJ, Gangavalli R, et al. Transduction of human renal carcinoma cells with human gamma-interferon gene via retroviral vetor[J]. Cancer Gene Ther, 1996, 3 (3): 143～150.
[4] 张腾飞，陈诗书.γ-IFN 基因修饰人肿瘤细胞的研究[J].中国免疫学杂志， 1996， 12 (1)： 25～27.
[收稿日期： 1999-07-15], http://www.100md.com