膀胱癌高危乳头瘤病毒定位研究及临床意义
作者：余志贤 翁志梁 夏同礼 薛兆英 孔祥田
单位：余志贤 翁志梁(温州医学院附属第一医院 泌尿外科，浙江 温州 325000)；夏同礼 薛兆英 孔祥田(北京医科大学 泌尿外科研究所,北京 100034)
关键词：人乳头瘤病毒；膀胱癌；原位杂交；DNA探针
温州医学院学报000311
[摘要]目的:进一步探讨高危HPV16、18与膀胱癌的病因学关系。 方法:运用改良的原位杂交技术对52例福尔马林固定石蜡包埋膀胱乳头状移行细胞癌组织进行高危HPV DNA定位检测。 结果:HPV DNA的阳性信号存在于肿瘤细胞核内，呈点状，也可为点片状,位于乳头癌全层。癌旁不典型增生上皮、癌旁正常的上皮组织及Brunn氏巢可同时有高危HPV的点片状表达。52例膀胱乳头状移行细胞癌中高危型HPV16、18DNA阳性19例，阳性率为36.5%；其中2例膀胱癌组织HPV16和HPV18均阳性。结论:膀胱乳头状移行细胞癌HPV感染率较高，且病毒DNA在癌旁正常及不典型增生组织中可有不同程度的表达，提示HPV感染可能是膀胱癌的重要诱因之一；改良的原位杂交技术可用于对存档膀胱癌组织进行病毒感染的回顾性研究。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R737.14;R377 [文献标识码]A
[文章编号]1000-2138(2000)03-0205-03
High risk human papillomaviruses detection in the papillary transitional cell carcinoma of urinary bladder by modified non isotope in situ hybridization
YU Zhi-xian WENG Zhi-liang XIA Tong-li et al
(The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000)
, http://www.100md.com
Abstract：Objective：To evaluate the role of high risk human papillomavirus(HPV) in the development of bladder carcinoma.Methods：52 cases of formalin-fixed paraffin-embeded papillary transitional cell carcinoma of the urinary bladder were selected for studying high risk human papillomavirus(HPVs) types 16 and 18 DNA by modified non-isotopic in situ hybridization(NISH).Results：19 in 52 cases(36.5%) were positive for HPV DNA with punctuate and (or) diffuse purple-blue staining in the nucleus of cancer cells,including two cases positive both for HPV 16 and 18. Among these positive tumors,adjacent normal epithelium and Brunn's nests also revealed positive staining. Morphologically,HPV positive cells existed whole layer of papillary tumor cells.Conclusion：The study suggests that HPV infection maybe a potential factor for carcinogenesis of bladder neoplasms，and modified NISH is suited for screening HPV infection in archive surgical resection tissue of urinary bladder neoplasms.
, http://www.100md.com
Key words：human papillomavirus; bladder neoplasms; in situ hybridization; DNA probes
膀胱肿瘤是一种多基因异常疾病，病因复杂。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)为DNA病毒，根据其致癌性分为低危和高危两型，后者与人类肛门生殖道恶性肿瘤密切相关[1]。随着分子生物学技术的广泛应用，高危人乳头瘤病毒与膀胱肿瘤关系越来越受重视，但到目前为止，由于研究方法及标本来源的差异，其研究结果有较大争议。膀胱乳头状移行细胞癌在膀胱肿瘤中最多见，为此我们运用改良的原位杂交技术对52例膀胱乳头状移行细胞癌中高危HPV16、18的DNA进行定位研究。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药 1.1.1 病例选择及对照：52例膀胱乳头状移行细胞癌组织取自北京医科大学泌尿外科研究所1991年1月～1997年12月完整保存的全切膀胱癌标本，男45例，女7例。年龄36～84岁，平均62.1岁。复发者23例。
