不同月份胎儿半月板的电镜观察
作者：王 松 胡声宇 秦 岭
单位：王 松 胡声宇(武汉体育学院运动解剖学教研室 430079)；秦岭(香港中文大学矫形外科及创伤学系
关键词：胎儿；半月板；电镜
中国运动医学杂志990131 提要 采用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对不同月份胎儿半月板形态结构进行对比研究，从发生学角度来探讨胎儿半月板细胞、纤维等结构的发展趋势和规律。
膝关节半月板一直是国内外运动医学界长期研究的课题，以往实验对象大多局限于动物的半月板，对于人特别是胎儿时期半月板的结构却研究甚少，为此，本研究用透射电镜和扫描电镜对不同月份胎儿半月板的形态结构进行观察。
1 材料和方法
选用得到卫生部门认可的9具引产胎儿的膝关节半月板(36个)作为实验材料。其中，5具左、右膝关节外侧半月板作为透射电镜标本，9具左、右膝关节的内侧半月板作为扫描电镜标本(见附表)。先将胎儿放在10%福尔马林钙液中固定，再打开关节腔取出半月板。
, 百拇医药
透射电镜标本制作法：取出半月板后，先入2%戊二醛固定液，在4℃下固定1～2小时，尔后缓冲液反复洗涤2～3小时(中间换液3次)，再入1%饿酸固定2小时，经缓冲液冲洗3次，每次15分钟，各级酒精充分脱水，Epon_812包埋剂浸透，Epon_812包埋，MT—6000超薄切片机切片，切片经电子染色后，最后在Hitachi_H300电镜下观察。
扫描电镜标本制作法：取出半月板后，先入2%戊二醛固定液在4℃下固定1～2小时，尔后缓冲液反复洗涤2～3小时(中间换液3次)，再入1%饿酸固定2小时，经缓冲液冲洗3次，每次15分钟，各级酒精充分脱水，乙酸异戊酯浸透，临界点干燥，高真空镀膜，扫描电镜(Hitachi_S450)观察。
2 结果
2.1 胎龄4个月的半月板(1具)
2.1.1 透射电镜观察结果
, 百拇医药
外则部：主细胞清晰可见，胞体较大，呈圆形，胞质均匀透明，细胞表面有少数短小胞质突起伸入基质，细胞核下有块状异染色质，有时可见核仁。其主要特点为胞质内含有无界膜空泡，内含颗粒，细胞器不丰富。其周围的软骨陷窝清晰可见。从胶原纤维看，外侧部表层结构稀疏，纤维很细，方向不一致，纤维间有毛细血管，但内皮结构不完整。
中间部：细胞无膜性结构，细胞及其间质(纤维)直接突出至表面。细胞呈长棱形，细胞器较少，胞质内有空泡，核膜较完整，染色质呈粗大块状。胶原纤维较多，呈束状排列，多与半月板表面平行，并有血管。
2.1.2 扫描电镜观察结果
表面无膜性物覆盖，细胞直接外露，细胞极性不明显，有不规则的胞质片突出于表面，可见软骨陷窝胶原纤维外侧较粗糙，往内渐细腻。中部表面软平滑，细胞极性明显，呈纵向排列，表面无明显膜结构。
2.2 胎龄5个月的半月板(2具)扫描电镜观察结果
, 百拇医药
表面未见膜被覆，胶原纤维排列与半月板纵向一致，内侧半呈颗粒状。外侧细胞呈不规则梭形或卵圆形细胞有突起，细胞极性明显，细胞裸露，外表未见膜被覆。内侧细胞极性不明显，有胞质突出于表面，突起交错。
2.3 胎龄6个月的半月板(2具)
2.3.1 透射电镜观察结果
外侧部表层：可见一膜状结构物。细胞有两种，其一为主细胞，核膜下有常染色质，可见核仁，细胞器较丰富。其二为暗细胞，核致密，核膜皱缩呈扭曲状，染色质呈粗大块状。在主细胞外侧有一刚分裂后的细胞。胶原纤维较稀疏，呈不同方向排列。
