白念珠菌菌血症诱导小鼠皮质胸腺细胞凋亡
作者：陈欲晓 韦超凡 蒋洪敏
单位：陈欲晓(免疫学教研室 长沙 410078)；韦超凡(免疫学教研室 长沙 410078)；蒋洪敏(第二附属医院检验科 长沙 410011)
关键词：念珠菌病；菌血症；胸腺；细胞凋亡；小鼠
湖南医科大学学报000206 [摘要] 采用白念珠菌诱导小鼠胸腺内细胞凋亡， 对其发生 部位和累及的胸腺内细胞表型进行了研究。结果发现：静脉注射白念珠菌入小鼠体内6 h后 ，开始出现胸腺细胞凋亡；12 h，18 h和24 h胸腺凋亡细胞百分率不断增加；CD3+和C D8+ 细胞百分率均较对照组有明显的下降；胸腺内细胞凋亡主要发生在皮质区，而髓质区则少。 表明白念珠菌能诱导小鼠胸腺细胞凋亡(主要是未成熟CD3+CD4+CD8+细胞及少量成熟 的CD3+CD4-CD8+细胞)。
, 百拇医药
[中图分类号] R515.3 R519.3 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0113-04
Intravenous infection of C.Albicans Induces Apoptosis
of Cortical Thymocytes in Mice
CHEN Yu-xiao, WEI Chao-fan
(Department of Immunology, Hunan Medical University Changsha 410078)
JIANG Hong-ming
(Department of Clinical Laboratory, The Second Affiliated Hospital, Hu nan Medical University Changsha 410011)
, 百拇医药
[Abstract] In this study, we aimed to understand the location of apoptotic cells in murine thymus and phenotype of murine thymocytes involved in C.albicans induced apoptosis. Results showed that significant increase o f apoptotic cells in thymus began at 6 h after intravenous injection of C.alb icans and kept increased at 12 h,18 h and 24 h. Quantitative changes of thy mocytes with different phenotype measured by flow cytometry revealed that percen tage of CD3+ and CD8+ cells were significantly reduced compared to the contr ols. Moreover in situ cell death detection of thymic tissue revealed that apopto tic cells induced by C.albicans mainly located in the thymic cortex, while in the thymic medulla a very small number of thymocytes was involved. Taken toget her our study indicates that C.albicans induces apoptosis of murine thymocyt es, moreover the apoptosis possibly involves the major immature CD3+CD4+CD8 + cells in the thymic cortex and minor mature CD3+CD4-CD8+ cells in the thymic medulla.
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[Key words] Candidiasis; bacteremia; thymus gland; ap optosis; mice
胸腺是T细胞发育、分化、成熟的场所，微生物 通过诱导 胸腺细胞凋亡，从而影响外周血T细胞的数量和功能[1，2]。白念珠菌(C.albi cans)是一种条件致病性真菌，对于HIV感染的病人或用免疫抑制剂进行系统治疗的病人则 是一种主要致死因素[3]，某些白念珠菌阴道炎的妇女表现出对白念珠菌的细胞介 导的免疫缺陷[4]。我室也证明白念珠菌感染后小鼠出现胸腺内细胞凋亡，且外周 血淋巴细胞数量下降[5]。本研究对白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡所累及的细胞 表型以及细胞凋亡在胸腺的发生部位进行了研究，结果表明胸腺内细胞凋亡主要发生在胸腺 的皮质区，而累及的细胞主要为未成熟的CD3+CD4+CD8+及少量成熟的CD3+CD4-CD 8+细胞。
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1 材料与方法
1.1 材料 健康雌性4周龄昆明种小鼠，体重14～16g，常规饲养。小鼠 随机分成两大组，一组经尾静脉注射0.2ml生理盐水作为对照组；另一组注射4×106白 念珠菌作为实验组；再根据观察时间不同又将各大组分为5个不同时间组，即2h,6h,12 h,18h,24h组。