阳性对照为PCR和免疫组化确诊的HPV16/18阳性的鼻息肉及湿疣组织各2例(由北医大病理系刘翠玲老师提供)，经反复切片作为阳性对照。未加探针的阳性对照作为阴性对照。
1.1.2 主要试剂：地高辛标记的HPV16/18型特异探针及氯化氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸二钠盐(NBT/BCIP)显色系统(购自北京中山生物技术有限公司)。
1.2 实验方法 ①5μm石蜡切片，常规HE染色，明确诊断为膀胱乳头状移行细胞癌，其中G1 2例，G2 35例，G3 15例，PTa-T1 30例，PT2-T4 22例，分期分级依据TNM分类系统。②原位杂交：4μm石蜡切片，常规脱蜡，系列酒精脱水；组织DNA暴露，包括0.2N盐酸室温处理20分钟，蛋白酶K(8～10μg/ml)湿盒内消化37℃15分钟，2%甘氨酸、4%多聚甲醛室温固定10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)洗涤，室温逐级乙醇脱水，空气干燥；组织DNA充分变性(70%甲酰胺，4×SSC，72℃变性5～10分钟)，冰乙醇后固定，空气干燥；加入预杂交液湿盒内42℃预杂交4小时，加入经变性的HPV标记探针(DNA探针变性98℃,10分钟)，湿盒内42℃杂交16～17小时，终止杂交反应，依次盐溶液洗涤去除非特异结合(6×SSC 45分钟，共二次，2×SSC 15分钟，共二次)，加抗地高辛标记抗体(1:1000)4℃过夜，后经NBT/BCIP碱磷酶显色系统光显色。
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HPV16/18阳性的鼻息肉及湿疣组织检测与上述步骤相同，未加探针的阳性对照为空白阴性对照。
2 结果
运用碱磷酶显色系统，HPV DNA的原位杂交阳性信号为细胞核内紫蓝色沉淀，在肿瘤细胞中表达呈点状、点片状，其中以点状为主。癌旁不典型增生上皮、正常的上皮组织及Brunn氏巢可同时有高危HPV的点片状表达。阳性细胞占据乳头状癌全层。52例中总阳性19例(复发者8例)，阳性率36.5%，其中HPV16阳性6例、HPV18阳性11例、HPV16及HPV18均阳性2例。PTa～PT2期17例,阳性率38.6%,PT3～PT4期2例,阳性率为25%,G1～G2 14例，G3 5例。 随着肿瘤分期分级的增加，HPV16及HPV18的感染率有逐渐降低的趋势，但经统计学检验差异无显著性意义(P>0.05)，复发与不复发者之间阳性率差异也无统计学意义(P>0.05)。阳性对照均为阳性，未加探针空白对照均为阴性。
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3 讨论
人乳头瘤病毒分为低危和高危两型，前者如HPV6、11、32、70、78型，主要引起良性病变，如湿疣等；后者如HPV16、18、33、35、58、74型，主要与人类肛门生殖道恶性病变密切相关，其中与宫颈癌的关系已被公认[1]。膀胱肿瘤的病因复杂，高危型乳头瘤病毒与膀胱癌的关系有较大争议，美国、法国的一些研究者发现高危型乳头瘤病毒几乎与膀胱肿瘤的发生无关[2,3]，而日本、香港的一些研究发现该病毒在膀胱肿瘤中有很高的感染率[4,5]，提示该病毒有一定的致癌性。本研究的结果表明：52例膀胱乳头状移行细胞癌中，高危型乳头状瘤病毒HPV16、18阳性者19例，阳性率为36.5%，其中HPV16阳性6例，HPV18阳性11例，HPV16及18均阳性2例。说明膀胱乳头状移行细胞癌中确实存在较高的高危HPV16、18的感染，与Chan[5]报道一致，有些膀胱癌还可存在多重的乳头瘤病毒感染。分析产生这些不同结果的原因可能有以下几个方面：①不同检测方法，②不同标本处理及来源，③不同的地理区域分布。为此作者选择中性福尔马林固定石蜡包埋的全切的膀胱乳头状移行细胞癌作为研究对象，避免了标本因素的干扰。结果提示PTa～PT2期17例, 阳性率38.6%；PT3～PT4期2例，阳性率为25%；G1～G2 14例，G3 5例，即分化较好、浸润较浅的膀胱肿瘤感染率较高，但未发现这种差异具有统计学意义，可能与选择的病例较少有关。
, http://www.100md.com
HPV不能在体外培养，对这种分子水平的感染，很难用常规方法进行研究。随着分子生物学技术广泛开展，使研究得以进一步深入[1]。由于高危乳头瘤病毒基因的整合是细胞发生癌变的主要步骤之一，病毒基因一旦整合入宿主细胞，病毒早期区E2基因的表达将丧失，伴随而来的是癌基因E6、E7转录的增加[6]，病毒癌基因表达的增加，经复杂途径引起细胞的恶性转化。因此运用非同位素标记的E6/E7基因特异的DNA探针进行原位杂交检测，不仅能对病理标本中的HPV进行特异的分类检测，并能对病毒基因组及其转录产物进行细胞和组织内定位研究，但杂交信号的强弱也受诸多因素的影响，如盐酸的消化时间、蛋白酶K的浓度及消化时间、HPV的拷贝数及探针的活性等均影响其特异性和敏感度[7]，如果条件掌握适当，可测得约10个拷贝数的HPV DNA[8]。在前人实验基础上，为使组织切片中DNA的变性充分，本研究略加改良，主要表现在高浓度甲酰胺(70%)下，对组织切片中目的DNA进行变性(72℃，5～10分钟)，然后迅速梯度冰乙醇固定，预杂交后再将探针变性(98℃水浴10分钟)于预杂交液中进行杂交。这样就可避免组织和探针在98℃同时变性时操作上的不便，也降低了变性温度，而且同样达到充分变性的目的。另外，为了避免组织结构的过度破坏，蛋白酶K的浓度控制在8～10μg/ml左右，这样既能进行病理形态的观察,又能防止组织脱片。作者认为该检测技术适用于对存档的膀胱癌病理标本进行回顾性研究。
