YY1蛋白对HPV16启动子P97的抑制效应依赖于上游的增强子序列
作者：董小平 周伟 赵同兴 刘红
单位：董小平 周伟 赵同兴(中国预防医学科学院病毒学研究所)；刘红(首都医科大学附属北京口腔医院)
关键词：人乳头瘤病毒；YY1蛋白；增强子
中华微生物学和免疫学杂志000530 【 摘要 】 目的 观测位于HPV16 LCR序列YY1结合位点上游的组织特异性增强子序列对YY1蛋白的启动子P97抑制作用的影响。 方法 构建带有不同长度的HPV16野生株、启动子远端YY1位点突变株、启动子近端YY1位点突变株的5′端LCR缺损序列的荧光素酶报导质粒，以及不同长度的近端YY1/SP1重叠结合位点基因工程突变LCR的荧光素酶报导质粒；将各种质粒转染到人类子宫颈癌细胞系C33A中，检测在不同LCR序列的控制下对病毒启动子P97的活性的影响。 结果 去除上游增强子序列后，远端YY1位点突变的P97激活作用完全消失，近端YY1位点突变的P97激活作用部分丧失。不同长度的近端YY1/SP1重叠位点基因工程突变LCR对P97活性的影响不受上游启动子序列的控制。 结论 YY1蛋白对启动子P97的抑制效应受位于其上游序列的增强子的控制。
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YY1′s repression effect on HPV16 promoter P97 depends on the upstream enhancer sequences
DONG Xiaoping, LIU Hong, ZHOU Wei, et al.
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100052 ,P.R.China)
【 Abstract 】 Objective Observation of the possible effect of the upstream enhancer sequences on the YY1′s repression activity on HPV 16 promoter P97. Methods Different 5′-deletions of LCR containing HPV 16 wild-type, promoter-distal YY1 binding site mutant and promoter-proximal YY1 binding site mutant sequences were generated in a luciferase reporter plasmid respectively. Meanwhile, 5′-deletions of LCR which contain a genetic engineering nucleotides exchange within the overlapping YY1/SP1 binding domain were also constructed. Different plasmid DNAs were transfected into a cervical carcinoma cell line C33A and the influences on P97 activity were evaluated by measuring expressions of luciferase. Results With removing the enhancer sequences, the activating effect on P97 by the distal-site mutant was totally silent, while that by proximal-site mutant was partially reduced. The mutants involved in the overlapping YY1/SP1 site showed little effect on P97, regardless of the length of LCR. Conclusion YY1′s repression effects on P97 through bridging these two binding sites depend on the intact upstream enhancer.
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【 Subject words 】 Human papillomavirus; YY1 protein; Enhancer
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型的长控制区(long control region，LCR)为病毒基因转录的重要调节区域。在LCR中部有一组织特异性增强子区域，可在上皮细胞内增强病毒早期启动子P97的活性。增强子是由许多转录激活因子的特异性结合位点组成，其中包括有AP1、NF1、Oct1、TEFⅠ等〔1〕。细胞转录调节蛋白YY1广泛存在于上皮细胞胞核内〔2〕，对P97的活性起负性调节作用〔3-5〕。YY1蛋白可通过多种方式对不同的启动子活性进行正相或负相调节，其机理包括与其它活性蛋白发生蛋白-蛋白间相互作用〔6〕，与其它活性蛋白竞争性结合相应的结合位点〔7〕，通过蛋白与DNA结合引起DNA空间结构的改变〔8〕以及与其它非DNA结合活性蛋白作用后使后者作用于转录起始部位〔9〕。
