端粒重复序列扩增-银染色法用于端粒酶活性测定的研究
作者：虞伟 谈华 武建国 季洪爱
单位：虞伟(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；谈华(南京市儿童医院检验科)；武建国(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；季洪爱(南京总医院病理科)
关键词：端粒酶；端粒重复序列扩增-银染色；肿瘤
医学研究生学报000209摘 要：目的：建立端粒重复序列扩增(TRAP)- 银染色技术，探讨端粒酶活性检测在肿瘤诊断中的意义。方法：用裂解液提取组织细胞中的端粒酶模板，在特异引物作用下进行PCR 扩增，所得产物用氯仿∶异戊醇(24∶1)处理浓缩，作聚丙稀酰胺凝胶垂直板电泳，经硝酸银染色分析端粒酶活性。结果：TRAP-银染色法能准确特异地检测小鼠骨髓瘤细胞(SP 2/0)的端粒酶活性，灵敏度可达 1×102个细胞。端粒酶阳性率在23例各种恶性肿瘤组织中为 86.9 % (20/23)，而在19例炎性包块与良性增生组织为5.3%(1/19)，5例正常组织中未发现有端粒酶活性。 结论：TRAP-银染色法简便快速、具有较好的测定敏感度与重复性，对临床恶性肿瘤疾病的诊断具有良好的应用前景。
, 百拇医药
分类号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1008-8199(2000)02-0096-03
Detection of telomerase activity using telomere repeat amplification protocol silver stain
YU Wei WU Jian-guo
(Center of Medical Laboratory Science Jinling Hospital, Nanjing 210002,Jiangsu,China)
TAN Hua
(Department of Pathology,Nanjing Childrens Hospital)
, 百拇医药
JI Hong-ai
(Department of Pathology,Jinling Hospital)
Abstract：Objectives:To establish a method of telomere repeat amplification protocol(TRAP)silver stain technique, and to investigate the significance of telomerase activity detection in tumor diagnosis. Methods:Telomerase template was extracted from tissues and cells by lysis buffer, PCR amplification was performed under specific primer elongation. After processed and enriched with chloroform∶isopentanol(24∶1),the PCR products were electrophoresed by vertical plate on 10% invariance polyacrylamide gel. Telomerase activity was analyzed using sliver nitrate nucleic acid gel stain. Results:Telomerase activity could be determined accurately and specifically by TRAP silver stain in mice myeloma cells, and the sensitivity of detection of this method was 1×102 cells. The positive rate of telomerase was 86.9%(20/23) of patients with various tumor tissues, and 5.3%(1/19) of patients with inflammation as well as benign proliferation tissues, while telomerase activity was not detected in 5 normal tissues. Conclusions:TRAP-silver stain proctocol is simple, rapid, sensitive and reproducible. It is applicable in the diagnosis of clinical malignant diseases.
, 百拇医药
Key words：Telomerase; TRAP-silver stain; Tumor▲
0 引言
端粒(telomere)是真核细胞生物染色体末端的特殊DNA-蛋白质结构，含有多个重复序列，人类为TTAGGG，这一结构在染色体复制及保持染色体稳定中起重要作用[1]。有证据表明，端粒DNA长度随着每次细胞分裂而逐渐缩短，与细胞的寿命密切相关[2]，而其本身的合成又依赖于端粒酶(telomerase)的活化。近年来，随着端粒长度与端粒酶活性研究的不断深入，其在肿瘤诊断乃至治疗中的地位日显突出。研究发现，在绝大多数的恶性肿瘤组织及100%的肿瘤细胞株中有高活性的端粒酶表达，而正常体细胞则不能检出端粒酶活性。因此，对组织或细胞中端粒酶活性检测具有重要意义。我们采用聚合酶链反应，先行端粒DNA扩增，所得产物再行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和染色，建立了端粒重复序列扩增(TRAP)-银染技术，对各类细胞穿刺标本及小鼠骨髓瘤细胞株 (SP 2/0) 端粒酶活性进行了检测，取得了较为满意的结果，现报告如下：