, 百拇医药
形态学上，乳头状瘤病毒感染定位于膀胱乳头状移行细胞癌及不典型增生上皮细胞全层，HPV DNA的杂交阳性信号位于细胞核内，与宫颈癌细胞表达相似[6]，由于高危乳头瘤病毒基因整合入宿主基因是细胞发生癌变的主要步骤之一，因此推测，病毒基因整合可能也同样参与膀胱移行细胞的癌变。
乳头瘤病毒经何种途径感染膀胱移行细胞目前尚不清楚。最近研究发现，整合素a6是乳头瘤病毒感染的受体，它以a6b4/a6b1形式结合乳头瘤病毒，参与乳头瘤病毒的感染过程[9]，然而a6、b4在膀胱移行细胞中表达仅存在于基底层细胞[10],因此人乳头瘤病毒特别是高危HPV以何种方式结合到基底层细胞，进而诱发细胞的异常增生及癌变，尚需进一步研究。
作者简介：余志贤(1968-)，男，浙江龙游人，医学硕士，主治医师。
参考文献
, http://www.100md.com
[1] De Villiers EM. Papillomavirus and HPV typing[J]. Clin Dermatol,1997,15:199-206.
[2] Lu QL,Lalani-el N,Abel P,et al. Human papillomavirus 16 and 18 infection is absent in urinary bladder carcinomas[J]. Eur Urol，1997,31(4):428-432.
[3] Aynaud O, Tranbaloc P,Orth G,et al.Lack of evidence for a role of human papillomavirus in transitional cell carcinoma of the bladder[J].J Urol,1998,159:86-90.
, 百拇医药 [4] Furihata M, Inone K, Ohtsuki Y,et al. High-risk human papillomavirus infections and over expression of p53 protein as prognostic indicators in transitional cell carcinoma of the urinary bladder[J]. Cancer Res,1993,53:4823-4827.
[5] Chan KW,Wang KY，Srivastava G.Prevalence of six types of human papillomaviruses in inverted papilloma and papiillary transitional cell carcinoma of the bladder:an evaluation by polymerase chain reaction[J]. J Clin Pathol,1997,50(2):1018-1021.
, 百拇医药
[6] Park JS, Hwang ES, Park SN,et al. Physical status and expression of HPV genes in cervical cancers[J]. Gynecologic Oncology,1997,65:121-129.
[7] Mcnicol AM, Farquharson MA. In situ hybridization and its diagnostic applications in pathology[J].(Rev) J Pathol,1997,182:250-261.
[8] Burns J, Graham AK, Frank C,et al. Detection of low copy human papillomavirus DNA and mRNA in routine paraffin sections of cervix by non-isotopic in situ hybridization[J]. J Clin Pathol,1987,40:865-869.
, 百拇医药
[9] Evander M,Frazer IH,Payne E,et al. Identification of the a6 integrin as a candidate receptor for papillmaviruses[J]. J Virol,1997,71(3):2449-2456.
[10] Liebert M,Elemayer G,Stein JA,et al. The monoclonal antibody BQ 16 identifies the a6b4 integrin in bladder cancers[J]. Hybridoma,1993,12:67-80.