中部：细胞为主细胞和暗细胞，核膜致密。胶原纤维呈束状排列，较致密，以纵行为主，但也有大量横行及斜行纤维。
2.3.2 扫描电镜观察结果
, 百拇医药
外侧1/2胶原纤维呈束状，沿半月板纵向平行排列，内1/2呈颗粒状。细胞极性不明显，呈卵圆拉长状，有突起。细胞表面有一层被覆物，软骨陷窝可见。
2.4 胎龄7个月的半月板(2具)扫描电镜观察结果
在半月板外、中内胶原纤维束可见，呈波浪纵向排列。细胞呈卵圆棱形，有突起，细胞表面被覆物增厚，软骨陷窝可见。
2.5 胎龄8个月的半月板(2具)
2.5.1 透射电镜观察结果
外侧部：可见一膜被覆外侧表面。细胞呈细拉长杆状，极性与表面平行，核致密，染色质粗大块状，胞质浓缩，核占比例大，核膜较明显。细胞呈同源群，软骨陷窝明显可见。胶原纤维丰富呈波浪状，方向有纵行、横行、斜行交织在一起。
, 百拇医药 中间部：表层细胞呈杆状或细杆弯曲状，染色质呈粗大块状，细胞质占比例小，细胞器不丰富，软骨陷窝可见，但腔明显变小。胶原纤维较细，排列方向不一，呈波浪状。中间部深层，胶原纤维更加致密，呈波浪状排列，有纵行、横行、斜行交织在一起。
2.5.2 扫描电镜观察结果
胶原纤维束更加清晰可见，布于全半月板，也可见软骨陷窝。细胞呈长梭形，表面明显有被覆物。
3 讨论
本研究通过透射电镜及扫描电镜对半月板胞的内部结构、立体结构及纤维形态结构、表面的覆盖物进行了观察，发现半月板在胚胎发育过程中有如下特点。
3.1 随着胎龄的增长，细胞的形态从圆形、少突起(胎龄4～5个月)，到卵圆形多突起(胎龄6～7个月)，直到梭形，拉长杆状，并有多突起(胎龄8个月)发展。
, 百拇医药
3.2 从透射电镜观察到有主细胞及暗细胞的存在。这两种细胞是由Hwang(1978)对6—9个月胎儿及新生儿的喉软骨及肋软骨上观察所得到的。本次对半月板的观察中也发现了这两种细胞均参与半月板的形成。
3.3 随着胎龄的增长，发现有主细胞减少，暗细胞增多的趋势，这可能由于主细胞有转化为暗细胞的趋向。主细胞与暗细胞结构特点是：主细胞细胞核较均匀，细胞器较丰富，而暗细胞胞核浓缩致密，细胞器较少，核体积占比例较大，突起较多，胞质较致密，颗粒较多，并且暗细胞所占的软骨陷窝腔隙较大。就此可以推断暗细胞的主要功能为吞噬功能。由于暗细胞胞质内细胞器较少，细胞本身的自我修复、更新的能力相对就弱些，这些特点也就制约了半月板损伤后自我修复的能力。
3.4 在同一标本中，发现靠近髁间隆起的半月板部分，暗细胞数量的比例要比远离髁间隆起的半月板部分大。半月板呈“C”型，关且随着年龄增长，半月板的开口增大，这一结果可能就是由于暗细胞较多，吞噬基质所造成的。半月板两侧的暗细胞要比中间部分的暗细胞多，这一现象有可能是由于半月板中间部分血管较少(以前学者已发现)所引起的。血管少，细胞所得的营养物质缺乏就可能引起主细胞向暗细胞的转化。
, 百拇医药
3.5 胶原纤维在胎儿早期(4个月)较细，稀疏不成束，随着生长发展，到胎龄5—6个月时，可见胶原纤维呈束状纵向排列，较为致密；到胎龄7—8个月时，胶原纤维束致密、丰富，有的呈波浪状排列，纵行、横行、斜行的纤维交织在一起，遍布整个半月板。