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在HPV16 LCR序列上存在有多个YY1特异性结合位点，分布于增强子和启动子P97之间。由于增强子是由多个转录激活因子结合位点构成，因而有可能会参与YY1蛋白对P97的活性抑制作用。我们构建了不同的HPV16标准序列、启动子远端YY1位点和近端位点突变的5′端缺损LCR荧光素酶报道质粒，经转染细胞检测发现，在除去增强子后YY1结合位点突变引起的启动子活性增强效应明显减弱或消失。这表明YY1蛋白对P97的调节作用有赖于上游的增强子序列。
材料与方法
质粒构建：所有构建的检测质粒均以pAluc〔3〕为基本骨架，插入序列均经DNA序列测定证实。质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004的构建如前文所叙述〔3,4〕。pH16-7463，pPM-D-7463和pPM-P-7463构建如下：以SphⅠ分别水解克隆在pBS M13+的HPV原毒株LCR序列(pBS-H16)〔3,4〕，启动子远端YY1蛋白结合位点点突变的HPV16 LCR序列(pT-390)〔4〕，启动子近端YY1结合位点点突变LCR序列(pT-432)〔3〕，除去HPV16 nt 7004～7462间的LCR序列，自身环化连接；以HindⅢ+BamHⅠ分别游离克隆的LCR序列(nt 7463～123)，回收后分别连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7463，pPM-D-7463和pPM-P-7463。
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质粒pH16-7612，pPM-D-7612和pPM-P-7612构建如下：分别以质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004为模板，H16-7612(5′-CTGCACTATGTGCAACTA-3′)和H16-123〔3,4〕为引物进行PCR扩增；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7612，pPM-D-7612和pPM-P-7612。
质粒pH16-7759，pPM-D-7759和pPM-P-7759构建如下：分别以质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004为模板，H16-7759(5′-CTTCTAAGGCCAACTAAATGT-3′，)和H16-123为引物进行PCR扩增；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7759，pPM-D-7759和pPM-P-7759。
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质粒pH16-7843，pPM-P-7843 和pC-7843构建如下：分别以质粒pH16-7004和pPM-pro-7004为模板，H16-7843(5′-ACTGCACATGGGTGTGTGCAAACCGTTTT
GGGGT-3′)和H16-123以及T432-7843(5′-ACTGCACGTGGGTGTGTGCAAACCGTTTTGGGGT-3′)和H16-123为引物进行PCR扩增；以质粒pH16-7004为模板，C-7843(5′- ACTGCACGCTACTGTGTGCAAACCGTT
TTGGGGT-3′)和H16-123为引物进行PCR扩增(划线部分为突变核苷酸)；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7843，pPM-P-7843和pC-7843。
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质粒pC-7004构建如下：采用PCR定位突变法以质粒pBS-H16-7004为模板，第一部分引物为reverse引物(5′-AACAGCTATGACCATG-3′，pBS M13+序列)和H16-LS (5′-TTTACAAATGAACAATGTATG-3′)；第二部分引物为C-7836M和13-20 (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′，pBS M13+序列)。PCR产物分别经HindⅢ(第一部分)和BamHⅠ(第二部分)水解后插入到pUC-19相应位点，进一步亚克隆至pAluc上。质粒pC-7463构建如下：以SphⅠ水解克隆在pUC-19上的pC-7004插入片段，除去HPV16 nt 7004～7462 间的LCR序列，自身环化连接；以HindⅢ+BamHⅠ分别游离克隆的LCR序列(nt 7463～123)，回收后分别连接至pAluc的相应位点构成质粒pC-7463。
细胞培养及转染：子宫颈癌细胞系C33a在含10%小牛血清的DMEM培养液中生长。细胞转染采用磷酸钙法〔3〕，2μg质粒DNA，0.5μg pRSV-β-gal DNA与250mmol/L CaCl2，1×HBS缓冲液(280mmol/L NaCl, 10mmol/L KCl, 1.5mmol/L Na2HPO4, 50mmol/L HEPES)室温作用20min。将作用后的DNA滴加至60mm约(70～80)%生长丰度的单层细胞培养皿中。次日PBS洗后换液。转染48h后收集细胞，经4次反复冻融，离心收集上清。
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荧光素酶(luciferase)检测：取10μl转染细胞提取物加至100μl测定液(0.1mmol/L K2PO4, 15mmol/L MgSO3, 50mg/ml ATP)在荧光素酶测定仪内与10ng D-luciferin (Boeringer公司产品)反应10s，自动测定荧光素酶数值。取20μl细胞提取物与30μl 0.4μg/ml ONPG (Sigma公司产品)37℃作用1h，420nm测定的A值为β-gal表达数值。荧光素酶表达值为荧光素酶值与β-gal值之比。
