SCID小鼠体内人体肿瘤移植及其人体免疫功能重建
作者：王顺和 郑杰 付坚 由江峰 崔湘霖 王洁良 吴秉铨
单位：100083 北京医科大学病理系[王顺和(400046重庆医科大学病理学教研室)、郑杰、付坚、由江峰、崔湘霖、王洁良、吴秉铨]
关键词：小鼠，SCID；肿瘤移植；免疫法，被动
中华病理学杂志980211 【摘要】 目的 观察高转移性人肺巨细胞癌系(PG)及转染了白细胞介素-6基因的PG细胞(PGTS7)在SCID小鼠及免疫重建SCID小鼠体内的生长及转移行为，阐明PGTS7自分泌的白细胞介素-6增强人体免疫的抗肿瘤作用。方法 皮下移植人体肿瘤，部分受体鼠同时经腹腔注射人体外周血淋巴细胞。观察成瘤潜伏期、成瘤率、生长速度、体积、肺及淋巴结转移率和小鼠血清中人体免疫球蛋白(HIg)的含量。结果 全部动物见肿瘤生长，但PGTS7在免疫重建鼠体内成瘤潜伏期延长，肿瘤体积小、淋巴结转移率低，而血清中HIg含量高。结论 (1) SCID小鼠亦为研究PG及PGTS7生长及转移的良好动物。(2) PGTS7自分泌白细胞介素-6能刺激小鼠体内人淋巴细胞增殖、活化，增加HIg的产生，降低肿瘤生长及淋巴结转移。
, 百拇医药
Human tumor xenografted into SCID mice and human immune function reconstitution Wang Shunhe, Zheng Jie, Fu Jian, et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing, 100083
【Abstract】 Objective In order to observe (1) The behavior of growth and metastasis of PG and PGPTS7 in SCID mice and human immune function reconstituted mice; (2) The ability of interlukin-6 autosecreted from PGTS7 in enhancing the anti-tumor activity of the peripheral blood lymphocytes (PBL). Methods Xenografting of PG and PGTS7 into the subepithelial space of the SCID mice, and in some of these animals, human PBL were administrated simultaneously into the peritoneal cavities. The latent period, taken rate, growth speed, volume of the grafted tumor, incidences of metastasis in lungs and lymph nodes and serum level of human immunoglobulin of the immunity reconstitued mice were examined. Results Although tumor growth had been detected in all the experimental animals, the latent period of grafted PGTS7 was postponed and the volume of tumor mass as well as the incidence of lymph node metastasis all became lower in the immunity reconstituted mice accompanied simultaneously with a higher serum level of human immunoglobulin (HIg). Conclusions (1) The SCID mice are good as an appropriated hosts in studying the hebavior of growth and metastasis of PG and PGTS7. (2) IL-6 autosecreted from PGTS7 stimulates the proliferation and promotes the activating of PBL. It seems also able to enhance the liberation of human immunoglobulin: to supress the growth of tumor cells and to reduced the rate of lymph node metastasis.