1.2 方法
1.2.1 静脉注射用白念珠菌的制备 将白念珠菌ID16V1 (中科院菌种保 存中心提供)按文献[6]处理，使98%白念珠菌形成菌丝型，调整至2×107/ml浓度。
1.2.2 DNA提取及凝胶电泳 方法参照文献[7]。
1.2.3 组织病理学和免疫组织化学凋亡细胞原位定位 将对照组和实验组 小鼠胸腺取出，取小块组织置4%甲醛缓冲液保存。然后做石蜡组织切片，常规HE染色。实验 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl trans ferase-mediated nick end-labeling, TUNEL)对胸腺凋亡细胞进行定位。按试剂盒(In s itu cell death detection kit, POD.美国Roche molecular biochemicals)说明书操作， 常规石蜡组织切片经脱蜡、再水化，然后加入蛋白酶K(20μg*ml-1)，37℃消化20 min，PBS洗2次，于室温用3% H2O2甲醇液阻断内源性过氧化物酶，再经膜通透性增强 (0.1% Triton X-100于0.1%枸橼酸钠溶液)处理2min；PBS洗涤，再加入50μl TUNEL 反应液(末端脱氧核苷酸转移酶+FITC标记dUTP)于切片样本上(阴性对照切片样本不加酶，只 加FITC-dUTP)，置湿盒，37℃孵育60min，PBS洗2次(此时可在荧光显微镜下观察结果)。 加正常羊血清封闭1h，PBS洗涤，加50μl过氧化物酶(POD)标记的抗FITC抗体溶液，置 湿盒37℃孵育30min，加底物DAB 50μl，室温显色，最后用苏木精复染便于观察。
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1.2.4 流式细胞仪检测 (1)凋亡细胞百分率检测：按文献[2]处理 胸腺细胞悬液后，细胞核DNA经荧光染色(PI)，流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)分析，计 算凋亡细胞百分率。(2)胸腺细胞表型检测：胸腺细胞悬液滴入1%甲醛缓冲液中固定，分别 用抗CD3，CD4和CD8荧光标记的单克隆抗体(MACO产品)染色，然后FCM分别检测胸腺细胞悬液 中CD3，CD4和CD8阳性细胞百分率，观察对照组和实验组小鼠胸腺不同表型细胞的数量变化 。
1.3 统计学处理 实验结果用均数±标准误(
±s) 表示，多组间比较用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 白念珠菌诱导小鼠胸腺凋亡细胞百分率的变化 小鼠经尾静脉注射4× 106的白念珠菌，2h实验组未出现明显的胸腺凋亡细胞百分率的改变，在6h，12h， 18h及24 h凋亡百分率逐渐增加，与对照组比较有显著性差异(P<0.05，表1)，24h较12h组 凋亡百分率也有明显上升(P<0.01)。
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2.2 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞产生典型的凋亡生化学改变 在实验12 h， 18h，24h组，胸腺细胞基因组DNA电泳均出现典型的DNA“梯形带”(图1)。
表1 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡百分 率的变化(±s) 组别
n
凋亡细胞百分率( %)
对照组
4
1.98±0.23
实验组
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2h
4
8.90±0.46
6h
4
12.08±2.53①
12h
4
18.56±2.11②
18h
4
26.75±1.58②
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24h
4
31.60±3.86②③
与对照组比较①P<0.5， ②P<0.001； ③与12h组比较P<0.01
图1 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞产生DNA梯形 带 1.pBR322/BstNI marker 2.对照组 3～7.实验组分别为2h,6h,12h,18h和24 h 8.地塞米松组(正常小鼠胸腺细胞经10-5M地塞米松处理5h)
Fig.1 DNA ladder in C.albicans-induced apoptosis of murine thymocytes 1.Marker pBR322/BstNI; 2.Control; 3～7. 2h,6 h,12h,18 and 24h test groups respectively; 8.DXM group(normal murine thy mocytes treated with 10-5M dexamethason for 5h)
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2.3 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡中细胞表型分析 结果见2。在12 h和24h实验组，CD3+细胞百分率较对照组均有很明显的下降，24h实验组CD8+细胞总数较对照组也有明显下降。