结果
YY1蛋白可同多种细胞及病毒活性因子发生分子间相互作用，从而影响甚至改变其生物学效应。在HPV16 LCR序列上位于YY1结合位点上游的组织特异性增强子包括了许多转录增强因子的结合位点。为了观测增强子是否影响YY1蛋白对启动子P97活性的抑制效应，我们构建了不同长度的HPV16野毒株和突变株LCR荧光素酶报道基因质粒(图1)。7004系列为HPV16全长LCR序列，7643系列的LCR序列起始于增强子的起始端，7612系列起始于增强子的中部，7759系列的LCR序列去除了全部增强子区域，7836系列仅带有一个启动子近端的YY1位点。
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图1 不同5′-端缺损LCR质粒在HPV16 LCR序列上的位置
Fig 1. Position of different 5′-deleted LCR plasmids in HPV16 LCR
The numbers of the initiating nucleotide of plasmids in HPV16 LCR were marked on the left, D-YY1 represents the promoter-distal YY1 binding site, P-YY1 represents the promoter-proximal YY1 binding site
启动子远端YY1结合位点(nt7691～7699)上G→A的点突变(nt 7796)可使YY1蛋白的结合功能丧失，同时在细胞转染时使P97活性增加〔3,4〕。为了观测上游增强子对这一位点作用的影响，我们将带有不同5′端缺损LCR的荧光素酶报道质粒转染至HPV阴性子宫颈癌细胞系C33A中。图2显示在全长LCR序列的控制下(7004)，点突变可诱导3.2倍的P97活性增加，这一结果与在HT3细胞中的结果相似〔2-4〕。随着LCR序列的缩短，P97活性降低，同时点突变诱导的P97激活作用也随之减弱。在带有增强子近端部分序列的LCR控制下(7612)，点突变仅可诱导1.3倍的P97活性增加，而完全去除增强子(7759)YY1位点的突变对P97的活性几乎没有影响(图2， 表1)。这一结果提示，YY1蛋白通过结合至启动子远端YY1位点对P97起抑制作用，这一作用受上游增强子的影响。
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启动子近端YY1结合位点(nt 7840～7848)上A→G的点突变(nt 7843)使YY1蛋白体外结合功能丧失〔3〕。在全长LCR的控制下这一突变可诱导4.72倍的P97活性增强(图2，表1)。不同长度的LCR转染结果显示(图3)，突变诱导的P97活性增强效应也随着LCR序列的缩短而减弱。但与远端YY1位点不同，即使去除全部增强子序列这一点突变仍可诱导2倍以上的P97活性增加(图2、表1，7759和7836)。这一结果提示，YY1通过这一位点的P97抑制作用也受增强子的影响，同时还可能受其它因素的影响。
图2 不同5′端缺损HPV16 LCR荧光素酶质粒在C33A细胞中相对荧光素酶表达值
Fig 2. Relative luciferase expression values of different 5′-deleted HPV16 LCR luciferase reporter plasmids in C33A cells
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The standard error bars were referenced with the value of pH16-7004. Every luciferase expression value was averaged upon the results of three different transfections
表1 不同5′端缺损LCR序列控制下的P97活性
Table 1. X-folds of stimulated P97 activities under the control of different 5′-deleted LCRs Plasmid
nt 7004
nt 7463
nt 7612
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nt 7759
nt 7843
pH16
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
pPM-D
3.20
3.01
1.31
0.94
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-
pPM-P
4.72
3.72
1.57
2.12
2.31
pC
1.32
1.07
-
-
1.68
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X-folds of increased P97 activities induced by different LCRs are calculated by comparing with respective luciferase values of pH16
-： Represents not analyzed