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 引物设计 按照Kim 法[3]合成一对引物(由中科院上海生物化学研究所合成)。TS引物：5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3；CX 引物：5-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3。
1.1.2 细胞 组织细胞均为细针穿刺标本，其中乳腺癌9例，甲状腺癌2例，远端转移癌6例，其他恶性肿瘤(包括口腔部和前额部恶性肿瘤)6例，炎性包块与良性增生组织19例，冻存于-70℃冰箱内待检。培养细胞为小鼠骨髓瘤细胞株(SP 2/0)本中心保存。
1.1.3 仪器 PCR扩增仪9600型 (美国Perkin Elmer公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 端粒酶模板制备 取收集的细胞标本于1.5 ml Eppendorf管中，用无菌等渗盐水洗涤后，离心弃上清，打散沉淀，加入预冷的裂解液[内含0.1 mmol/L PMSF，10 mmol/L Tris(pH 7.5)，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5%(W/V)CHASP，10%甘油(V/V)]20 μl，混匀，置4℃ 1 h，4℃ 1 000 g/min离心10 min，上清定蛋白量，用裂解液调浓度至30 μg/ml，于-20℃冻存备用。
1.2.2 PCR扩增 每份待检样本反应总量为50 μl，内含10×TARP缓冲液[内含Tris(pH 8.0)200 mmol/L，MgCl2 15 mmol/L,KCl 600 mmol/L，Tween-20 (0.05%), EGTA 10 mmol/L]5 μl，dNTP 1 μl (50 μmol/L)，Taq-DNA聚合酶0.5 μl(2 U)，T4g32蛋白0.2 μl(1 μg)，Ts引物1 μl (100 ng )，模板2 μl, 用DEPC灭菌水补足体积至49 μl，于PCR扩增仪上30℃保温20 min后，加入CX引物1 μl (100 ng )，然后94℃热变性45 s，50℃45 s退火，72℃60 s延伸, 共31个循环，最后于72℃延伸5 min。
, 百拇医药
1.2.3 PCR产物处理 于扩增后的PCR产物中加入氯仿∶异戊醇(24∶1)50 μl，混匀，10 000 g/min离心5 min，吸取上层液体置另一0.5 ml Eppendorf管中，加入3 mol/L醋酸钠5 μl和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置-20℃ 2 h，取出后于4℃，15 000 g/min离心20 min，弃上清，留沉淀气干，用DEPC灭菌水10 μl溶解。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 取上述PCR浓缩产物10 μl，加上样缓冲液5 μl，在电压180 V，10%不变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳50 min。
1.2.5 凝胶染色 电泳结束后，将凝胶取出置10% 乙醇固定5 min，再用1% 硝酸浸泡5 min，染色10 min(硝酸银染液)，最后于碳酸钠显色液呈色，待观察到全部条带显色，即用10%的冰乙酸终止反应，制膜保存。
2 结果
, 百拇医药
2.1 TRAP-银染法灵敏度与特异性 如图1所示，结果以出现5条以上间隔6个核苷酸的DNA片断梯度示有端粒酶活性(阳性)。用该法测定端粒酶阳性细胞株SP 2/0，可检测出1×102个细胞(裂解后定蛋白量为0.4 μg)的端粒酶活性，而用RNase A处理后的SP 2/0与正常组织细胞则显示端粒酶为阴性。
图1 体表肿块细针穿刺标本端粒酶测定结果
Figure 1 The result of telomerase activity in
fine-needle aspiration specimens from superficial tumors
1～4：mammary gland cancer；5：thyroideal cancer；
, 百拇医药
6：mammary gland epithelial cell proliferation；
7：lymphaden transfered cancer；8：tumor cell line SP 2/0
2.2 临床穿刺标本端粒酶测定结果 通过对23例各种恶性肿瘤组织检测，发现有20例显示有端粒酶活性，阳性率为86.9%;而在19例炎性包块与良性增生组织中亦有1例阳性(5.3%)，5例正常组织未发现有端粒酶活性(表1)。
表1 不同组织穿刺标本端粒酶测定结果
Table 1 The result of telomerase activity in
fine-needle aspiration specimens from various tissues Specimens origin
, http://www.100md.com
n
Positive number(%)
Mammary gland cancer