3.6 半月板表面的覆盖物。以往专家、学者对出生后及成年兔的半月板表面进行过光镜和电镜观察，均发现有一层滑膜被覆在半月板的股骨平面及胫骨平面上。此滑膜为关节囊滑膜的延续，本次研究也发现胎儿在6个月才开始出现一层膜被覆，随着时间增长，这层膜结构变得厚实且明显，这可能由于两侧外周半月板增长、增大，增厚挤压关节囊滑膜向中间部位延伸所引起，但半月板表面滑膜层为何不随半月板的形成同时出现，有待于进一步探讨。
3.7 血管。本研究在胎龄第4个月的标本切片中发现有血管出现，在以后的胎龄半月板中血管的出现率不如光镜切片所观察到的那样明显和丰富，这可能与超薄切片取材部位有关。
, 百拇医药
3.8 在胎儿时期，我们未发现有盘状半月板(不论内侧或外侧半月板)，这与Kaplan的研究结果[1]一致，在我们所取胎儿半月板中，最早的胎龄4个月，半月板形状与成人相似，与Koss报道[2]吻合。
4 小结
我们首次采用电子显微镜(TEM、SEM)对不同月份胎儿的半月板进行了对比观察、分析，从中得到了胎儿发展时期、半月板表面的被覆物、细胞和胶原纤维的发展规律和趋势。这不仅丰富了有关半月板的内容，而且对认识影响损伤半月板愈合诸因素发生发展的过程有十分重要的意义。
5 参考文献
[1]Kaplan EB.Discoid lateral meniscus of the knee joint.J Bone Joinstsurg(am).
[2]Ross JA.Conqenital discoid cantilage.J Bone Joint surg(Br) 1958,40:262.
[3]陈尔瑜.胎儿膝关节半月板.解剖学报.1979，10：7.
(1997.12.01收稿), 百拇医药
单位：王 松 胡声宇(武汉体育学院运动解剖学教研室 430079)；秦岭(香港中文大学矫形外科及创伤学系
关键词：胎儿；半月板；电镜
中国运动医学杂志990131 提要 采用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对不同月份胎儿半月板形态结构进行对比研究，从发生学角度来探讨胎儿半月板细胞、纤维等结构的发展趋势和规律。
膝关节半月板一直是国内外运动医学界长期研究的课题，以往实验对象大多局限于动物的半月板，对于人特别是胎儿时期半月板的结构却研究甚少，为此，本研究用透射电镜和扫描电镜对不同月份胎儿半月板的形态结构进行观察。
1 材料和方法
选用得到卫生部门认可的9具引产胎儿的膝关节半月板(36个)作为实验材料。其中，5具左、右膝关节外侧半月板作为透射电镜标本，9具左、右膝关节的内侧半月板作为扫描电镜标本(见附表)。先将胎儿放在10%福尔马林钙液中固定，再打开关节腔取出半月板。
, 百拇医药
透射电镜标本制作法：取出半月板后，先入2%戊二醛固定液，在4℃下固定1～2小时，尔后缓冲液反复洗涤2～3小时(中间换液3次)，再入1%饿酸固定2小时，经缓冲液冲洗3次，每次15分钟，各级酒精充分脱水，Epon_812包埋剂浸透，Epon_812包埋，MT—6000超薄切片机切片，切片经电子染色后，最后在Hitachi_H300电镜下观察。
扫描电镜标本制作法：取出半月板后，先入2%戊二醛固定液在4℃下固定1～2小时，尔后缓冲液反复洗涤2～3小时(中间换液3次)，再入1%饿酸固定2小时，经缓冲液冲洗3次，每次15分钟，各级酒精充分脱水，乙酸异戊酯浸透，临界点干燥，高真空镀膜，扫描电镜(Hitachi_S450)观察。