图3 YY1蛋白阻碍启动子和增强子相互作用结构假说图
Fig 3. Hypothesis of repressive effect of YY1 on the interaction between P97 and enhancer
A: HPV16 wt LCR with YY1 binding capacity; B: HPV16 mutated LCR without YY1 binding capacity; C: Enhancer-deleted HPV16 wt LCR with YY1 binding capacity; D: Enhancer-deleted HPV16 mutated LCR without YY1 binding capacity
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讨论
我们以前发现在HPV16 LCR序列上还存在另一个SP1结合位点(nt 7842～7847)，这一位点与启动子近端YY1位点完全重叠，SP1和YY1蛋白可竞争性地结合至这一位点[Dong XP, Pfister H. Overlapping YY1 and aberrant SP1 binding sites proximal to the early promoter of human papillomavirus type 16. J Gen Virol (in press)]。同时我们还证实，nt 7843的A→G突变可明显增强SP1蛋白对这一位点的结合能力。为了观测启动子近端YY1位点突变在去除增强子后仍具有P97激活作用是否由于SP1结合作用，我们构建了在这一重叠结合位点突变的LCR荧光素酶报道质粒，原有的CATGG被GCTAC(nt 7842～78446)所置换。以前实验证明，这种5个核苷酸的置换同时破坏了SP1和YY1蛋白的结合作用〔3〕。转染结果显示，带有这种基因工程突变LCR诱导的P97活性与野毒株LCR基本相近，同时去除增强子后对突变LCR于启动子活性的调节作用无影响(图2，表1)。这一结果表明，破坏SP1和YY1对这一重叠位点的结合作用，可基本消除SP1的激活作用和YY1的抑制作用。序列上nt 7843的A→G突变在去除启动子后对P97仍有的激活作用可能是源于SP1蛋白结合能力的增强。
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YY1蛋白的转录调节作用可通过多条途径完成，在HPV18 LCR序列上存在有特殊的“开关”序列，它可逆转YY1对启动子P105活性的抑制作用〔10〕。我们曾对HPV16 LCR进行分析，结果未发现有类似功能区(另文待发表)。对位于YY1结合位点上游的组织特异性增强子的缺损突变研究证实，它的存在对YY1蛋白通过结合到启动子远端以及近端结合位点的P97抑制作用十分重要。病毒启动子调控区域内激活和抑制序列的分布，增强子和抑制子的相互作用保证了启动子在病毒生命周期中的正常功用。
自然发生的启动子近端和远端YY1结合位点突变对去除增强子序列虽都呈现出相似的作用，但近端位点突变仍保留部分的P97激活作用。这是由于在近端位点序列上还重叠存在着一个SP1结合位点，YY1和SP1相互竞争的DNA结合作用也是YY1对P97抑制作用的方式之一。 增强子序列包含了许多转录激活因子的结合位点，YY1蛋白也可同一些活性蛋白相互作用发挥转录调节功能。这一效应可能影响YY1蛋白对启动子P97的抑制作用，但由于能够结合到HPV 16增强子序列的活性蛋白很多，尚不能确定是与何种蛋白相互作用的结果。YY1蛋白的DNA空间构相改变也可能起重要作用，根据我们实验结果可以推测在正常情况时由于YY1蛋白的结合使增强子在空间位置上远离启动子，而YY1位点的突变使这一空间位阻作用消失，使增强子接近启动子部位，从而促进启动子的活性(图3)。一旦去除上游增强子序列，YY1的空间位阻效应消失，对P97的抑制作用也随之消失。
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基金项目：教育部回国人员基金资助项目
参考文献
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2，董小平, 刘红, Pfister H. 细胞转录调节因子YY1及其对人乳头瘤病毒16型早期启动子P97抑制效应广泛存在于人上皮细胞. 中华实验及临床病毒学杂志, 1998, 12:217-222.
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4，May M, Dong XP, Beyer Finkler E, et al. The E6-E7 promoter of extrochromosomal HPV 16 DNA in cervical cancers escapes from cellular repression by mutation of target sequences for YY1. EMBO J, 1994, 13:1460-1466.
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7，Lee TC, Shi Y, Schwarz RJ, et al. Displacement of BrdUrd-induced YY1 by serum response factor activates skeletal alpha-actin transcription in embryonic myoblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89, 9814-9818.
