补肾醒脑解毒方对单纯疱疹病毒感染神经元的保护作用
作者：蒋士生，贺双腾，蔡光先，何飞舟，李顺祥，朱冰姣，伍参荣
单位：蒋士生，蔡光先，何飞舟，李顺祥，朱冰姣(湖南省中医药研究院 湖南 长沙 410006)；贺双腾(湖南医科大学湘雅医院中西医结合研究所 湖南 长沙 410000)；伍参荣(湖南中医学院 湖南 长沙 410000)
关键词：单纯疮疹病毒I型；海马神经元培养；补肾醒脑解毒方
中国中医基础医学杂志991010 摘 要：目的 观察补肾醒脑解毒中药复方对HSV-1感染神经元的保护作用。方法 用HSV-1感染原代培养大鼠海马神经元造成急性感染与潜伏感染，然后检测中药煎液对神经元细胞病变及子代病毒滴度的影响。结果 培养神经元感染0.1MOI HSV-1后24 h出现病变，6d后70%的细胞溶解死亡。补肾醒脑解毒方对低感染量病毒(0.05MOI)所致细胞病变有较强的抑制作用，并能降低子代病毒滴度。对潜伏感染神经元能维持其正常形态10周以上。结论 补肾醒脑解毒方能维持潜伏感染神经元正常形态，并能减轻HSV-1所致神经元急性溶细胞病变。
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单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)是散发性病毒性脑炎的主要病原[1]。近10年来由于抗病毒药无环乌苷(Acyclovir,ACV)的应用，HSV脑炎的临床治疗有了很大进展，但存活病人仍约有半数遗留有不同程度的神经功能缺陷症状[2]。并且，实验室和临床都已发现HSV易对ACV产生耐药[3]。为从中草药中探寻治疗HSV脑炎尤其是HSV脑炎后遗症的药物，我们根据中医学传统理论与自己的临床经验，选用补肾醒脑解毒中药复方在体外对HSV感染神经元进行了实验研究，现报道如下。
材料与方法
1 大鼠海马神经元培养
按文献方法[4]取怀孕18d的Sprague-Dawley(SD)大鼠，麻醉后活杀，无菌取胎，分离胎鼠大脑，取海马[5]置于Hank's液中，吹打分散成单细胞悬液，按1∶1比例加入含20%小牛血清的DMEM(Dulbe-cco's modified Eagle medium,Gibco产品)液，室温下静置5 min，取中层细胞悬液，移入培养瓶37℃孵育3 h，优先非神经细胞贴壁[6]，然后吸出未贴壁细胞(含神经元90%以上)，用含10%胎牛血清，5 mM葡萄糖，5 ug/ml胰岛素、5 ug/ml转铁蛋白，5U/ml青霉素，50ug/ml链霉素、10mM HEPES的DMEM液(PH7.3)调整细胞密度为0.25×105细胞/ml，接种于25 ug/ml多聚赖氨酸(Sigma产品)液包被的25 ml培养瓶中，每瓶接种细胞悬液4 ml，密闭瓶口，37℃培养。5d后第1次换液，换半液，以后每4 d～5 d换液1次。培养20d的神经元供实验用，并以抗MAP2，(Microtubule-associated protein 2,微管蛋白2)抗体进行免疫染色鉴定[7]。
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2 病毒
HSV-1毒株和Vero细胞由中国预防医学科学院病毒研究所提供。病毒在Vero细胞上增殖，病毒滴度达10-7TCID50/ml时供用。
3 中药煎液制备
补肾醒脑解毒方含熟地、山茱萸、枸杞、人参、五味子、巴戟天、鹿茸、石菖蒲、远志、当归、麝香、金银花、元参、板蓝根等14味中药。由我院中药研究所制剂室根据《中华人民共和国药典》(1995年版)规格选购各药，按细胞培养要求制剂，每ml含生药1 g，使用时以DMEM培养液将药液稀释至所需浓度。
4 培养神经元的HSV-1急性感染与治疗
培养20 d的神经元，加入不同浓度的中药煎液处理24 h，或不加中药煎液处理，然后弃培养液，加入不同感染倍数(Multiplicity of infection,MOI)的HSV-1，37℃吸附30 min，以Hank's液洗去未吸附病毒，再加入含不同浓度中药前液的培养液，置37℃培养。
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5 培养神经元的HSV-1潜伏感染与治疗
培养20d的神经元，弃培养液，加入0.1MOI的HSV-1，37℃吸附30 min，用Hank's液洗细胞3次，加入50 uM ACV(湖北潜江制药厂产品，批号9611022)以抑制病毒复制与细胞病变(Cytopathic effect,CPE)(7)。7 d后撤去ACV，换含不同浓度中药煎液的培养液。同时设正常对照组与感染对照组。
6 细胞病变观察
培养神经元每天在倒置式显微镜下观察，接种病毒后注意CPE出现的时间与范围，记录病变细胞瓶数。并在不同时间点进行摄影记录。
7 子代病毒颗粒滴度的测定