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【Key words】 Mice, SCID Neoplasm transplantation Immunization, passive
随着分子生物学、肿瘤免疫学的日益发展，肿瘤的免疫学治疗成为当前发展较快的治疗方法。然而机体内部的抗肿瘤免疫是十分复杂的，如何调动机体的免疫反应，增加机体的抗肿瘤作用是免疫治疗的中心环节。我们利用严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠及人体外周血淋巴细胞(periphery blood lymphocyte，PBL)重建的SCID小鼠[1]研究高转移性人肺巨细胞癌系(PG)[2]及转染了白细胞介素-6(IL-6)基因的PG细胞(PGTS7)在其体内的生长、转移、以及人体免疫细胞在PGTS7分泌IL-6的作用下对肿瘤生长、转移的影响。
材料与方法
1.SCID小鼠来源及饲养：4～5周龄C.B-17SCID/SCID小鼠购自中国药品和生物制品检定所。饲养在无特定病原体环境中。饲料、饮水及垫料均经高压灭菌处理。实验所有操作均在超净工作台内进行。
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2.细胞系：PG及转染IL-6基因并能自分泌IL-6的PG细胞(PGTS7)均为本室建立及长期维持。以上两细胞系均用RPMI 1640加10%热灭活小牛血清在 37℃、5% CO2孵育箱内培养。
3.人体PBL的分离：用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)人体淋巴细胞分离液(比重为1.077)按常规方法分离。
4.实验分组、肿瘤移植及免疫重建：将PG及PGTS7细胞先常规接种于裸鼠体内，待其分别长出实体瘤，然后分别移植实体瘤组织块于SCID小鼠体内。12只合格SCID小鼠随机分为三组。第一组：背部皮下仅移植PG细胞组织块(2mm×1mm×1mm)；第二组：背部皮下移植同体积PG肿瘤，同时经腹腔注射4×107个PBL；第三组：背部皮下移植同体积PGTS7细胞组织块 ，同时经腹腔注射4×107个PBL。
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5.免疫重建小鼠血清中人体免疫球蛋白的测定：采用ELISA方法常规测定。
6.组织形态学检查：测定皮下移植瘤最长径(a)及垂直径(b)，按公式V=π/6ab2计算肿瘤相对体积。取全部淋巴结及内脏常规固定，切片，光镜检查。其中肺及淋巴结全部包埋，分段留取连续切片，每个蜡块不少于10张切片。
7.统计学处理：采用t检验及四格表确切概率法对数据进行统计学处理。
结果
1.成瘤潜伏期、成瘤率：PG细胞组织块接种在SCID小鼠及免疫重建小鼠体内7～10天可见肿瘤生长，而PGTS7细胞组织块接种在免疫重建小鼠体内后需10～14天方可成瘤。观察4周统一处死动物，所有移植肿瘤的动物均见肿瘤生长。
2.组织形态学检查结果：所有动物皮下移植瘤均呈椭圆形或圆形，包膜不完整。以PG细胞组织块组移植瘤较大，且侵袭至双前肢近端、颈部及纵隔内。颈部、腋深部及腋后浅三组淋巴结因肿瘤转移而肿大。镜下见癌转移淋巴结结构破坏，癌细胞形态同皮下移植瘤(图1)。三组动物中，PGTS7细胞组织块在免疫重建小鼠体内体积最小，淋巴结转移率最低，与另外两组相比有显著性差异。三组动物均见肺转移(图2)，但其转移率无显著性差异。
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图1 PG细胞转移的SCID小鼠淋巴结 HE×200
图2 PG细胞转移到SCID小鼠肺内 HE×200
3.免疫重建小鼠血清中人体免疫球蛋白测定结果：移植PG细胞组织块的免疫重建小鼠血清中人体免疫球蛋白含量为0.235 mg/ml，而移植PGTS7细胞组织块的免疫重建小鼠血清中其含量为0.663 mg/ml。经统计学检验两者差异有显著性。
讨论
SCID小鼠体内无功能性T淋巴细胞及B淋巴细胞[3]。我们将PG及PGTS7细胞移植到SCID小鼠，所有动物均见肿瘤生长，其移植成功率为100%，并显示肿瘤细胞的侵袭及转移，表明SCID小鼠亦为研究PG及PGTS7细胞的良好模型。这种小鼠还可接受人体免疫系统如外周血淋巴细胞移植而不发生免疫排斥反应，且淋巴细胞可在其体内生长并执行功能[4]。将肿瘤组织和免疫细胞同时移植到SCID小鼠体内为研究机体抗肿瘤免疫提供了一个理想的动物模型。利用该种模型，Mueller等人[5]研究了PBL对黑色素瘤细胞系M24met生长及转移的影响，结果显示PBL对皮下移植瘤的生长无明显影响，却具有抑制肿瘤细胞淋巴结及肺转移的作用，但这种作用因为PBL功能发挥不强而受到限制。
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我们的实验中，经腹腔注射的PBL在SCID小鼠体内能成活并具备产生HIg的功能。对其体内移植的PG细胞的生长及转移无明显影响，但可延长其体内PGTS7细胞的成瘤潜伏期、降低肿瘤体积及淋巴结转移率；同时血清中人体免疫球蛋白的含量较高，表明该组动物体内PBL发挥了较强的功能。PGTS7在体外培养及裸鼠体内均能分泌大量IL-6。而IL-6是一种典型的多功能细胞因子[6]，可诱导B淋巴细胞的分化及产生免疫球蛋白；使T细胞活化并促使活化T细胞增殖；促使细胞毒淋巴细胞的产生以及增强人体外周血NK细胞的杀瘤活性。IL-6亦具有抗肿瘤转移的作用，这种作用依赖活化 T细胞的介导[7]。PBL在SCID小鼠体内具有延长PGTS7细胞成瘤潜伏期、降低肿瘤平均体积及降低淋巴结转移率，可能与其体内的PGTS7细胞分泌大量IL-6，作用于PBL使免疫细胞增殖、活化而加强其抗肿瘤生长及降低淋巴结转移的作用。