8，Klug J, Beato M. Binding of YY1 to a site overlapping a weak TATA box is essential for transcription from the uteroglobin promoter in endometrial cells. Mol Cell Biol, 1996, 16:6398-6407.
9，Pazin MJ, Kadonaga JT. What's up and down with histone deacetylation and transcription. Cell, 1997, 89:325-328.
10，Bauknecht T, Jundt F, Herr I, et al. A switch region determines the cell type-specific positive or negative action of YY1 on the activity of the human papillomavirus type 18 promoter. J Virol, 1995, 69:1-12.
(收稿日期：1999-03-19), http://www.100md.com
单位：董小平 周伟 赵同兴(中国预防医学科学院病毒学研究所)；刘红(首都医科大学附属北京口腔医院)
关键词：人乳头瘤病毒；YY1蛋白；增强子
中华微生物学和免疫学杂志000530 【 摘要 】 目的 观测位于HPV16 LCR序列YY1结合位点上游的组织特异性增强子序列对YY1蛋白的启动子P97抑制作用的影响。 方法 构建带有不同长度的HPV16野生株、启动子远端YY1位点突变株、启动子近端YY1位点突变株的5′端LCR缺损序列的荧光素酶报导质粒，以及不同长度的近端YY1/SP1重叠结合位点基因工程突变LCR的荧光素酶报导质粒；将各种质粒转染到人类子宫颈癌细胞系C33A中，检测在不同LCR序列的控制下对病毒启动子P97的活性的影响。 结果 去除上游增强子序列后，远端YY1位点突变的P97激活作用完全消失，近端YY1位点突变的P97激活作用部分丧失。不同长度的近端YY1/SP1重叠位点基因工程突变LCR对P97活性的影响不受上游启动子序列的控制。 结论 YY1蛋白对启动子P97的抑制效应受位于其上游序列的增强子的控制。
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YY1′s repression effect on HPV16 promoter P97 depends on the upstream enhancer sequences
DONG Xiaoping, LIU Hong, ZHOU Wei, et al.
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100052 ,P.R.China)
【 Abstract 】 Objective Observation of the possible effect of the upstream enhancer sequences on the YY1′s repression activity on HPV 16 promoter P97. Methods Different 5′-deletions of LCR containing HPV 16 wild-type, promoter-distal YY1 binding site mutant and promoter-proximal YY1 binding site mutant sequences were generated in a luciferase reporter plasmid respectively. Meanwhile, 5′-deletions of LCR which contain a genetic engineering nucleotides exchange within the overlapping YY1/SP1 binding domain were also constructed. Different plasmid DNAs were transfected into a cervical carcinoma cell line C33A and the influences on P97 activity were evaluated by measuring expressions of luciferase. Results With removing the enhancer sequences, the activating effect on P97 by the distal-site mutant was totally silent, while that by proximal-site mutant was partially reduced. The mutants involved in the overlapping YY1/SP1 site showed little effect on P97, regardless of the length of LCR. Conclusion YY1′s repression effects on P97 through bridging these two binding sites depend on the intact upstream enhancer.