以不同量的HSV-1感染培养神经元，或在中药处理后24 h，或在中药处理前30 min感染不同MOI的HSV-1再经中药处理48 h，然后弃培养液，用Hank's洗涤细胞1次，将培养神经元加入1 ml DMEM液迅速冻融3次，超声破碎细胞5 sec,5000 rpm 4℃下离心10 min，吸取上清，按1∶10比例用DMEM液连续稀释，接种到24 孔培养板上的单层Vero细胞上，每孔接种0.1 ml，每一稀释度接种6孔，病毒吸附后60 min，用Hank's液洗去未吸附病毒，加培养液置37℃培养，每2d换液1次。逐日观察CPE，并记录病变孔数与正常孔数至第8d。根据各稀释度病变孔数与正常孔数按Reed与Muench氏方法计算病毒TCID50，以测定子代病毒颗粒滴度。
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结果
1 感染HSV-1后培养神经元形态学变化
培养20d的正常大鼠海马神经元胞体饱满，树突连成网状(见图1)。MAP2免疫染色显示神经元在90%以上。原代培养大鼠海马神经元可存活5个月以上，并保持形态正常。感染0.1MOI HSV-1后48 h，细胞开始出现病变，表现为病变神经元胞体肿胀、变圆、发亮，如小水泡样，突起断裂、减少，此时尚有50%神经元未出现病变。感染后72h病变继续弥漫，水泡样物增多，有20%神经元胞体溶解，正常神经元已较少见(见图2)。感染后96h约半数神经元胞体溶解，已无正常神经元存在。感染后6d约70%神经元溶解、消失，残存的病变神经元突起断裂、稀少。感染后8d，残存神经元不足10%。培养神经元病变出现的早晚及病变弥漫的快慢与病毒接种量有关，病毒接种量大，CPE出现快，细胞溶解、死亡快。反之则越慢。
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图1 培养20d的正常大鼠海马神经元。×100倍。
(Fig.1 Phase-contrast photomicrograph of fetal rat hippocampal neurons in culture on day 20.×100)
图2 培养20 d的海马神经元经0.1MOI HSV-1感染72h后，胞体肿胀、变圆、发亮，如小水泡样，突起断裂、减少。部分神经元胞体已溶解。×100倍。
(Fig.2 Phase-contrast photomicrograph of cultured neurons at 20 days were infected with 0.1 MOI HSV-1 for 48 hours.The somata of ill neurons were swelling,round,and transparent,like as bilisters,and some were lytic,their neurites were broken and less.×100)
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2 补肾醒脑解毒方对HSV-1急性感染后神经元CPE的影响
在病毒吸附前24 h加入中药煎液，1∶40、1∶80、1∶160浓度的中药煎液对0.05MOI、0.1MOI的HSV-1感染神经元CPE有较强抑制作用。对1.0 MOI HSV-1感染神经元CPE无抑制作用。在病毒吸附30 min后加入中药煎液，仅1∶40、1∶80浓度的中药煎液对0.01MOI和0.05MOI HSV-1感染神经元CPE有微弱抑制作用(见表1)。
3 补肾醒脑解毒方对HSV-1隐性感染的维持作用
病毒吸附30 min后加入50uM ACV可完全抑制0.1 MOI HSV-1所致神经元CPE。7d后撤去ACV换用不同浓度的中药煎液，1∶320以上药物浓度能始终维持神经元的正常形态10W以上而不出现病变。1∶640以下药物浓度则不能持续保持潜伏感染神经元的正常形态，一般在撤去ACV后5d～10d神经元出现病变，病变弥漫较缓慢。不加中药煎液的对照组，一般在撤去ACV后48h内出现CPE，且病变扩展较迅速，撤药后7d左右神经元全部破坏死亡。
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4 补肾醒脑解毒方对神经元内HSV-1复制的影响
由表1可见，在病毒吸附前加入中药处理培养神经元24h，对HSV-1复制具有抑制作用，能降低病毒滴度，在病毒吸附后再加中药，其作用明显减弱。同时，由表1可以看出，较高浓度的中药煎液(1∶40，1∶80，1∶160)虽然能抑制低MOI病毒所致培养神经元CPE，但不能杀灭神经元内的病毒，将培养物感染Vero细胞后，可以看出无论在哪种药物浓度下病毒产量的滴度均不完全消失。由此推测，补肾醒脑解毒方可能通过诱导HSV-1进入潜伏状态而抑制培养神经元出现CPE。
Table 1 Effects of the decoction of Bushen Xingnao Jiedu Fang on