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本课题受美国中华医学基金资助
参考文献
1 Greenwood JD. Xenogeneic PBL-scid mice: their potential and current limitations. Lab Ani Sci, 1993, 43：151-155.
2 吴秉铨，孙毓恺，郑杰，等.裸鼠体内建立的人类高转移癌系.中华肿瘤杂志，1985，7：324-328.
3 Williams SS, Alosco TR, Anne Croy B, et al. The study of human neoplastic disease in severe combined immunodeficient mice. Lab Ani Sci, 1993, 43：139-146.
, 百拇医药
4 Mosier DE, Gulizia RJ, Baird SM, et al. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficient mice. Nature, 1988, 335：256-259.
5 Mueller BM, Reisfeld RA.Potential of the scid mouse as a host for human tumors. Cancer Met Rev, 1991, 10：193-200.
6 Sporn MB, Roberts AB. Peptide growth factors are multifunctional. Nature, 1988, 332：217-219.
7 Mule JJ, Custer MC, Travis WD, et al. Cellular mechanisms of the antitumor activity of recombinant IL-6 in mice. J Immunol, 1992, 148：2622-2629.
(收稿：1997-03-10 修回：1997-11-11), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学病理系[王顺和(400046重庆医科大学病理学教研室)、郑杰、付坚、由江峰、崔湘霖、王洁良、吴秉铨]
关键词：小鼠，SCID；肿瘤移植；免疫法，被动
中华病理学杂志980211 【摘要】 目的 观察高转移性人肺巨细胞癌系(PG)及转染了白细胞介素-6基因的PG细胞(PGTS7)在SCID小鼠及免疫重建SCID小鼠体内的生长及转移行为，阐明PGTS7自分泌的白细胞介素-6增强人体免疫的抗肿瘤作用。方法 皮下移植人体肿瘤，部分受体鼠同时经腹腔注射人体外周血淋巴细胞。观察成瘤潜伏期、成瘤率、生长速度、体积、肺及淋巴结转移率和小鼠血清中人体免疫球蛋白(HIg)的含量。结果 全部动物见肿瘤生长，但PGTS7在免疫重建鼠体内成瘤潜伏期延长，肿瘤体积小、淋巴结转移率低，而血清中HIg含量高。结论 (1) SCID小鼠亦为研究PG及PGTS7生长及转移的良好动物。(2) PGTS7自分泌白细胞介素-6能刺激小鼠体内人淋巴细胞增殖、活化，增加HIg的产生，降低肿瘤生长及淋巴结转移。
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Human tumor xenografted into SCID mice and human immune function reconstitution Wang Shunhe, Zheng Jie, Fu Jian, et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing, 100083
【Abstract】 Objective In order to observe (1) The behavior of growth and metastasis of PG and PGPTS7 in SCID mice and human immune function reconstituted mice; (2) The ability of interlukin-6 autosecreted from PGTS7 in enhancing the anti-tumor activity of the peripheral blood lymphocytes (PBL). Methods Xenografting of PG and PGTS7 into the subepithelial space of the SCID mice, and in some of these animals, human PBL were administrated simultaneously into the peritoneal cavities. The latent period, taken rate, growth speed, volume of the grafted tumor, incidences of metastasis in lungs and lymph nodes and serum level of human immunoglobulin of the immunity reconstitued mice were examined. Results Although tumor growth had been detected in all the experimental animals, the latent period of grafted PGTS7 was postponed and the volume of tumor mass as well as the incidence of lymph node metastasis all became lower in the immunity reconstituted mice accompanied simultaneously with a higher serum level of human immunoglobulin (HIg). Conclusions (1) The SCID mice are good as an appropriated hosts in studying the hebavior of growth and metastasis of PG and PGTS7. (2) IL-6 autosecreted from PGTS7 stimulates the proliferation and promotes the activating of PBL. It seems also able to enhance the liberation of human immunoglobulin: to supress the growth of tumor cells and to reduced the rate of lymph node metastasis.