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【 Subject words 】 Human papillomavirus; YY1 protein; Enhancer
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型的长控制区(long control region，LCR)为病毒基因转录的重要调节区域。在LCR中部有一组织特异性增强子区域，可在上皮细胞内增强病毒早期启动子P97的活性。增强子是由许多转录激活因子的特异性结合位点组成，其中包括有AP1、NF1、Oct1、TEFⅠ等〔1〕。细胞转录调节蛋白YY1广泛存在于上皮细胞胞核内〔2〕，对P97的活性起负性调节作用〔3-5〕。YY1蛋白可通过多种方式对不同的启动子活性进行正相或负相调节，其机理包括与其它活性蛋白发生蛋白-蛋白间相互作用〔6〕，与其它活性蛋白竞争性结合相应的结合位点〔7〕，通过蛋白与DNA结合引起DNA空间结构的改变〔8〕以及与其它非DNA结合活性蛋白作用后使后者作用于转录起始部位〔9〕。
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在HPV16 LCR序列上存在有多个YY1特异性结合位点，分布于增强子和启动子P97之间。由于增强子是由多个转录激活因子结合位点构成，因而有可能会参与YY1蛋白对P97的活性抑制作用。我们构建了不同的HPV16标准序列、启动子远端YY1位点和近端位点突变的5′端缺损LCR荧光素酶报道质粒，经转染细胞检测发现，在除去增强子后YY1结合位点突变引起的启动子活性增强效应明显减弱或消失。这表明YY1蛋白对P97的调节作用有赖于上游的增强子序列。
材料与方法
质粒构建：所有构建的检测质粒均以pAluc〔3〕为基本骨架，插入序列均经DNA序列测定证实。质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004的构建如前文所叙述〔3,4〕。pH16-7463，pPM-D-7463和pPM-P-7463构建如下：以SphⅠ分别水解克隆在pBS M13+的HPV原毒株LCR序列(pBS-H16)〔3,4〕，启动子远端YY1蛋白结合位点点突变的HPV16 LCR序列(pT-390)〔4〕，启动子近端YY1结合位点点突变LCR序列(pT-432)〔3〕，除去HPV16 nt 7004～7462间的LCR序列，自身环化连接；以HindⅢ+BamHⅠ分别游离克隆的LCR序列(nt 7463～123)，回收后分别连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7463，pPM-D-7463和pPM-P-7463。
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质粒pH16-7612，pPM-D-7612和pPM-P-7612构建如下：分别以质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004为模板，H16-7612(5′-CTGCACTATGTGCAACTA-3′)和H16-123〔3,4〕为引物进行PCR扩增；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7612，pPM-D-7612和pPM-P-7612。
质粒pH16-7759，pPM-D-7759和pPM-P-7759构建如下：分别以质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004为模板，H16-7759(5′-CTTCTAAGGCCAACTAAATGT-3′，)和H16-123为引物进行PCR扩增；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7759，pPM-D-7759和pPM-P-7759。
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质粒pH16-7843，pPM-P-7843 和pC-7843构建如下：分别以质粒pH16-7004和pPM-pro-7004为模板，H16-7843(5′-ACTGCACATGGGTGTGTGCAAACCGTTTT
GGGGT-3′)和H16-123以及T432-7843(5′-ACTGCACGTGGGTGTGTGCAAACCGTTTTGGGGT-3′)和H16-123为引物进行PCR扩增；以质粒pH16-7004为模板，C-7843(5′- ACTGCACGCTACTGTGTGCAAACCGTT
TTGGGGT-3′)和H16-123为引物进行PCR扩增(划线部分为突变核苷酸)；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7843，pPM-P-7843和pC-7843。
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质粒pC-7004构建如下：采用PCR定位突变法以质粒pBS-H16-7004为模板，第一部分引物为reverse引物(5′-AACAGCTATGACCATG-3′，pBS M13+序列)和H16-LS (5′-TTTACAAATGAACAATGTATG-3′)；第二部分引物为C-7836M和13-20 (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′，pBS M13+序列)。PCR产物分别经HindⅢ(第一部分)和BamHⅠ(第二部分)水解后插入到pUC-19相应位点，进一步亚克隆至pAluc上。质粒pC-7463构建如下：以SphⅠ水解克隆在pUC-19上的pC-7004插入片段，除去HPV16 nt 7004～7462 间的LCR序列，自身环化连接；以HindⅢ+BamHⅠ分别游离克隆的LCR序列(nt 7463～123)，回收后分别连接至pAluc的相应位点构成质粒pC-7463。