9
9(100)
Thyroidea cancer
2
2 (100)
Distant transfered cancer
6
4 (66.7)
, http://www.100md.com Other malignant tumor
6
5 (83.3)
Inflammation tumor
13
0 (0)
Benign proliferation tissue
6
1 (16.7)
Normal control
5
0 (0)
, 百拇医药
3 讨论
端粒酶是一种独特的DNA聚合酶，以其自身携带的RNA模板而区别于一般的纯蛋白逆转录酶，它的活性是在染色体末端不断添加端粒重复序列，以弥补因端粒的丢失而使细胞无限增殖。端粒酶因在人类细胞永生和致癌过程中起着至关重要的作用而成为肿瘤诊断的标志物。人们最早设计的检测端粒酶的方法是测定细胞提取物，将端粒重复片段加到一个合成的寡聚核苷酸引物的3末端，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物，然后进行放射自显影[4]，由于该法敏感度极低，现已被淘汰。目前，国外普遍采用的方法为端粒重复序列扩增(TRAP)同位素掺入标记(放射自显影)法，通过聚合酶链反应扩增酶促反应产物，极大地提高了实验的敏感性[3]，但因此法也同样存在有放射性污染、步骤繁琐、所需时间长等缺点，且价格昂贵，临床上推广应用受到一定限制。在此基础上，我们对该法进行了改良，建立了TRAP-银染测定法，取得了较为满意的效果。通过对肿瘤细胞株SP 2/0研究发现，可检测出1×102个细胞中的端粒酶活性。该法不仅保留了上述TRAP放射自显影技术敏感度高、特异性强等优点，而且还具有试剂稳定、来源方便、所需时间短(4 h即可出结果)和重复性好的特点。在对PCR扩增产物的预处理过程中，我们选用了氯仿∶异戊醇(24∶1)进行DNA抽提，以除去反应体系中的蛋白质，这样对改善后续电泳效果、减低背景呈色和拖尾现象的发生，特别是对组织块、骨髓和血样标本的检测效果更佳。
, 百拇医药
各种肿瘤组织端粒酶活性总体检出率为86.9%(20/23)，与文献报道的结果[5，6]相一致，其中有2例消化道恶性肿瘤远端组织(淋巴肿块穿刺)，病理诊断为转移性癌，但端粒酶结果为阴性。近年有文献报道认为端粒酶活性亦可见于某些良性增生疾病和炎性组织中[7]，其意义不明，但酶活性程度远较恶性肿瘤要弱得多。本组6例 良性增生性疾病患者中，有1例(乳房良性肿块)端粒酶阳性(16.7%)，且该患者端粒酶活性较高，是否为癌前期病变，尚待进一步研究证实，而在13例炎性包块及5例正常组织细胞中均未发现有端粒酶活性。
鉴于TRAP -银染法具有较好的敏感性和特异性，因此对影响端粒酶活性测定因素的排除显得尤为重要，诸如标本留取的质量、操作过程中RNA酶及扩增产物的污染等，均可直接影响实验结果的准确性。我们认为只要取材得当，实验操作规范，该法用于端粒酶活性测定对临床恶性肿瘤的诊断具有良好的应用前景。■
作者简介：虞伟(1967-),男,安徽望江人,主管技师,医学博士研究生,从事临床免疫学研究与实验诊断专业
, 百拇医药
参考文献：
[1]Albanell J, Han W, Mellado B et al. Telomerase activity is repressed during differentitation of maturation-sentiative but not resistant human tumor cell lines[J]. Cancer Res,1996, 56: 1503～1508.
[2]Bestilny LJ, Brown CB, Miura Y et al. Selective inhibition of telomerase during terminal differentiation of immortal cell lines[J]. Cancer Res,1996, 56: 3796～3802.
[3]Kim NW,Piatyszek MA, Prowse KR et al. Specific association of human telomerase activaty with immortal cells and cancer[J]. Science,1994, 226: 2011.
, 百拇医药
[4]Greider CW, Blackburn EH. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity[J]. Cell,1987, 57: 887～898.
[5]Klimstra D,Venkatraman E,Moore MA et al. High telomerase activity in primary lung cancers: association with increased cell proliferation rates and advanced patholojic stage[J]. J Natl Cancer Inst,1997, 809: 1609～1615.
[6]Yashima K, Litzky LA, Kaiser L et al. Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas[J]. Cancer Res,1997, 57: 2373～2377.
[7]Ueda M, Ouhtit A, Bito T et al. Evidence for UV-associated activation of telomerase in human skin[J]. Cancer Res,1997, 57: 370.