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【Key words】 Mice, SCID Neoplasm transplantation Immunization, passive
随着分子生物学、肿瘤免疫学的日益发展，肿瘤的免疫学治疗成为当前发展较快的治疗方法。然而机体内部的抗肿瘤免疫是十分复杂的，如何调动机体的免疫反应，增加机体的抗肿瘤作用是免疫治疗的中心环节。我们利用严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠及人体外周血淋巴细胞(periphery blood lymphocyte，PBL)重建的SCID小鼠[1]研究高转移性人肺巨细胞癌系(PG)[2]及转染了白细胞介素-6(IL-6)基因的PG细胞(PGTS7)在其体内的生长、转移、以及人体免疫细胞在PGTS7分泌IL-6的作用下对肿瘤生长、转移的影响。
材料与方法
1.SCID小鼠来源及饲养：4～5周龄C.B-17SCID/SCID小鼠购自中国药品和生物制品检定所。饲养在无特定病原体环境中。饲料、饮水及垫料均经高压灭菌处理。实验所有操作均在超净工作台内进行。
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2.细胞系：PG及转染IL-6基因并能自分泌IL-6的PG细胞(PGTS7)均为本室建立及长期维持。以上两细胞系均用RPMI 1640加10%热灭活小牛血清在 37℃、5% CO2孵育箱内培养。
3.人体PBL的分离：用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)人体淋巴细胞分离液(比重为1.077)按常规方法分离。
4.实验分组、肿瘤移植及免疫重建：将PG及PGTS7细胞先常规接种于裸鼠体内，待其分别长出实体瘤，然后分别移植实体瘤组织块于SCID小鼠体内。12只合格SCID小鼠随机分为三组。第一组：背部皮下仅移植PG细胞组织块(2mm×1mm×1mm)；第二组：背部皮下移植同体积PG肿瘤，同时经腹腔注射4×107个PBL；第三组：背部皮下移植同体积PGTS7细胞组织块 ，同时经腹腔注射4×107个PBL。
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5.免疫重建小鼠血清中人体免疫球蛋白的测定：采用ELISA方法常规测定。
6.组织形态学检查：测定皮下移植瘤最长径(a)及垂直径(b)，按公式V=π/6ab2计算肿瘤相对体积。取全部淋巴结及内脏常规固定，切片，光镜检查。其中肺及淋巴结全部包埋，分段留取连续切片，每个蜡块不少于10张切片。
7.统计学处理：采用t检验及四格表确切概率法对数据进行统计学处理。
结果
1.成瘤潜伏期、成瘤率：PG细胞组织块接种在SCID小鼠及免疫重建小鼠体内7～10天可见肿瘤生长，而PGTS7细胞组织块接种在免疫重建小鼠体内后需10～14天方可成瘤。观察4周统一处死动物，所有移植肿瘤的动物均见肿瘤生长。
2.组织形态学检查结果：所有动物皮下移植瘤均呈椭圆形或圆形，包膜不完整。以PG细胞组织块组移植瘤较大，且侵袭至双前肢近端、颈部及纵隔内。颈部、腋深部及腋后浅三组淋巴结因肿瘤转移而肿大。镜下见癌转移淋巴结结构破坏，癌细胞形态同皮下移植瘤(图1)。三组动物中，PGTS7细胞组织块在免疫重建小鼠体内体积最小，淋巴结转移率最低，与另外两组相比有显著性差异。三组动物均见肺转移(图2)，但其转移率无显著性差异。
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图1 PG细胞转移的SCID小鼠淋巴结 HE×200
图2 PG细胞转移到SCID小鼠肺内 HE×200
3.免疫重建小鼠血清中人体免疫球蛋白测定结果：移植PG细胞组织块的免疫重建小鼠血清中人体免疫球蛋白含量为0.235 mg/ml，而移植PGTS7细胞组织块的免疫重建小鼠血清中其含量为0.663 mg/ml。经统计学检验两者差异有显著性。