细胞培养及转染：子宫颈癌细胞系C33a在含10%小牛血清的DMEM培养液中生长。细胞转染采用磷酸钙法〔3〕，2μg质粒DNA，0.5μg pRSV-β-gal DNA与250mmol/L CaCl2，1×HBS缓冲液(280mmol/L NaCl, 10mmol/L KCl, 1.5mmol/L Na2HPO4, 50mmol/L HEPES)室温作用20min。将作用后的DNA滴加至60mm约(70～80)%生长丰度的单层细胞培养皿中。次日PBS洗后换液。转染48h后收集细胞，经4次反复冻融，离心收集上清。
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荧光素酶(luciferase)检测：取10μl转染细胞提取物加至100μl测定液(0.1mmol/L K2PO4, 15mmol/L MgSO3, 50mg/ml ATP)在荧光素酶测定仪内与10ng D-luciferin (Boeringer公司产品)反应10s，自动测定荧光素酶数值。取20μl细胞提取物与30μl 0.4μg/ml ONPG (Sigma公司产品)37℃作用1h，420nm测定的A值为β-gal表达数值。荧光素酶表达值为荧光素酶值与β-gal值之比。
结果
YY1蛋白可同多种细胞及病毒活性因子发生分子间相互作用，从而影响甚至改变其生物学效应。在HPV16 LCR序列上位于YY1结合位点上游的组织特异性增强子包括了许多转录增强因子的结合位点。为了观测增强子是否影响YY1蛋白对启动子P97活性的抑制效应，我们构建了不同长度的HPV16野毒株和突变株LCR荧光素酶报道基因质粒(图1)。7004系列为HPV16全长LCR序列，7643系列的LCR序列起始于增强子的起始端，7612系列起始于增强子的中部，7759系列的LCR序列去除了全部增强子区域，7836系列仅带有一个启动子近端的YY1位点。
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图1 不同5′-端缺损LCR质粒在HPV16 LCR序列上的位置
Fig 1. Position of different 5′-deleted LCR plasmids in HPV16 LCR
The numbers of the initiating nucleotide of plasmids in HPV16 LCR were marked on the left, D-YY1 represents the promoter-distal YY1 binding site, P-YY1 represents the promoter-proximal YY1 binding site
启动子远端YY1结合位点(nt7691～7699)上G→A的点突变(nt 7796)可使YY1蛋白的结合功能丧失，同时在细胞转染时使P97活性增加〔3,4〕。为了观测上游增强子对这一位点作用的影响，我们将带有不同5′端缺损LCR的荧光素酶报道质粒转染至HPV阴性子宫颈癌细胞系C33A中。图2显示在全长LCR序列的控制下(7004)，点突变可诱导3.2倍的P97活性增加，这一结果与在HT3细胞中的结果相似〔2-4〕。随着LCR序列的缩短，P97活性降低，同时点突变诱导的P97激活作用也随之减弱。在带有增强子近端部分序列的LCR控制下(7612)，点突变仅可诱导1.3倍的P97活性增加，而完全去除增强子(7759)YY1位点的突变对P97的活性几乎没有影响(图2， 表1)。这一结果提示，YY1蛋白通过结合至启动子远端YY1位点对P97起抑制作用，这一作用受上游增强子的影响。
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启动子近端YY1结合位点(nt 7840～7848)上A→G的点突变(nt 7843)使YY1蛋白体外结合功能丧失〔3〕。在全长LCR的控制下这一突变可诱导4.72倍的P97活性增强(图2，表1)。不同长度的LCR转染结果显示(图3)，突变诱导的P97活性增强效应也随着LCR序列的缩短而减弱。但与远端YY1位点不同，即使去除全部增强子序列这一点突变仍可诱导2倍以上的P97活性增加(图2、表1，7759和7836)。这一结果提示，YY1通过这一位点的P97抑制作用也受增强子的影响，同时还可能受其它因素的影响。
图2 不同5′端缺损HPV16 LCR荧光素酶质粒在C33A细胞中相对荧光素酶表达值
Fig 2. Relative luciferase expression values of different 5′-deleted HPV16 LCR luciferase reporter plasmids in C33A cells
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The standard error bars were referenced with the value of pH16-7004. Every luciferase expression value was averaged upon the results of three different transfections
表1 不同5′端缺损LCR序列控制下的P97活性
Table 1. X-folds of stimulated P97 activities under the control of different 5′-deleted LCRs Plasmid
nt 7004
nt 7463
nt 7612