收稿日期：1999-07-16, http://www.100md.com
单位：虞伟(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；谈华(南京市儿童医院检验科)；武建国(南京军区南京总医院解放军医学检验中心，江苏南京 210002)；季洪爱(南京总医院病理科)
关键词：端粒酶；端粒重复序列扩增-银染色；肿瘤
医学研究生学报000209摘 要：目的：建立端粒重复序列扩增(TRAP)- 银染色技术，探讨端粒酶活性检测在肿瘤诊断中的意义。方法：用裂解液提取组织细胞中的端粒酶模板，在特异引物作用下进行PCR 扩增，所得产物用氯仿∶异戊醇(24∶1)处理浓缩，作聚丙稀酰胺凝胶垂直板电泳，经硝酸银染色分析端粒酶活性。结果：TRAP-银染色法能准确特异地检测小鼠骨髓瘤细胞(SP 2/0)的端粒酶活性，灵敏度可达 1×102个细胞。端粒酶阳性率在23例各种恶性肿瘤组织中为 86.9 % (20/23)，而在19例炎性包块与良性增生组织为5.3%(1/19)，5例正常组织中未发现有端粒酶活性。 结论：TRAP-银染色法简便快速、具有较好的测定敏感度与重复性，对临床恶性肿瘤疾病的诊断具有良好的应用前景。
, 百拇医药
分类号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1008-8199(2000)02-0096-03
Detection of telomerase activity using telomere repeat amplification protocol silver stain
YU Wei WU Jian-guo
(Center of Medical Laboratory Science Jinling Hospital, Nanjing 210002,Jiangsu,China)
TAN Hua
(Department of Pathology,Nanjing Childrens Hospital)
, 百拇医药
JI Hong-ai
(Department of Pathology,Jinling Hospital)
Abstract：Objectives:To establish a method of telomere repeat amplification protocol(TRAP)silver stain technique, and to investigate the significance of telomerase activity detection in tumor diagnosis. Methods:Telomerase template was extracted from tissues and cells by lysis buffer, PCR amplification was performed under specific primer elongation. After processed and enriched with chloroform∶isopentanol(24∶1),the PCR products were electrophoresed by vertical plate on 10% invariance polyacrylamide gel. Telomerase activity was analyzed using sliver nitrate nucleic acid gel stain. Results:Telomerase activity could be determined accurately and specifically by TRAP silver stain in mice myeloma cells, and the sensitivity of detection of this method was 1×102 cells. The positive rate of telomerase was 86.9%(20/23) of patients with various tumor tissues, and 5.3%(1/19) of patients with inflammation as well as benign proliferation tissues, while telomerase activity was not detected in 5 normal tissues. Conclusions:TRAP-silver stain proctocol is simple, rapid, sensitive and reproducible. It is applicable in the diagnosis of clinical malignant diseases.
, 百拇医药
Key words：Telomerase; TRAP-silver stain; Tumor▲
0 引言
端粒(telomere)是真核细胞生物染色体末端的特殊DNA-蛋白质结构，含有多个重复序列，人类为TTAGGG，这一结构在染色体复制及保持染色体稳定中起重要作用[1]。有证据表明，端粒DNA长度随着每次细胞分裂而逐渐缩短，与细胞的寿命密切相关[2]，而其本身的合成又依赖于端粒酶(telomerase)的活化。近年来，随着端粒长度与端粒酶活性研究的不断深入，其在肿瘤诊断乃至治疗中的地位日显突出。研究发现，在绝大多数的恶性肿瘤组织及100%的肿瘤细胞株中有高活性的端粒酶表达，而正常体细胞则不能检出端粒酶活性。因此，对组织或细胞中端粒酶活性检测具有重要意义。我们采用聚合酶链反应，先行端粒DNA扩增，所得产物再行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和染色，建立了端粒重复序列扩增(TRAP)-银染技术，对各类细胞穿刺标本及小鼠骨髓瘤细胞株 (SP 2/0) 端粒酶活性进行了检测，取得了较为满意的结果，现报告如下：