2 结果
2.1 胎龄4个月的半月板(1具)
2.1.1 透射电镜观察结果
, 百拇医药
外则部：主细胞清晰可见，胞体较大，呈圆形，胞质均匀透明，细胞表面有少数短小胞质突起伸入基质，细胞核下有块状异染色质，有时可见核仁。其主要特点为胞质内含有无界膜空泡，内含颗粒，细胞器不丰富。其周围的软骨陷窝清晰可见。从胶原纤维看，外侧部表层结构稀疏，纤维很细，方向不一致，纤维间有毛细血管，但内皮结构不完整。
中间部：细胞无膜性结构，细胞及其间质(纤维)直接突出至表面。细胞呈长棱形，细胞器较少，胞质内有空泡，核膜较完整，染色质呈粗大块状。胶原纤维较多，呈束状排列，多与半月板表面平行，并有血管。
2.1.2 扫描电镜观察结果
表面无膜性物覆盖，细胞直接外露，细胞极性不明显，有不规则的胞质片突出于表面，可见软骨陷窝胶原纤维外侧较粗糙，往内渐细腻。中部表面软平滑，细胞极性明显，呈纵向排列，表面无明显膜结构。
2.2 胎龄5个月的半月板(2具)扫描电镜观察结果
, 百拇医药
表面未见膜被覆，胶原纤维排列与半月板纵向一致，内侧半呈颗粒状。外侧细胞呈不规则梭形或卵圆形细胞有突起，细胞极性明显，细胞裸露，外表未见膜被覆。内侧细胞极性不明显，有胞质突出于表面，突起交错。
2.3 胎龄6个月的半月板(2具)
2.3.1 透射电镜观察结果
外侧部表层：可见一膜状结构物。细胞有两种，其一为主细胞，核膜下有常染色质，可见核仁，细胞器较丰富。其二为暗细胞，核致密，核膜皱缩呈扭曲状，染色质呈粗大块状。在主细胞外侧有一刚分裂后的细胞。胶原纤维较稀疏，呈不同方向排列。
中部：细胞为主细胞和暗细胞，核膜致密。胶原纤维呈束状排列，较致密，以纵行为主，但也有大量横行及斜行纤维。
2.3.2 扫描电镜观察结果
, 百拇医药
外侧1/2胶原纤维呈束状，沿半月板纵向平行排列，内1/2呈颗粒状。细胞极性不明显，呈卵圆拉长状，有突起。细胞表面有一层被覆物，软骨陷窝可见。
2.4 胎龄7个月的半月板(2具)扫描电镜观察结果
在半月板外、中内胶原纤维束可见，呈波浪纵向排列。细胞呈卵圆棱形，有突起，细胞表面被覆物增厚，软骨陷窝可见。
2.5 胎龄8个月的半月板(2具)
2.5.1 透射电镜观察结果
外侧部：可见一膜被覆外侧表面。细胞呈细拉长杆状，极性与表面平行，核致密，染色质粗大块状，胞质浓缩，核占比例大，核膜较明显。细胞呈同源群，软骨陷窝明显可见。胶原纤维丰富呈波浪状，方向有纵行、横行、斜行交织在一起。
, 百拇医药 中间部：表层细胞呈杆状或细杆弯曲状，染色质呈粗大块状，细胞质占比例小，细胞器不丰富，软骨陷窝可见，但腔明显变小。胶原纤维较细，排列方向不一，呈波浪状。中间部深层，胶原纤维更加致密，呈波浪状排列，有纵行、横行、斜行交织在一起。
2.5.2 扫描电镜观察结果
胶原纤维束更加清晰可见，布于全半月板，也可见软骨陷窝。细胞呈长梭形，表面明显有被覆物。
3 讨论
本研究通过透射电镜及扫描电镜对半月板胞的内部结构、立体结构及纤维形态结构、表面的覆盖物进行了观察，发现半月板在胚胎发育过程中有如下特点。
3.1 随着胎龄的增长，细胞的形态从圆形、少突起(胎龄4～5个月)，到卵圆形多突起(胎龄6～7个月)，直到梭形，拉长杆状，并有多突起(胎龄8个月)发展。