CPE and viral yield in cultured neurons infected with HSV-1 Decoction concn
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(multiple
of dilution)
MOI
(pfu/cell)
Adding decoction before 24h of HSV-1 infection
Adding decoction after 0.5h of HSV-1 infection
no.of CPE/
no.of infected
CPE
(%)
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viral yield(n=4)b
(-lgTCID50/ml,x±s)
no.of CPE/
no.of infected
CEE
(%)
viral yield
(n=4)b
(-lgTCID50
/ml,x±s)
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0.01
0/10
0
0.28±0.02**
0/10
0
0.33±0.03**★
0.05
0/10
0
1.57±0.04**
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0/10
0
2.04±0.08**★CCCCC
0.10
4/10
40
2.96±0.06**
6/10
60
3.21±0.11**★
1.00
10/10
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100
4.25±0.13**
12/12
100
4.55±0.12**★
1∶80
0.01
0/10
0
0.30±0.01**
0/10
0
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0.36±0.05**★
0.05
0/11
0
1.77±0.04**
1/10
10
2.14±0.07**★
0.10
4/12
33
3.16±0.11**
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9/12
75
3.34±0.13*★
1.00
10/10
100
4.49±0.09**
10/10
100
4.74±0.21*★
1∶160
0.01
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0/10
0
0.34±0.02**
4/10
40
0.38±0.04*★
0.05
0/10
0
1.79±0.05**
7/10
70
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2.25±0.10*★
0.10
8/10
80
3.22±0.07**
10/10
100
3.49±0.11*★
1.00
10/10
100
4.58±0.14**
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10/10
100
4.91±0.14*★
1∶320
0.01
1/10
10
0.35±0.04**
5/10
50
0.42±0.02*★
0.05
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4/10
40
1.91±0.06**
9/10
90
2.42±0.09△*
0.10
7/10
70
3.24±0.11**
10/10
100
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3.51±0.16△*
1.00
9/10
90
4.63±0.08**
10/10
100
4.96±0.15△*
1∶640
0.01
3/10
30
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0.41±0.02**
8/10
80
0.43±0.03*▲
0.05
8/10
80
1.96±0.11*
10/10
100
2.47±0.07△*
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0.10
10/10
100
3.39±0.09*
9/9
100
3.70±0.16△*
1.00
10/10
100
4.85±0.14*
10/10
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100
5.22±0.15△*
0a
0.01
8/10
80
0.53±0.02
7/10
70
0.51±0.04
0.05