收稿日期：1999-11-15
修回日期：1999-12-15, 百拇医药
单位：余志贤 翁志梁(温州医学院附属第一医院 泌尿外科，浙江 温州 325000)；夏同礼 薛兆英 孔祥田(北京医科大学 泌尿外科研究所,北京 100034)
关键词：人乳头瘤病毒；膀胱癌；原位杂交；DNA探针
温州医学院学报000311
[摘要]目的:进一步探讨高危HPV16、18与膀胱癌的病因学关系。 方法:运用改良的原位杂交技术对52例福尔马林固定石蜡包埋膀胱乳头状移行细胞癌组织进行高危HPV DNA定位检测。 结果:HPV DNA的阳性信号存在于肿瘤细胞核内，呈点状，也可为点片状,位于乳头癌全层。癌旁不典型增生上皮、癌旁正常的上皮组织及Brunn氏巢可同时有高危HPV的点片状表达。52例膀胱乳头状移行细胞癌中高危型HPV16、18DNA阳性19例，阳性率为36.5%；其中2例膀胱癌组织HPV16和HPV18均阳性。结论:膀胱乳头状移行细胞癌HPV感染率较高，且病毒DNA在癌旁正常及不典型增生组织中可有不同程度的表达，提示HPV感染可能是膀胱癌的重要诱因之一；改良的原位杂交技术可用于对存档膀胱癌组织进行病毒感染的回顾性研究。
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[中图分类号]R737.14;R377 [文献标识码]A
[文章编号]1000-2138(2000)03-0205-03
High risk human papillomaviruses detection in the papillary transitional cell carcinoma of urinary bladder by modified non isotope in situ hybridization
YU Zhi-xian WENG Zhi-liang XIA Tong-li et al
(The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000)
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Abstract：Objective：To evaluate the role of high risk human papillomavirus(HPV) in the development of bladder carcinoma.Methods：52 cases of formalin-fixed paraffin-embeded papillary transitional cell carcinoma of the urinary bladder were selected for studying high risk human papillomavirus(HPVs) types 16 and 18 DNA by modified non-isotopic in situ hybridization(NISH).Results：19 in 52 cases(36.5%) were positive for HPV DNA with punctuate and (or) diffuse purple-blue staining in the nucleus of cancer cells,including two cases positive both for HPV 16 and 18. Among these positive tumors,adjacent normal epithelium and Brunn's nests also revealed positive staining. Morphologically,HPV positive cells existed whole layer of papillary tumor cells.Conclusion：The study suggests that HPV infection maybe a potential factor for carcinogenesis of bladder neoplasms，and modified NISH is suited for screening HPV infection in archive surgical resection tissue of urinary bladder neoplasms.
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Key words：human papillomavirus; bladder neoplasms; in situ hybridization; DNA probes
膀胱肿瘤是一种多基因异常疾病，病因复杂。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)为DNA病毒，根据其致癌性分为低危和高危两型，后者与人类肛门生殖道恶性肿瘤密切相关[1]。随着分子生物学技术的广泛应用，高危人乳头瘤病毒与膀胱肿瘤关系越来越受重视，但到目前为止，由于研究方法及标本来源的差异，其研究结果有较大争议。膀胱乳头状移行细胞癌在膀胱肿瘤中最多见，为此我们运用改良的原位杂交技术对52例膀胱乳头状移行细胞癌中高危HPV16、18的DNA进行定位研究。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药 1.1.1 病例选择及对照：52例膀胱乳头状移行细胞癌组织取自北京医科大学泌尿外科研究所1991年1月～1997年12月完整保存的全切膀胱癌标本，男45例，女7例。年龄36～84岁，平均62.1岁。复发者23例。