表2 不同表型细胞的百分率在白念珠菌诱 导小鼠胸腺细胞凋亡中的变化(±s) 分组
n
C D3阳性细胞(%)
CD4阳性细胞(%)
CD8阳性细胞(%)
对照组
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4
77.70±2.08
48.58±1.53
34.05±2.56
实验组
12h
4
64.95±2.13①
41.48±6.42
27.68±2.32
24h
4
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66.75±1.77①
47.08±1.14
22.30±0.42①
①与对照组比较P<0.01
2.4 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡胸腺组织切片HE染色 对照组及6h 实验组切片的皮质、髓质区分介清楚，均未发现凋亡细胞；而12h实验组可见皮质区许多 细胞核固缩，胞膜不规则，而24h实验组凋亡小体明显可见(图2)。
2.5 胸腺组织切片凋亡细胞原位末端标记法(TUNEL)检测 对照组胸腺组 织 切片凋亡细胞极少，且分布在皮髓质区交界处；6h实验组凋亡细胞较对照组有明显增加， 主要为髓质区和皮髓交界处的增加；12和24h实验组凋亡细胞数增加非常显著，且主要为 皮质区增加(图3)。
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图2 胸腺石蜡切片HE染色 A.对照组：可见大 量具有疏松核的正常胸腺细胞(×400) B.12h实验组：皮质区可见核固缩的胸腺细胞(× 400) C.24h实验组：皮质区可见凋亡小体(×1000)
Fig.2 HE stain of thymic paraffin sectio n A.Control group: numerous normal thymocytes with loose chromatin are visible in the cortex(×400) B. 12h test group: thymocytes with condensed chromatin a re visible mainly in the cortex(×400) C. 24h test group: apoptotic bodies ar e visible mainly in the cortex(×1000)
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图3 胸腺石蜡切片凋亡细胞原位定位检测 A. 对照组：染色阳性的细胞极少见(×400) B.24h实验组：皮质区染色阳性细胞增加明显( ×400)
Fig.3 In situ detection of apoptotic cel l of thymic paraffin section A. Control group: positively stained cells rarely can be seen(×400) B. 24h test group: positively stained cells increased rema rkably in the cortex(×400)
3 讨 论
许多微生物被证实能在体内外诱导胸腺细胞凋亡，但有关白念珠菌诱导小鼠体内胸腺细胞凋 亡的细胞表型分析以及原位凋亡细胞定位迄今国内外未见报导。本研究用4×106白念珠菌 经尾静脉注射入小鼠体内后，经FCM分析发现实验组小鼠胸腺细胞凋亡百分率在6h出现明 显增加，并于12h，18h，24h持续上升。DNA凝胶电泳发现12h实验组出现典型的DNA “梯形 带”，随后18h和24h均有“梯形带”出现。这些结果表明白念珠菌菌血症能诱导小鼠胸 腺 细胞凋亡，且呈时间依赖性。据报道正常胸腺发育过程中，凋亡的主要对象是CD4+CD8 +细胞[8]。微生物(如细菌)感染也引起CD4+CD8+细胞为主的胸腺细胞凋亡 [9]。Aiba证实SEB(葡萄球菌肠毒素B)注射小鼠后引起胸腺CD4+CD8+细胞急剧下 降[10]。本实验结果发现12h和24h实验组CD3+细胞总数较对照组有显著性 下 降(P<0.01)；提示静脉注射白念珠菌，可引起小鼠胸腺CD3+细胞凋亡。据报道，胸腺 浅皮质区双阴性胸腺细胞约为10%，深皮质区双阳性胸腺细胞约为75%，髓质区单阳性胸腺细 胞约为15%[11]。综合胸腺组织切片TUNEL结果分析发现细胞凋亡主要累及深皮质 区的胸腺细胞，故推测凋亡的CD3+细胞主要为CD3+CD4+CD8+细胞。实验还发现CD8 +细胞数量(包括CD4+CD8+和CD4-CD8+细胞)分别于12h和24h均有下降，且24 h 较对照组有显著性下降，结合胸腺切片TUNEL结果发现实验组较对照组髓质区凋亡细胞有轻 微增加，提示除CD3+CD4+CD8+细胞凋亡外，可能CD4-CD8+细胞也发生了凋亡。上 述结果不难看出白念珠菌主要诱导小鼠胸腺CD3+CD4+CD8+细胞凋亡及少量CD4-CD8 +细胞凋亡，其机制还有待进一步研究证实。
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参考文献：
[1] Wang SD, Huang KJ, Lin YS, et al. Sepsis-induced ap optosis of the thymocytes in mice[J]. J Immunol, 1994,152(10):5014-5021.