讨论
SCID小鼠体内无功能性T淋巴细胞及B淋巴细胞[3]。我们将PG及PGTS7细胞移植到SCID小鼠，所有动物均见肿瘤生长，其移植成功率为100%，并显示肿瘤细胞的侵袭及转移，表明SCID小鼠亦为研究PG及PGTS7细胞的良好模型。这种小鼠还可接受人体免疫系统如外周血淋巴细胞移植而不发生免疫排斥反应，且淋巴细胞可在其体内生长并执行功能[4]。将肿瘤组织和免疫细胞同时移植到SCID小鼠体内为研究机体抗肿瘤免疫提供了一个理想的动物模型。利用该种模型，Mueller等人[5]研究了PBL对黑色素瘤细胞系M24met生长及转移的影响，结果显示PBL对皮下移植瘤的生长无明显影响，却具有抑制肿瘤细胞淋巴结及肺转移的作用，但这种作用因为PBL功能发挥不强而受到限制。
, 百拇医药
我们的实验中，经腹腔注射的PBL在SCID小鼠体内能成活并具备产生HIg的功能。对其体内移植的PG细胞的生长及转移无明显影响，但可延长其体内PGTS7细胞的成瘤潜伏期、降低肿瘤体积及淋巴结转移率；同时血清中人体免疫球蛋白的含量较高，表明该组动物体内PBL发挥了较强的功能。PGTS7在体外培养及裸鼠体内均能分泌大量IL-6。而IL-6是一种典型的多功能细胞因子[6]，可诱导B淋巴细胞的分化及产生免疫球蛋白；使T细胞活化并促使活化T细胞增殖；促使细胞毒淋巴细胞的产生以及增强人体外周血NK细胞的杀瘤活性。IL-6亦具有抗肿瘤转移的作用，这种作用依赖活化 T细胞的介导[7]。PBL在SCID小鼠体内具有延长PGTS7细胞成瘤潜伏期、降低肿瘤平均体积及降低淋巴结转移率，可能与其体内的PGTS7细胞分泌大量IL-6，作用于PBL使免疫细胞增殖、活化而加强其抗肿瘤生长及降低淋巴结转移的作用。
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本课题受美国中华医学基金资助
参考文献
1 Greenwood JD. Xenogeneic PBL-scid mice: their potential and current limitations. Lab Ani Sci, 1993, 43：151-155.
2 吴秉铨，孙毓恺，郑杰，等.裸鼠体内建立的人类高转移癌系.中华肿瘤杂志，1985，7：324-328.
3 Williams SS, Alosco TR, Anne Croy B, et al. The study of human neoplastic disease in severe combined immunodeficient mice. Lab Ani Sci, 1993, 43：139-146.
, 百拇医药
4 Mosier DE, Gulizia RJ, Baird SM, et al. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficient mice. Nature, 1988, 335：256-259.
5 Mueller BM, Reisfeld RA.Potential of the scid mouse as a host for human tumors. Cancer Met Rev, 1991, 10：193-200.
6 Sporn MB, Roberts AB. Peptide growth factors are multifunctional. Nature, 1988, 332：217-219.
7 Mule JJ, Custer MC, Travis WD, et al. Cellular mechanisms of the antitumor activity of recombinant IL-6 in mice. J Immunol, 1992, 148：2622-2629.
(收稿：1997-03-10 修回：1997-11-11), 百拇医药