阳性对照为PCR和免疫组化确诊的HPV16/18阳性的鼻息肉及湿疣组织各2例(由北医大病理系刘翠玲老师提供)，经反复切片作为阳性对照。未加探针的阳性对照作为阴性对照。
1.1.2 主要试剂：地高辛标记的HPV16/18型特异探针及氯化氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸二钠盐(NBT/BCIP)显色系统(购自北京中山生物技术有限公司)。
1.2 实验方法 ①5μm石蜡切片，常规HE染色，明确诊断为膀胱乳头状移行细胞癌，其中G1 2例，G2 35例，G3 15例，PTa-T1 30例，PT2-T4 22例，分期分级依据TNM分类系统。②原位杂交：4μm石蜡切片，常规脱蜡，系列酒精脱水；组织DNA暴露，包括0.2N盐酸室温处理20分钟，蛋白酶K(8～10μg/ml)湿盒内消化37℃15分钟，2%甘氨酸、4%多聚甲醛室温固定10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)洗涤，室温逐级乙醇脱水，空气干燥；组织DNA充分变性(70%甲酰胺，4×SSC，72℃变性5～10分钟)，冰乙醇后固定，空气干燥；加入预杂交液湿盒内42℃预杂交4小时，加入经变性的HPV标记探针(DNA探针变性98℃,10分钟)，湿盒内42℃杂交16～17小时，终止杂交反应，依次盐溶液洗涤去除非特异结合(6×SSC 45分钟，共二次，2×SSC 15分钟，共二次)，加抗地高辛标记抗体(1:1000)4℃过夜，后经NBT/BCIP碱磷酶显色系统光显色。
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HPV16/18阳性的鼻息肉及湿疣组织检测与上述步骤相同，未加探针的阳性对照为空白阴性对照。
2 结果
运用碱磷酶显色系统，HPV DNA的原位杂交阳性信号为细胞核内紫蓝色沉淀，在肿瘤细胞中表达呈点状、点片状，其中以点状为主。癌旁不典型增生上皮、正常的上皮组织及Brunn氏巢可同时有高危HPV的点片状表达。阳性细胞占据乳头状癌全层。52例中总阳性19例(复发者8例)，阳性率36.5%，其中HPV16阳性6例、HPV18阳性11例、HPV16及HPV18均阳性2例。PTa～PT2期17例,阳性率38.6%,PT3～PT4期2例,阳性率为25%,G1～G2 14例，G3 5例。 随着肿瘤分期分级的增加，HPV16及HPV18的感染率有逐渐降低的趋势，但经统计学检验差异无显著性意义(P>0.05)，复发与不复发者之间阳性率差异也无统计学意义(P>0.05)。阳性对照均为阳性，未加探针空白对照均为阴性。
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3 讨论
人乳头瘤病毒分为低危和高危两型，前者如HPV6、11、32、70、78型，主要引起良性病变，如湿疣等；后者如HPV16、18、33、35、58、74型，主要与人类肛门生殖道恶性病变密切相关，其中与宫颈癌的关系已被公认[1]。膀胱肿瘤的病因复杂，高危型乳头瘤病毒与膀胱癌的关系有较大争议，美国、法国的一些研究者发现高危型乳头瘤病毒几乎与膀胱肿瘤的发生无关[2,3]，而日本、香港的一些研究发现该病毒在膀胱肿瘤中有很高的感染率[4,5]，提示该病毒有一定的致癌性。本研究的结果表明：52例膀胱乳头状移行细胞癌中，高危型乳头状瘤病毒HPV16、18阳性者19例，阳性率为36.5%，其中HPV16阳性6例，HPV18阳性11例，HPV16及18均阳性2例。说明膀胱乳头状移行细胞癌中确实存在较高的高危HPV16、18的感染，与Chan[5]报道一致，有些膀胱癌还可存在多重的乳头瘤病毒感染。分析产生这些不同结果的原因可能有以下几个方面：①不同检测方法，②不同标本处理及来源，③不同的地理区域分布。为此作者选择中性福尔马林固定石蜡包埋的全切的膀胱乳头状移行细胞癌作为研究对象，避免了标本因素的干扰。结果提示PTa～PT2期17例, 阳性率38.6%；PT3～PT4期2例，阳性率为25%；G1～G2 14例，G3 5例，即分化较好、浸润较浅的膀胱肿瘤感染率较高，但未发现这种差异具有统计学意义，可能与选择的病例较少有关。
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HPV不能在体外培养，对这种分子水平的感染，很难用常规方法进行研究。随着分子生物学技术广泛开展，使研究得以进一步深入[1]。由于高危乳头瘤病毒基因的整合是细胞发生癌变的主要步骤之一，病毒基因一旦整合入宿主细胞，病毒早期区E2基因的表达将丧失，伴随而来的是癌基因E6、E7转录的增加[6]，病毒癌基因表达的增加，经复杂途径引起细胞的恶性转化。因此运用非同位素标记的E6/E7基因特异的DNA探针进行原位杂交检测，不仅能对病理标本中的HPV进行特异的分类检测，并能对病毒基因组及其转录产物进行细胞和组织内定位研究，但杂交信号的强弱也受诸多因素的影响，如盐酸的消化时间、蛋白酶K的浓度及消化时间、HPV的拷贝数及探针的活性等均影响其特异性和敏感度[7]，如果条件掌握适当，可测得约10个拷贝数的HPV DNA[8]。在前人实验基础上，为使组织切片中DNA的变性充分，本研究略加改良，主要表现在高浓度甲酰胺(70%)下，对组织切片中目的DNA进行变性(72℃，5～10分钟)，然后迅速梯度冰乙醇固定，预杂交后再将探针变性(98℃水浴10分钟)于预杂交液中进行杂交。这样就可避免组织和探针在98℃同时变性时操作上的不便，也降低了变性温度，而且同样达到充分变性的目的。另外，为了避免组织结构的过度破坏，蛋白酶K的浓度控制在8～10μg/ml左右，这样既能进行病理形态的观察,又能防止组织脱片。作者认为该检测技术适用于对存档的膀胱癌病理标本进行回顾性研究。