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 引物设计 按照Kim 法[3]合成一对引物(由中科院上海生物化学研究所合成)。TS引物：5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3；CX 引物：5-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3。
1.1.2 细胞 组织细胞均为细针穿刺标本，其中乳腺癌9例，甲状腺癌2例，远端转移癌6例，其他恶性肿瘤(包括口腔部和前额部恶性肿瘤)6例，炎性包块与良性增生组织19例，冻存于-70℃冰箱内待检。培养细胞为小鼠骨髓瘤细胞株(SP 2/0)本中心保存。
1.1.3 仪器 PCR扩增仪9600型 (美国Perkin Elmer公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 端粒酶模板制备 取收集的细胞标本于1.5 ml Eppendorf管中，用无菌等渗盐水洗涤后，离心弃上清，打散沉淀，加入预冷的裂解液[内含0.1 mmol/L PMSF，10 mmol/L Tris(pH 7.5)，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5%(W/V)CHASP，10%甘油(V/V)]20 μl，混匀，置4℃ 1 h，4℃ 1 000 g/min离心10 min，上清定蛋白量，用裂解液调浓度至30 μg/ml，于-20℃冻存备用。
1.2.2 PCR扩增 每份待检样本反应总量为50 μl，内含10×TARP缓冲液[内含Tris(pH 8.0)200 mmol/L，MgCl2 15 mmol/L,KCl 600 mmol/L，Tween-20 (0.05%), EGTA 10 mmol/L]5 μl，dNTP 1 μl (50 μmol/L)，Taq-DNA聚合酶0.5 μl(2 U)，T4g32蛋白0.2 μl(1 μg)，Ts引物1 μl (100 ng )，模板2 μl, 用DEPC灭菌水补足体积至49 μl，于PCR扩增仪上30℃保温20 min后，加入CX引物1 μl (100 ng )，然后94℃热变性45 s，50℃45 s退火，72℃60 s延伸, 共31个循环，最后于72℃延伸5 min。
, 百拇医药
1.2.3 PCR产物处理 于扩增后的PCR产物中加入氯仿∶异戊醇(24∶1)50 μl，混匀，10 000 g/min离心5 min，吸取上层液体置另一0.5 ml Eppendorf管中，加入3 mol/L醋酸钠5 μl和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置-20℃ 2 h，取出后于4℃，15 000 g/min离心20 min，弃上清，留沉淀气干，用DEPC灭菌水10 μl溶解。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 取上述PCR浓缩产物10 μl，加上样缓冲液5 μl，在电压180 V，10%不变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳50 min。
1.2.5 凝胶染色 电泳结束后，将凝胶取出置10% 乙醇固定5 min，再用1% 硝酸浸泡5 min，染色10 min(硝酸银染液)，最后于碳酸钠显色液呈色，待观察到全部条带显色，即用10%的冰乙酸终止反应，制膜保存。
2 结果
, 百拇医药
2.1 TRAP-银染法灵敏度与特异性 如图1所示，结果以出现5条以上间隔6个核苷酸的DNA片断梯度示有端粒酶活性(阳性)。用该法测定端粒酶阳性细胞株SP 2/0，可检测出1×102个细胞(裂解后定蛋白量为0.4 μg)的端粒酶活性，而用RNase A处理后的SP 2/0与正常组织细胞则显示端粒酶为阴性。
图1 体表肿块细针穿刺标本端粒酶测定结果
Figure 1 The result of telomerase activity in
fine-needle aspiration specimens from superficial tumors
1～4：mammary gland cancer；5：thyroideal cancer；
, 百拇医药
6：mammary gland epithelial cell proliferation；
7：lymphaden transfered cancer；8：tumor cell line SP 2/0
2.2 临床穿刺标本端粒酶测定结果 通过对23例各种恶性肿瘤组织检测，发现有20例显示有端粒酶活性，阳性率为86.9%;而在19例炎性包块与良性增生组织中亦有1例阳性(5.3%)，5例正常组织未发现有端粒酶活性(表1)。
表1 不同组织穿刺标本端粒酶测定结果
Table 1 The result of telomerase activity in
fine-needle aspiration specimens from various tissues Specimens origin
, http://www.100md.com
n
Positive number(%)
Mammary gland cancer
9
9(100)
Thyroidea cancer
2