10/10
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100
2.52±0.07
10/10
100
2.57±0.11
0.10
10/10
100
3.85±0.16
10/10
100
3.87±0.20
1.00
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10/10
100
5.37±0.11
10/10
100
5.34±0.19
a:Infected controls.b:The samples are not the same samples of CPE.△:p>0.05,*:p<0.05,**:p<0.01(compared with infected controls,t test).▲:p>0.05,*:p<0.05(compared with the group of adding decoction before HSV-1 infection with the same MOI,t test).讨 论
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神经元为有丝分裂后细胞，不再分裂增殖。单纯疱疹病毒具有在神经元内呈潜伏状态存在的特性。病毒可长期潜伏在神经元内不复制，不引起细胞病变，但病毒一旦复活，即进行复制，引起神经元破坏。因此，HSV-1在神经元内潜伏状态的维持，即病毒复活的抑制，受到研究者们的重视。本文实验结果显示，补肾醒脑解毒中药复方能降低感染神经元内HSV-1的滴度，抑制感染神经元CPE出现，较长时间维持HSV-1潜伏感染神经元的正常形态，这一作用与神经生长因子抑制HSV复活，维持感染神经元正常存活的作用[8]十分相似。
补肾醒脑解毒方由地黄饮子、拱辰丹、四妙勇安汤三方加减组成。地黄饮子是中医学治疗偏瘫、失语的传统方剂。补肾即滋补强壮之意，补肾醒脑解毒方可能通过滋补成分增加了对培养神经元的营养作用，从而增强了神经元对病毒的抵抗力，使病毒进入潜伏状态，以维持感染神经元的正常形态与存活。
HSV-1在神经元内的复制机制与在Vero细胞内的复制机制有所不同，需要一系列附属辅助基因表达产物的帮助。阻断病毒即早基因α、β基因的表达即可使病毒进入潜伏状态[9、10]。在Vero细胞等传代细胞中，病毒DNA复制不需其辅助基因产物的支持，细胞自身的分裂增殖为病毒DNA复制提供了条件。因此，HSV-1在Vero细胞上引起的急性溶细胞病变比在培养神经元上出现得更快、更早[9]。运用神经生长因子可抑制HSV-1在培养神经元内的复制，延长感染神经元的存活[8]，这与神经生长因子对神经元的营养支持有关。因此，我们认为补肾醒脑解毒方维持HSV-1感染神经元的正常形态，也可能在于药物中的营养成分增强了神经元的功能与存活能力。
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① 国家自然科学基金资助项目(39670870)。
参考文献
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(收稿日期 1999—05—11 修回日期 1999—06—03), 百拇医药
单位：蒋士生，蔡光先，何飞舟，李顺祥，朱冰姣(湖南省中医药研究院 湖南 长沙 410006)；贺双腾(湖南医科大学湘雅医院中西医结合研究所 湖南 长沙 410000)；伍参荣(湖南中医学院 湖南 长沙 410000)
关键词：单纯疮疹病毒I型；海马神经元培养；补肾醒脑解毒方
中国中医基础医学杂志991010 摘 要：目的 观察补肾醒脑解毒中药复方对HSV-1感染神经元的保护作用。方法 用HSV-1感染原代培养大鼠海马神经元造成急性感染与潜伏感染，然后检测中药煎液对神经元细胞病变及子代病毒滴度的影响。结果 培养神经元感染0.1MOI HSV-1后24 h出现病变，6d后70%的细胞溶解死亡。补肾醒脑解毒方对低感染量病毒(0.05MOI)所致细胞病变有较强的抑制作用，并能降低子代病毒滴度。对潜伏感染神经元能维持其正常形态10周以上。结论 补肾醒脑解毒方能维持潜伏感染神经元正常形态，并能减轻HSV-1所致神经元急性溶细胞病变。
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单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)是散发性病毒性脑炎的主要病原[1]。近10年来由于抗病毒药无环乌苷(Acyclovir,ACV)的应用，HSV脑炎的临床治疗有了很大进展，但存活病人仍约有半数遗留有不同程度的神经功能缺陷症状[2]。并且，实验室和临床都已发现HSV易对ACV产生耐药[3]。为从中草药中探寻治疗HSV脑炎尤其是HSV脑炎后遗症的药物，我们根据中医学传统理论与自己的临床经验，选用补肾醒脑解毒中药复方在体外对HSV感染神经元进行了实验研究，现报道如下。