, 百拇医药
形态学上，乳头状瘤病毒感染定位于膀胱乳头状移行细胞癌及不典型增生上皮细胞全层，HPV DNA的杂交阳性信号位于细胞核内，与宫颈癌细胞表达相似[6]，由于高危乳头瘤病毒基因整合入宿主基因是细胞发生癌变的主要步骤之一，因此推测，病毒基因整合可能也同样参与膀胱移行细胞的癌变。
乳头瘤病毒经何种途径感染膀胱移行细胞目前尚不清楚。最近研究发现，整合素a6是乳头瘤病毒感染的受体，它以a6b4/a6b1形式结合乳头瘤病毒，参与乳头瘤病毒的感染过程[9]，然而a6、b4在膀胱移行细胞中表达仅存在于基底层细胞[10],因此人乳头瘤病毒特别是高危HPV以何种方式结合到基底层细胞，进而诱发细胞的异常增生及癌变，尚需进一步研究。
作者简介：余志贤(1968-)，男，浙江龙游人，医学硕士，主治医师。
参考文献
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[1] De Villiers EM. Papillomavirus and HPV typing[J]. Clin Dermatol,1997,15:199-206.
[2] Lu QL,Lalani-el N,Abel P,et al. Human papillomavirus 16 and 18 infection is absent in urinary bladder carcinomas[J]. Eur Urol，1997,31(4):428-432.
[3] Aynaud O, Tranbaloc P,Orth G,et al.Lack of evidence for a role of human papillomavirus in transitional cell carcinoma of the bladder[J].J Urol,1998,159:86-90.
, 百拇医药 [4] Furihata M, Inone K, Ohtsuki Y,et al. High-risk human papillomavirus infections and over expression of p53 protein as prognostic indicators in transitional cell carcinoma of the urinary bladder[J]. Cancer Res,1993,53:4823-4827.
[5] Chan KW,Wang KY，Srivastava G.Prevalence of six types of human papillomaviruses in inverted papilloma and papiillary transitional cell carcinoma of the bladder:an evaluation by polymerase chain reaction[J]. J Clin Pathol,1997,50(2):1018-1021.
, 百拇医药
[6] Park JS, Hwang ES, Park SN,et al. Physical status and expression of HPV genes in cervical cancers[J]. Gynecologic Oncology,1997,65:121-129.
[7] Mcnicol AM, Farquharson MA. In situ hybridization and its diagnostic applications in pathology[J].(Rev) J Pathol,1997,182:250-261.
[8] Burns J, Graham AK, Frank C,et al. Detection of low copy human papillomavirus DNA and mRNA in routine paraffin sections of cervix by non-isotopic in situ hybridization[J]. J Clin Pathol,1987,40:865-869.
, 百拇医药
[9] Evander M,Frazer IH,Payne E,et al. Identification of the a6 integrin as a candidate receptor for papillmaviruses[J]. J Virol,1997,71(3):2449-2456.
[10] Liebert M,Elemayer G,Stein JA,et al. The monoclonal antibody BQ 16 identifies the a6b4 integrin in bladder cancers[J]. Hybridoma,1993,12:67-80.
收稿日期：1999-11-15
修回日期：1999-12-15, 百拇医药