2 (100)
Distant transfered cancer
6
4 (66.7)
, http://www.100md.com Other malignant tumor
6
5 (83.3)
Inflammation tumor
13
0 (0)
Benign proliferation tissue
6
1 (16.7)
Normal control
5
0 (0)
, 百拇医药
3 讨论
端粒酶是一种独特的DNA聚合酶，以其自身携带的RNA模板而区别于一般的纯蛋白逆转录酶，它的活性是在染色体末端不断添加端粒重复序列，以弥补因端粒的丢失而使细胞无限增殖。端粒酶因在人类细胞永生和致癌过程中起着至关重要的作用而成为肿瘤诊断的标志物。人们最早设计的检测端粒酶的方法是测定细胞提取物，将端粒重复片段加到一个合成的寡聚核苷酸引物的3末端，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物，然后进行放射自显影[4]，由于该法敏感度极低，现已被淘汰。目前，国外普遍采用的方法为端粒重复序列扩增(TRAP)同位素掺入标记(放射自显影)法，通过聚合酶链反应扩增酶促反应产物，极大地提高了实验的敏感性[3]，但因此法也同样存在有放射性污染、步骤繁琐、所需时间长等缺点，且价格昂贵，临床上推广应用受到一定限制。在此基础上，我们对该法进行了改良，建立了TRAP-银染测定法，取得了较为满意的效果。通过对肿瘤细胞株SP 2/0研究发现，可检测出1×102个细胞中的端粒酶活性。该法不仅保留了上述TRAP放射自显影技术敏感度高、特异性强等优点，而且还具有试剂稳定、来源方便、所需时间短(4 h即可出结果)和重复性好的特点。在对PCR扩增产物的预处理过程中，我们选用了氯仿∶异戊醇(24∶1)进行DNA抽提，以除去反应体系中的蛋白质，这样对改善后续电泳效果、减低背景呈色和拖尾现象的发生，特别是对组织块、骨髓和血样标本的检测效果更佳。
, 百拇医药
各种肿瘤组织端粒酶活性总体检出率为86.9%(20/23)，与文献报道的结果[5，6]相一致，其中有2例消化道恶性肿瘤远端组织(淋巴肿块穿刺)，病理诊断为转移性癌，但端粒酶结果为阴性。近年有文献报道认为端粒酶活性亦可见于某些良性增生疾病和炎性组织中[7]，其意义不明，但酶活性程度远较恶性肿瘤要弱得多。本组6例 良性增生性疾病患者中，有1例(乳房良性肿块)端粒酶阳性(16.7%)，且该患者端粒酶活性较高，是否为癌前期病变，尚待进一步研究证实，而在13例炎性包块及5例正常组织细胞中均未发现有端粒酶活性。
鉴于TRAP -银染法具有较好的敏感性和特异性，因此对影响端粒酶活性测定因素的排除显得尤为重要，诸如标本留取的质量、操作过程中RNA酶及扩增产物的污染等，均可直接影响实验结果的准确性。我们认为只要取材得当，实验操作规范，该法用于端粒酶活性测定对临床恶性肿瘤的诊断具有良好的应用前景。■
作者简介：虞伟(1967-),男,安徽望江人,主管技师,医学博士研究生,从事临床免疫学研究与实验诊断专业
, 百拇医药
参考文献：
[1]Albanell J, Han W, Mellado B et al. Telomerase activity is repressed during differentitation of maturation-sentiative but not resistant human tumor cell lines[J]. Cancer Res,1996, 56: 1503～1508.
[2]Bestilny LJ, Brown CB, Miura Y et al. Selective inhibition of telomerase during terminal differentiation of immortal cell lines[J]. Cancer Res,1996, 56: 3796～3802.
[3]Kim NW,Piatyszek MA, Prowse KR et al. Specific association of human telomerase activaty with immortal cells and cancer[J]. Science,1994, 226: 2011.
, 百拇医药
[4]Greider CW, Blackburn EH. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity[J]. Cell,1987, 57: 887～898.
[5]Klimstra D,Venkatraman E,Moore MA et al. High telomerase activity in primary lung cancers: association with increased cell proliferation rates and advanced patholojic stage[J]. J Natl Cancer Inst,1997, 809: 1609～1615.
[6]Yashima K, Litzky LA, Kaiser L et al. Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas[J]. Cancer Res,1997, 57: 2373～2377.
[7]Ueda M, Ouhtit A, Bito T et al. Evidence for UV-associated activation of telomerase in human skin[J]. Cancer Res,1997, 57: 370.
收稿日期：1999-07-16, http://www.100md.com