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nt 7759
nt 7843
pH16
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
pPM-D
3.20
3.01
1.31
0.94
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-
pPM-P
4.72
3.72
1.57
2.12
2.31
pC
1.32
1.07
-
-
1.68
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X-folds of increased P97 activities induced by different LCRs are calculated by comparing with respective luciferase values of pH16
-： Represents not analyzed
图3 YY1蛋白阻碍启动子和增强子相互作用结构假说图
Fig 3. Hypothesis of repressive effect of YY1 on the interaction between P97 and enhancer
A: HPV16 wt LCR with YY1 binding capacity; B: HPV16 mutated LCR without YY1 binding capacity; C: Enhancer-deleted HPV16 wt LCR with YY1 binding capacity; D: Enhancer-deleted HPV16 mutated LCR without YY1 binding capacity
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讨论
我们以前发现在HPV16 LCR序列上还存在另一个SP1结合位点(nt 7842～7847)，这一位点与启动子近端YY1位点完全重叠，SP1和YY1蛋白可竞争性地结合至这一位点[Dong XP, Pfister H. Overlapping YY1 and aberrant SP1 binding sites proximal to the early promoter of human papillomavirus type 16. J Gen Virol (in press)]。同时我们还证实，nt 7843的A→G突变可明显增强SP1蛋白对这一位点的结合能力。为了观测启动子近端YY1位点突变在去除增强子后仍具有P97激活作用是否由于SP1结合作用，我们构建了在这一重叠结合位点突变的LCR荧光素酶报道质粒，原有的CATGG被GCTAC(nt 7842～78446)所置换。以前实验证明，这种5个核苷酸的置换同时破坏了SP1和YY1蛋白的结合作用〔3〕。转染结果显示，带有这种基因工程突变LCR诱导的P97活性与野毒株LCR基本相近，同时去除增强子后对突变LCR于启动子活性的调节作用无影响(图2，表1)。这一结果表明，破坏SP1和YY1对这一重叠位点的结合作用，可基本消除SP1的激活作用和YY1的抑制作用。序列上nt 7843的A→G突变在去除启动子后对P97仍有的激活作用可能是源于SP1蛋白结合能力的增强。
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YY1蛋白的转录调节作用可通过多条途径完成，在HPV18 LCR序列上存在有特殊的“开关”序列，它可逆转YY1对启动子P105活性的抑制作用〔10〕。我们曾对HPV16 LCR进行分析，结果未发现有类似功能区(另文待发表)。对位于YY1结合位点上游的组织特异性增强子的缺损突变研究证实，它的存在对YY1蛋白通过结合到启动子远端以及近端结合位点的P97抑制作用十分重要。病毒启动子调控区域内激活和抑制序列的分布，增强子和抑制子的相互作用保证了启动子在病毒生命周期中的正常功用。
自然发生的启动子近端和远端YY1结合位点突变对去除增强子序列虽都呈现出相似的作用，但近端位点突变仍保留部分的P97激活作用。这是由于在近端位点序列上还重叠存在着一个SP1结合位点，YY1和SP1相互竞争的DNA结合作用也是YY1对P97抑制作用的方式之一。 增强子序列包含了许多转录激活因子的结合位点，YY1蛋白也可同一些活性蛋白相互作用发挥转录调节功能。这一效应可能影响YY1蛋白对启动子P97的抑制作用，但由于能够结合到HPV 16增强子序列的活性蛋白很多，尚不能确定是与何种蛋白相互作用的结果。YY1蛋白的DNA空间构相改变也可能起重要作用，根据我们实验结果可以推测在正常情况时由于YY1蛋白的结合使增强子在空间位置上远离启动子，而YY1位点的突变使这一空间位阻作用消失，使增强子接近启动子部位，从而促进启动子的活性(图3)。一旦去除上游增强子序列，YY1的空间位阻效应消失，对P97的抑制作用也随之消失。
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基金项目：教育部回国人员基金资助项目
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3，Dong XP, Stubenrauch F, Beyer Finkler E,et al. Prevalence of deletions of YY1-binding sites in episomal HPV 16 DNA from cervical cancers. Int J Cancer, 1994, 58:803-808.
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(收稿日期：1999-03-19), http://www.100md.com