材料与方法
1 大鼠海马神经元培养
按文献方法[4]取怀孕18d的Sprague-Dawley(SD)大鼠，麻醉后活杀，无菌取胎，分离胎鼠大脑，取海马[5]置于Hank's液中，吹打分散成单细胞悬液，按1∶1比例加入含20%小牛血清的DMEM(Dulbe-cco's modified Eagle medium,Gibco产品)液，室温下静置5 min，取中层细胞悬液，移入培养瓶37℃孵育3 h，优先非神经细胞贴壁[6]，然后吸出未贴壁细胞(含神经元90%以上)，用含10%胎牛血清，5 mM葡萄糖，5 ug/ml胰岛素、5 ug/ml转铁蛋白，5U/ml青霉素，50ug/ml链霉素、10mM HEPES的DMEM液(PH7.3)调整细胞密度为0.25×105细胞/ml，接种于25 ug/ml多聚赖氨酸(Sigma产品)液包被的25 ml培养瓶中，每瓶接种细胞悬液4 ml，密闭瓶口，37℃培养。5d后第1次换液，换半液，以后每4 d～5 d换液1次。培养20d的神经元供实验用，并以抗MAP2，(Microtubule-associated protein 2,微管蛋白2)抗体进行免疫染色鉴定[7]。
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2 病毒
HSV-1毒株和Vero细胞由中国预防医学科学院病毒研究所提供。病毒在Vero细胞上增殖，病毒滴度达10-7TCID50/ml时供用。
3 中药煎液制备
补肾醒脑解毒方含熟地、山茱萸、枸杞、人参、五味子、巴戟天、鹿茸、石菖蒲、远志、当归、麝香、金银花、元参、板蓝根等14味中药。由我院中药研究所制剂室根据《中华人民共和国药典》(1995年版)规格选购各药，按细胞培养要求制剂，每ml含生药1 g，使用时以DMEM培养液将药液稀释至所需浓度。
4 培养神经元的HSV-1急性感染与治疗
培养20 d的神经元，加入不同浓度的中药煎液处理24 h，或不加中药煎液处理，然后弃培养液，加入不同感染倍数(Multiplicity of infection,MOI)的HSV-1，37℃吸附30 min，以Hank's液洗去未吸附病毒，再加入含不同浓度中药前液的培养液，置37℃培养。
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5 培养神经元的HSV-1潜伏感染与治疗
培养20d的神经元，弃培养液，加入0.1MOI的HSV-1，37℃吸附30 min，用Hank's液洗细胞3次，加入50 uM ACV(湖北潜江制药厂产品，批号9611022)以抑制病毒复制与细胞病变(Cytopathic effect,CPE)(7)。7 d后撤去ACV，换含不同浓度中药煎液的培养液。同时设正常对照组与感染对照组。
6 细胞病变观察
培养神经元每天在倒置式显微镜下观察，接种病毒后注意CPE出现的时间与范围，记录病变细胞瓶数。并在不同时间点进行摄影记录。
7 子代病毒颗粒滴度的测定
以不同量的HSV-1感染培养神经元，或在中药处理后24 h，或在中药处理前30 min感染不同MOI的HSV-1再经中药处理48 h，然后弃培养液，用Hank's洗涤细胞1次，将培养神经元加入1 ml DMEM液迅速冻融3次，超声破碎细胞5 sec,5000 rpm 4℃下离心10 min，吸取上清，按1∶10比例用DMEM液连续稀释，接种到24 孔培养板上的单层Vero细胞上，每孔接种0.1 ml，每一稀释度接种6孔，病毒吸附后60 min，用Hank's液洗去未吸附病毒，加培养液置37℃培养，每2d换液1次。逐日观察CPE，并记录病变孔数与正常孔数至第8d。根据各稀释度病变孔数与正常孔数按Reed与Muench氏方法计算病毒TCID50，以测定子代病毒颗粒滴度。
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结果
1 感染HSV-1后培养神经元形态学变化
培养20d的正常大鼠海马神经元胞体饱满，树突连成网状(见图1)。MAP2免疫染色显示神经元在90%以上。原代培养大鼠海马神经元可存活5个月以上，并保持形态正常。感染0.1MOI HSV-1后48 h，细胞开始出现病变，表现为病变神经元胞体肿胀、变圆、发亮，如小水泡样，突起断裂、减少，此时尚有50%神经元未出现病变。感染后72h病变继续弥漫，水泡样物增多，有20%神经元胞体溶解，正常神经元已较少见(见图2)。感染后96h约半数神经元胞体溶解，已无正常神经元存在。感染后6d约70%神经元溶解、消失，残存的病变神经元突起断裂、稀少。感染后8d，残存神经元不足10%。培养神经元病变出现的早晚及病变弥漫的快慢与病毒接种量有关，病毒接种量大，CPE出现快，细胞溶解、死亡快。反之则越慢。
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图1 培养20d的正常大鼠海马神经元。×100倍。