[2] Darzynkiewicz Z, Gloria J, Li X, et al. Cytometry in cell necrobiolog y: analysis of apoptosis and accidental cell death(necrosis)[J]. Cytometry, 19 97,27:1-20.
[3] Klein RS, Harris CA, Small CB, et al. Oral candiasis in high risk pat ients as the initial manifestation of the acquired immunodeficiency syndrome[J ]. N Eng Med, 1984,311:354-358.
, 百拇医药
[4] Bailliere Tindall. Candida and Candidiasis[M]. 2nd ed, Philadelphia: Od ds FC, 1998:124-135.
[5] 蒋洪敏，韦超凡，陈利玉，等.白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的研究[J].中华 微生物学和免疫学杂志，1999，19(6)：451-454.
[6] Blasi E, Puliti M, Pitzurra L, et al. Heterogenous secretory response of phagocytes from different anatomical districts to the dimporphic fungus Cand ida albicans[J]. Cell Immunol, 1994,153:239-247.
[7] Natio M, Nagai H, Kawano S, et al. Liposome-encapsulated dichloromet hylene diphosphonate induces macrophage apoptosis in vivo and in vitro[J]. J L eukoc Biol, 1996,60:337-344.
, 百拇医药
[8] 郭爱珍.胸腺细胞的发育与凋亡[J].细胞与分子免疫学杂志，1997，13(2)：61-6 5.
[9] Lin YS, Lei HY, Low TLK, et al. In vivo induction of apoptosis in imm ature thymocytes by staphylococcal enterotoxin B[J]. J Immunol, 1992,149(4):11 56.
[10] Aiba Y, Mazda O, Matsuzaki H, et al. Clonal deletion of thym ic mature T cells induced by staphylococcal enterotoxin B in murine fetal thymus organ culture[J]. Eur J Immunol, 1993,23:815-819.
[11] 余传霖.现代医学免疫学[M].上海：上海医科大学出版社，1998：21-22., http://www.100md.com
单位：陈欲晓(免疫学教研室 长沙 410078)；韦超凡(免疫学教研室 长沙 410078)；蒋洪敏(第二附属医院检验科 长沙 410011)
关键词：念珠菌病；菌血症；胸腺；细胞凋亡；小鼠
湖南医科大学学报000206 [摘要] 采用白念珠菌诱导小鼠胸腺内细胞凋亡， 对其发生 部位和累及的胸腺内细胞表型进行了研究。结果发现：静脉注射白念珠菌入小鼠体内6 h后 ，开始出现胸腺细胞凋亡；12 h，18 h和24 h胸腺凋亡细胞百分率不断增加；CD3+和C D8+ 细胞百分率均较对照组有明显的下降；胸腺内细胞凋亡主要发生在皮质区，而髓质区则少。 表明白念珠菌能诱导小鼠胸腺细胞凋亡(主要是未成熟CD3+CD4+CD8+细胞及少量成熟 的CD3+CD4-CD8+细胞)。
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[中图分类号] R515.3 R519.3 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0113-04
Intravenous infection of C.Albicans Induces Apoptosis
of Cortical Thymocytes in Mice
CHEN Yu-xiao, WEI Chao-fan
(Department of Immunology, Hunan Medical University Changsha 410078)
JIANG Hong-ming
(Department of Clinical Laboratory, The Second Affiliated Hospital, Hu nan Medical University Changsha 410011)
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[Abstract] In this study, we aimed to understand the location of apoptotic cells in murine thymus and phenotype of murine thymocytes involved in C.albicans induced apoptosis. Results showed that significant increase o f apoptotic cells in thymus began at 6 h after intravenous injection of C.alb icans and kept increased at 12 h,18 h and 24 h. Quantitative changes of thy mocytes with different phenotype measured by flow cytometry revealed that percen tage of CD3+ and CD8+ cells were significantly reduced compared to the contr ols. Moreover in situ cell death detection of thymic tissue revealed that apopto tic cells induced by C.albicans mainly located in the thymic cortex, while in the thymic medulla a very small number of thymocytes was involved. Taken toget her our study indicates that C.albicans induces apoptosis of murine thymocyt es, moreover the apoptosis possibly involves the major immature CD3+CD4+CD8 + cells in the thymic cortex and minor mature CD3+CD4-CD8+ cells in the thymic medulla.