, 百拇医药
3.2 从透射电镜观察到有主细胞及暗细胞的存在。这两种细胞是由Hwang(1978)对6—9个月胎儿及新生儿的喉软骨及肋软骨上观察所得到的。本次对半月板的观察中也发现了这两种细胞均参与半月板的形成。
3.3 随着胎龄的增长，发现有主细胞减少，暗细胞增多的趋势，这可能由于主细胞有转化为暗细胞的趋向。主细胞与暗细胞结构特点是：主细胞细胞核较均匀，细胞器较丰富，而暗细胞胞核浓缩致密，细胞器较少，核体积占比例较大，突起较多，胞质较致密，颗粒较多，并且暗细胞所占的软骨陷窝腔隙较大。就此可以推断暗细胞的主要功能为吞噬功能。由于暗细胞胞质内细胞器较少，细胞本身的自我修复、更新的能力相对就弱些，这些特点也就制约了半月板损伤后自我修复的能力。
3.4 在同一标本中，发现靠近髁间隆起的半月板部分，暗细胞数量的比例要比远离髁间隆起的半月板部分大。半月板呈“C”型，关且随着年龄增长，半月板的开口增大，这一结果可能就是由于暗细胞较多，吞噬基质所造成的。半月板两侧的暗细胞要比中间部分的暗细胞多，这一现象有可能是由于半月板中间部分血管较少(以前学者已发现)所引起的。血管少，细胞所得的营养物质缺乏就可能引起主细胞向暗细胞的转化。
, 百拇医药
3.5 胶原纤维在胎儿早期(4个月)较细，稀疏不成束，随着生长发展，到胎龄5—6个月时，可见胶原纤维呈束状纵向排列，较为致密；到胎龄7—8个月时，胶原纤维束致密、丰富，有的呈波浪状排列，纵行、横行、斜行的纤维交织在一起，遍布整个半月板。
3.6 半月板表面的覆盖物。以往专家、学者对出生后及成年兔的半月板表面进行过光镜和电镜观察，均发现有一层滑膜被覆在半月板的股骨平面及胫骨平面上。此滑膜为关节囊滑膜的延续，本次研究也发现胎儿在6个月才开始出现一层膜被覆，随着时间增长，这层膜结构变得厚实且明显，这可能由于两侧外周半月板增长、增大，增厚挤压关节囊滑膜向中间部位延伸所引起，但半月板表面滑膜层为何不随半月板的形成同时出现，有待于进一步探讨。
3.7 血管。本研究在胎龄第4个月的标本切片中发现有血管出现，在以后的胎龄半月板中血管的出现率不如光镜切片所观察到的那样明显和丰富，这可能与超薄切片取材部位有关。
, 百拇医药
3.8 在胎儿时期，我们未发现有盘状半月板(不论内侧或外侧半月板)，这与Kaplan的研究结果[1]一致，在我们所取胎儿半月板中，最早的胎龄4个月，半月板形状与成人相似，与Koss报道[2]吻合。
4 小结
我们首次采用电子显微镜(TEM、SEM)对不同月份胎儿的半月板进行了对比观察、分析，从中得到了胎儿发展时期、半月板表面的被覆物、细胞和胶原纤维的发展规律和趋势。这不仅丰富了有关半月板的内容，而且对认识影响损伤半月板愈合诸因素发生发展的过程有十分重要的意义。
5 参考文献
[1]Kaplan EB.Discoid lateral meniscus of the knee joint.J Bone Joinstsurg(am).
[2]Ross JA.Conqenital discoid cantilage.J Bone Joint surg(Br) 1958,40:262.
[3]陈尔瑜.胎儿膝关节半月板.解剖学报.1979，10：7.
(1997.12.01收稿), 百拇医药