(Fig.1 Phase-contrast photomicrograph of fetal rat hippocampal neurons in culture on day 20.×100)
图2 培养20 d的海马神经元经0.1MOI HSV-1感染72h后，胞体肿胀、变圆、发亮，如小水泡样，突起断裂、减少。部分神经元胞体已溶解。×100倍。
(Fig.2 Phase-contrast photomicrograph of cultured neurons at 20 days were infected with 0.1 MOI HSV-1 for 48 hours.The somata of ill neurons were swelling,round,and transparent,like as bilisters,and some were lytic,their neurites were broken and less.×100)
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2 补肾醒脑解毒方对HSV-1急性感染后神经元CPE的影响
在病毒吸附前24 h加入中药煎液，1∶40、1∶80、1∶160浓度的中药煎液对0.05MOI、0.1MOI的HSV-1感染神经元CPE有较强抑制作用。对1.0 MOI HSV-1感染神经元CPE无抑制作用。在病毒吸附30 min后加入中药煎液，仅1∶40、1∶80浓度的中药煎液对0.01MOI和0.05MOI HSV-1感染神经元CPE有微弱抑制作用(见表1)。
3 补肾醒脑解毒方对HSV-1隐性感染的维持作用
病毒吸附30 min后加入50uM ACV可完全抑制0.1 MOI HSV-1所致神经元CPE。7d后撤去ACV换用不同浓度的中药煎液，1∶320以上药物浓度能始终维持神经元的正常形态10W以上而不出现病变。1∶640以下药物浓度则不能持续保持潜伏感染神经元的正常形态，一般在撤去ACV后5d～10d神经元出现病变，病变弥漫较缓慢。不加中药煎液的对照组，一般在撤去ACV后48h内出现CPE，且病变扩展较迅速，撤药后7d左右神经元全部破坏死亡。
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4 补肾醒脑解毒方对神经元内HSV-1复制的影响
由表1可见，在病毒吸附前加入中药处理培养神经元24h，对HSV-1复制具有抑制作用，能降低病毒滴度，在病毒吸附后再加中药，其作用明显减弱。同时，由表1可以看出，较高浓度的中药煎液(1∶40，1∶80，1∶160)虽然能抑制低MOI病毒所致培养神经元CPE，但不能杀灭神经元内的病毒，将培养物感染Vero细胞后，可以看出无论在哪种药物浓度下病毒产量的滴度均不完全消失。由此推测，补肾醒脑解毒方可能通过诱导HSV-1进入潜伏状态而抑制培养神经元出现CPE。
Table 1 Effects of the decoction of Bushen Xingnao Jiedu Fang on
CPE and viral yield in cultured neurons infected with HSV-1 Decoction concn
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(multiple
of dilution)
MOI
(pfu/cell)
Adding decoction before 24h of HSV-1 infection
Adding decoction after 0.5h of HSV-1 infection
no.of CPE/
no.of infected
CPE
(%)
, http://www.100md.com
viral yield(n=4)b
(-lgTCID50/ml,x±s)
no.of CPE/
no.of infected
CEE
(%)
viral yield
(n=4)b
(-lgTCID50
/ml,x±s)
, http://www.100md.com 1∶40
0.01
0/10
0
0.28±0.02**
0/10
0
0.33±0.03**★
0.05
0/10
0
1.57±0.04**
, 百拇医药
0/10
0
2.04±0.08**★CCCCC
0.10
4/10
40
2.96±0.06**
6/10
60
3.21±0.11**★
1.00
10/10
, 百拇医药
100
4.25±0.13**
12/12
100
4.55±0.12**★
1∶80
0.01
0/10
0
0.30±0.01**
0/10
0
, http://www.100md.com
0.36±0.05**★
0.05
0/11
0
1.77±0.04**
1/10
10
2.14±0.07**★
0.10
4/12
33