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[Key words] Candidiasis; bacteremia; thymus gland; ap optosis; mice
胸腺是T细胞发育、分化、成熟的场所，微生物 通过诱导 胸腺细胞凋亡，从而影响外周血T细胞的数量和功能[1，2]。白念珠菌(C.albi cans)是一种条件致病性真菌，对于HIV感染的病人或用免疫抑制剂进行系统治疗的病人则 是一种主要致死因素[3]，某些白念珠菌阴道炎的妇女表现出对白念珠菌的细胞介 导的免疫缺陷[4]。我室也证明白念珠菌感染后小鼠出现胸腺内细胞凋亡，且外周 血淋巴细胞数量下降[5]。本研究对白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡所累及的细胞 表型以及细胞凋亡在胸腺的发生部位进行了研究，结果表明胸腺内细胞凋亡主要发生在胸腺 的皮质区，而累及的细胞主要为未成熟的CD3+CD4+CD8+及少量成熟的CD3+CD4-CD 8+细胞。
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1 材料与方法
1.1 材料 健康雌性4周龄昆明种小鼠，体重14～16g，常规饲养。小鼠 随机分成两大组，一组经尾静脉注射0.2ml生理盐水作为对照组；另一组注射4×106白 念珠菌作为实验组；再根据观察时间不同又将各大组分为5个不同时间组，即2h,6h,12 h,18h,24h组。
1.2 方法
1.2.1 静脉注射用白念珠菌的制备 将白念珠菌ID16V1 (中科院菌种保 存中心提供)按文献[6]处理，使98%白念珠菌形成菌丝型，调整至2×107/ml浓度。
1.2.2 DNA提取及凝胶电泳 方法参照文献[7]。
1.2.3 组织病理学和免疫组织化学凋亡细胞原位定位 将对照组和实验组 小鼠胸腺取出，取小块组织置4%甲醛缓冲液保存。然后做石蜡组织切片，常规HE染色。实验 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl trans ferase-mediated nick end-labeling, TUNEL)对胸腺凋亡细胞进行定位。按试剂盒(In s itu cell death detection kit, POD.美国Roche molecular biochemicals)说明书操作， 常规石蜡组织切片经脱蜡、再水化，然后加入蛋白酶K(20μg*ml-1)，37℃消化20 min，PBS洗2次，于室温用3% H2O2甲醇液阻断内源性过氧化物酶，再经膜通透性增强 (0.1% Triton X-100于0.1%枸橼酸钠溶液)处理2min；PBS洗涤，再加入50μl TUNEL 反应液(末端脱氧核苷酸转移酶+FITC标记dUTP)于切片样本上(阴性对照切片样本不加酶，只 加FITC-dUTP)，置湿盒，37℃孵育60min，PBS洗2次(此时可在荧光显微镜下观察结果)。 加正常羊血清封闭1h，PBS洗涤，加50μl过氧化物酶(POD)标记的抗FITC抗体溶液，置 湿盒37℃孵育30min，加底物DAB 50μl，室温显色，最后用苏木精复染便于观察。
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1.2.4 流式细胞仪检测 (1)凋亡细胞百分率检测：按文献[2]处理 胸腺细胞悬液后，细胞核DNA经荧光染色(PI)，流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)分析，计 算凋亡细胞百分率。(2)胸腺细胞表型检测：胸腺细胞悬液滴入1%甲醛缓冲液中固定，分别 用抗CD3，CD4和CD8荧光标记的单克隆抗体(MACO产品)染色，然后FCM分别检测胸腺细胞悬液 中CD3，CD4和CD8阳性细胞百分率，观察对照组和实验组小鼠胸腺不同表型细胞的数量变化 。
1.3 统计学处理 实验结果用均数±标准误(
±s) 表示，多组间比较用单因素方差分析。2 结 果
2.1 白念珠菌诱导小鼠胸腺凋亡细胞百分率的变化 小鼠经尾静脉注射4× 106的白念珠菌，2h实验组未出现明显的胸腺凋亡细胞百分率的改变，在6h，12h， 18h及24 h凋亡百分率逐渐增加，与对照组比较有显著性差异(P<0.05，表1)，24h较12h组 凋亡百分率也有明显上升(P<0.01)。
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2.2 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞产生典型的凋亡生化学改变 在实验12 h， 18h，24h组，胸腺细胞基因组DNA电泳均出现典型的DNA“梯形带”(图1)。
表1 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡百分 率的变化(
±s) 组别n
凋亡细胞百分率( %)
对照组
4
1.98±0.23
实验组
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2h
4
8.90±0.46
6h
4