3.16±0.11**
, 百拇医药
9/12
75
3.34±0.13*★
1.00
10/10
100
4.49±0.09**
10/10
100
4.74±0.21*★
1∶160
0.01
, 百拇医药
0/10
0
0.34±0.02**
4/10
40
0.38±0.04*★
0.05
0/10
0
1.79±0.05**
7/10
70
, 百拇医药
2.25±0.10*★
0.10
8/10
80
3.22±0.07**
10/10
100
3.49±0.11*★
1.00
10/10
100
4.58±0.14**
, http://www.100md.com
10/10
100
4.91±0.14*★
1∶320
0.01
1/10
10
0.35±0.04**
5/10
50
0.42±0.02*★
0.05
, http://www.100md.com
4/10
40
1.91±0.06**
9/10
90
2.42±0.09△*
0.10
7/10
70
3.24±0.11**
10/10
100
, 百拇医药
3.51±0.16△*
1.00
9/10
90
4.63±0.08**
10/10
100
4.96±0.15△*
1∶640
0.01
3/10
30
, 百拇医药
0.41±0.02**
8/10
80
0.43±0.03*▲
0.05
8/10
80
1.96±0.11*
10/10
100
2.47±0.07△*
, 百拇医药
0.10
10/10
100
3.39±0.09*
9/9
100
3.70±0.16△*
1.00
10/10
100
4.85±0.14*
10/10
, http://www.100md.com
100
5.22±0.15△*
0a
0.01
8/10
80
0.53±0.02
7/10
70
0.51±0.04
0.05
10/10
, 百拇医药
100
2.52±0.07
10/10
100
2.57±0.11
0.10
10/10
100
3.85±0.16
10/10
100
3.87±0.20
1.00
, 百拇医药
10/10
100
5.37±0.11
10/10
100
5.34±0.19
a:Infected controls.b:The samples are not the same samples of CPE.△:p>0.05,*:p<0.05,**:p<0.01(compared with infected controls,t test).▲:p>0.05,*:p<0.05(compared with the group of adding decoction before HSV-1 infection with the same MOI,t test).讨 论
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神经元为有丝分裂后细胞，不再分裂增殖。单纯疱疹病毒具有在神经元内呈潜伏状态存在的特性。病毒可长期潜伏在神经元内不复制，不引起细胞病变，但病毒一旦复活，即进行复制，引起神经元破坏。因此，HSV-1在神经元内潜伏状态的维持，即病毒复活的抑制，受到研究者们的重视。本文实验结果显示，补肾醒脑解毒中药复方能降低感染神经元内HSV-1的滴度，抑制感染神经元CPE出现，较长时间维持HSV-1潜伏感染神经元的正常形态，这一作用与神经生长因子抑制HSV复活，维持感染神经元正常存活的作用[8]十分相似。
补肾醒脑解毒方由地黄饮子、拱辰丹、四妙勇安汤三方加减组成。地黄饮子是中医学治疗偏瘫、失语的传统方剂。补肾即滋补强壮之意，补肾醒脑解毒方可能通过滋补成分增加了对培养神经元的营养作用，从而增强了神经元对病毒的抵抗力，使病毒进入潜伏状态，以维持感染神经元的正常形态与存活。
HSV-1在神经元内的复制机制与在Vero细胞内的复制机制有所不同，需要一系列附属辅助基因表达产物的帮助。阻断病毒即早基因α、β基因的表达即可使病毒进入潜伏状态[9、10]。在Vero细胞等传代细胞中，病毒DNA复制不需其辅助基因产物的支持，细胞自身的分裂增殖为病毒DNA复制提供了条件。因此，HSV-1在Vero细胞上引起的急性溶细胞病变比在培养神经元上出现得更快、更早[9]。运用神经生长因子可抑制HSV-1在培养神经元内的复制，延长感染神经元的存活[8]，这与神经生长因子对神经元的营养支持有关。因此，我们认为补肾醒脑解毒方维持HSV-1感染神经元的正常形态，也可能在于药物中的营养成分增强了神经元的功能与存活能力。
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① 国家自然科学基金资助项目(39670870)。
参考文献
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(收稿日期 1999—05—11 修回日期 1999—06—03), 百拇医药