12.08±2.53①
12h
4
18.56±2.11②
18h
4
26.75±1.58②
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24h
4
31.60±3.86②③
与对照组比较①P<0.5， ②P<0.001； ③与12h组比较P<0.01
图1 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞产生DNA梯形 带 1.pBR322/BstNI marker 2.对照组 3～7.实验组分别为2h,6h,12h,18h和24 h 8.地塞米松组(正常小鼠胸腺细胞经10-5M地塞米松处理5h)
Fig.1 DNA ladder in C.albicans-induced apoptosis of murine thymocytes 1.Marker pBR322/BstNI; 2.Control; 3～7. 2h,6 h,12h,18 and 24h test groups respectively; 8.DXM group(normal murine thy mocytes treated with 10-5M dexamethason for 5h)
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2.3 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡中细胞表型分析 结果见2。在12 h和24h实验组，CD3+细胞百分率较对照组均有很明显的下降，24h实验组CD8+细胞总数较对照组也有明显下降。
表2 不同表型细胞的百分率在白念珠菌诱 导小鼠胸腺细胞凋亡中的变化(
±s) 分组n
C D3阳性细胞(%)
CD4阳性细胞(%)
CD8阳性细胞(%)
对照组
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77.70±2.08
48.58±1.53
34.05±2.56
实验组
12h
4
64.95±2.13①
41.48±6.42
27.68±2.32
24h
4
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66.75±1.77①
47.08±1.14
22.30±0.42①
①与对照组比较P<0.01
2.4 白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡胸腺组织切片HE染色 对照组及6h 实验组切片的皮质、髓质区分介清楚，均未发现凋亡细胞；而12h实验组可见皮质区许多 细胞核固缩，胞膜不规则，而24h实验组凋亡小体明显可见(图2)。
2.5 胸腺组织切片凋亡细胞原位末端标记法(TUNEL)检测 对照组胸腺组 织 切片凋亡细胞极少，且分布在皮髓质区交界处；6h实验组凋亡细胞较对照组有明显增加， 主要为髓质区和皮髓交界处的增加；12和24h实验组凋亡细胞数增加非常显著，且主要为 皮质区增加(图3)。
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图2 胸腺石蜡切片HE染色 A.对照组：可见大 量具有疏松核的正常胸腺细胞(×400) B.12h实验组：皮质区可见核固缩的胸腺细胞(× 400) C.24h实验组：皮质区可见凋亡小体(×1000)
Fig.2 HE stain of thymic paraffin sectio n A.Control group: numerous normal thymocytes with loose chromatin are visible in the cortex(×400) B. 12h test group: thymocytes with condensed chromatin a re visible mainly in the cortex(×400) C. 24h test group: apoptotic bodies ar e visible mainly in the cortex(×1000)
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图3 胸腺石蜡切片凋亡细胞原位定位检测 A. 对照组：染色阳性的细胞极少见(×400) B.24h实验组：皮质区染色阳性细胞增加明显( ×400)
Fig.3 In situ detection of apoptotic cel l of thymic paraffin section A. Control group: positively stained cells rarely can be seen(×400) B. 24h test group: positively stained cells increased rema rkably in the cortex(×400)
3 讨 论
许多微生物被证实能在体内外诱导胸腺细胞凋亡，但有关白念珠菌诱导小鼠体内胸腺细胞凋 亡的细胞表型分析以及原位凋亡细胞定位迄今国内外未见报导。本研究用4×106白念珠菌 经尾静脉注射入小鼠体内后，经FCM分析发现实验组小鼠胸腺细胞凋亡百分率在6h出现明 显增加，并于12h，18h，24h持续上升。DNA凝胶电泳发现12h实验组出现典型的DNA “梯形 带”，随后18h和24h均有“梯形带”出现。这些结果表明白念珠菌菌血症能诱导小鼠胸 腺 细胞凋亡，且呈时间依赖性。据报道正常胸腺发育过程中，凋亡的主要对象是CD4+CD8 +细胞[8]。微生物(如细菌)感染也引起CD4+CD8+细胞为主的胸腺细胞凋亡 [9]。Aiba证实SEB(葡萄球菌肠毒素B)注射小鼠后引起胸腺CD4+CD8+细胞急剧下 降[10]。本实验结果发现12h和24h实验组CD3+细胞总数较对照组有显著性 下 降(P<0.01)；提示静脉注射白念珠菌，可引起小鼠胸腺CD3+细胞凋亡。据报道，胸腺 浅皮质区双阴性胸腺细胞约为10%，深皮质区双阳性胸腺细胞约为75%，髓质区单阳性胸腺细 胞约为15%[11]。综合胸腺组织切片TUNEL结果分析发现细胞凋亡主要累及深皮质 区的胸腺细胞，故推测凋亡的CD3+细胞主要为CD3+CD4+CD8+细胞。实验还发现CD8 +细胞数量(包括CD4+CD8+和CD4-CD8+细胞)分别于12h和24h均有下降，且24 h 较对照组有显著性下降，结合胸腺切片TUNEL结果发现实验组较对照组髓质区凋亡细胞有轻 微增加，提示除CD3+CD4+CD8+细胞凋亡外，可能CD4-CD8+细胞也发生了凋亡。上 述结果不难看出白念珠菌主要诱导小鼠胸腺CD3+CD4+CD8+细胞凋亡及少量CD4-CD8 +细胞凋亡，其机制还有待进一步研究证实。
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参考文献：
[1] Wang SD, Huang KJ, Lin YS, et al. Sepsis-induced ap optosis of the thymocytes in mice[J]. J Immunol, 1994,152(10):5014-5021.
[2] Darzynkiewicz Z, Gloria J, Li X, et al. Cytometry in cell necrobiolog y: analysis of apoptosis and accidental cell death(necrosis)[J]. Cytometry, 19 97,27:1-20.
[3] Klein RS, Harris CA, Small CB, et al. Oral candiasis in high risk pat ients as the initial manifestation of the acquired immunodeficiency syndrome[J ]. N Eng Med, 1984,311:354-358.
, 百拇医药
[4] Bailliere Tindall. Candida and Candidiasis[M]. 2nd ed, Philadelphia: Od ds FC, 1998:124-135.
[5] 蒋洪敏，韦超凡，陈利玉，等.白念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的研究[J].中华 微生物学和免疫学杂志，1999，19(6)：451-454.
[6] Blasi E, Puliti M, Pitzurra L, et al. Heterogenous secretory response of phagocytes from different anatomical districts to the dimporphic fungus Cand ida albicans[J]. Cell Immunol, 1994,153:239-247.
[7] Natio M, Nagai H, Kawano S, et al. Liposome-encapsulated dichloromet hylene diphosphonate induces macrophage apoptosis in vivo and in vitro[J]. J L eukoc Biol, 1996,60:337-344.
, 百拇医药
[8] 郭爱珍.胸腺细胞的发育与凋亡[J].细胞与分子免疫学杂志，1997，13(2)：61-6 5.
[9] Lin YS, Lei HY, Low TLK, et al. In vivo induction of apoptosis in imm ature thymocytes by staphylococcal enterotoxin B[J]. J Immunol, 1992,149(4):11 56.
[10] Aiba Y, Mazda O, Matsuzaki H, et al. Clonal deletion of thym ic mature T cells induced by staphylococcal enterotoxin B in murine fetal thymus organ culture[J]. Eur J Immunol, 1993,23:815-819.
[11] 余传霖.现代医学免疫学[M].上海：上海医科大学出版社，1998：21-22., http://www.100md.com