草绿色链球菌A19抑制脑膜炎双球菌生长的机理研究
作者：邓金华 卫德安 张志坤 李桂银 John E Moore
单位：邓金华 卫德安 张志坤 李桂银 河北省卫生防疫站， 河北 石家庄 071000；John E Moore 英国贝尔法斯特医院
关键词：抑菌机理；草绿色链球菌；脑膜炎双球菌
疾病控制杂志990109
【摘要】 目的 探索草绿色链球菌A19抑制脑膜炎双球菌生长的机理。方法 采用半定量接种，活菌与死菌不同生长阶段的草绿色链球菌A19抑菌效果比较的方法。 结果 抑制作用由草绿色链球菌A19的代谢产物引起，且稳定持久。结论 揭示从草绿色链球菌A19的代谢产物中提取抑菌成分的可能性。
【中图分类号】 Q939.11； Q934 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)01-0023-02
, http://www.100md.com
Study on the mechanism for streptococcus viridans A19's inhibiting the growth of neisseria meaningitidis
Deng Jinhua, Wei Dean, Zhang Zhikun, Li Guiyin， John E Moore Hebei
Provincial Centers for Disease Prevention and Control, Shijiazhuang 071000, China
【Abstract】 Objective To explore the mechanism for streptococcus viridans A19's inhibiting the growth of neisseria menigitidis A19. Methods Incubacted living or dead streptococcus viridans A19 by semi-qualtity, specific analysis effection of anti-bacteria in the different growth stages. Result The inhibitory activity was caused by metabolite of streptococcus viridans A19 and was stable. Conclusion It was proposed that a chemical substance could be extracted from the metabolite and used in clinical practice.
, 百拇医药
【Key words】 streptococcus viridans; neisseria meningitidis; inhibition mechanism
咽部正常菌能抑制脑膜炎双球菌的生长[1]。我们以前的研究结果表明，从正常人咽部分离出的草绿色链球菌A19除对脑膜炎双球菌抑制作用外，还对绿脓杆菌、伤寒杆菌、乙酸钙不动杆菌等有抑制作用[2]。由于它有较广泛的抑菌谱，我们设想，如果这种抑菌作用是由于它的菌体或代谢产物中含有某种抑菌物质，则有可能提取这种抑菌物质应用于临床。而对它的抑菌机理的研究，则有助于探索这种可能性。为此，我们选用了脑膜炎双球菌标准致病株A29019作靶菌，对草绿色链球菌A19的抑菌机理进行了研究。现报告如下。
1 材料与方法
实验一：脑膜炎双球菌A29019半定量接种的方法。
, 百拇医药
(1)将已经纯化的草绿色链球菌A19接种到1号巧克力平板上，成宽约1 cm贯穿平板中央的接种带；将已经纯化的脑膜炎双球菌A29019转种到2号巧克力血平板。在CO2环境37℃培养24 h。
(2)用铂金环刮取2号平板上的菌苔2 mm2左右，在3号巧克力血平板上按三步法划开，这样，单位面积2号平板菌苔、3号平板第一、第二、第三划线区域的脑膜炎球菌菌量依次减少。
(3)分别在2号平板菌苔处、3号平板的第一、第二、第三划线区域0.5 cm×0.5 cm范围内用铂金环刮菌，按垂直于草绿色链球菌A19接种带的方向划线接种到1号平板。CO2环境下37℃培养24 h后观察结果。
实验二：比较草绿色链球菌A19活菌与死菌抑菌作用的方法。
在巧克力血平板上接种草绿色球菌A19，成宽约1 cm贯穿平板中央的接种带，37℃培养24 h后，用一已消毒的黑色厚纸板盖在平板上方，盖住半截草绿色链球菌接种带，然后将平板连同厚纸板一起放在紫外线灯下0.5 m处照射1 h，这样厚板遮盖下的链球菌将不被杀死，而未遮盖的链球菌接种带上的细菌将被紫外线照射致死。为了验证这一点，照射后分别在纸板遮盖区和非遮盖区的链球菌带上取菌转种到另一巧克力平板，37℃培养24 h后观察是否能转出菌落。
, 百拇医药
在厚纸板遮盖区和非遮盖区的链球菌接种带上转菌后，再按垂直于接种带的方向分别在这两个区域接种脑膜炎双球菌A29019，在CO2环境下37℃培养24 h，观察这两个区域链球菌的抑菌作用。
实验三：比较不同生长阶段的草绿色链球菌A19的抑菌作用的方法。
在巧克力血平板上转种宽约1 cm的链球菌A19带，随后立即在接种带的一端按垂直于接种带的方向划线接种脑膜炎双球菌A29019，24 h、48 h、96 h后在链球菌接种带的不同区域按同样方法接种脑膜炎双球菌A29019，每次接种脑膜炎双球菌后，将平板放在CO2环境37℃进行培养，在最后一次接种脑膜炎球菌后的24 h观察结果。
2 实验结果
2.1 实验一的结果 在第一划线区域取菌的抑菌效果最好：链球菌接种带上无脑膜炎球菌菌苔，链球菌接种带两侧有连续的菌苔；从脑膜炎球菌原始菌苔取菌划线的结果则为：链球菌接种带上及两侧均有连续的脑膜炎球菌菌苔，也就是说，脑膜炎球菌菌量大时，草绿色链球菌A19不能抑制其生长和繁殖；从第二、三划线区域取菌划线的结果呈现不连续的菌苔，不便判断抑菌效果。
, 百拇医药
2.2 实验二的结果 紫外线照射平板后，转种实验结果为，在黑色厚纸板遮盖下的链球菌接种带出现链球菌菌落，而非遮盖区链球菌接种带未出现任何菌落。表明紫外线照射造成死菌的方法是可靠的，黑色厚纸板能使其下面的菌落免受紫外线照射致死。
在纸板遮盖区和非遮盖区链球菌接种带划线接种脑膜炎球菌并培养24 h后，纸板遮盖区链球菌接种带两侧呈现连续的脑膜炎球菌菌苔，而接种带上无菌苔；在非遮盖区则呈现垂直贯穿链球菌接种带的脑膜炎球菌连续菌苔。说明，只有活的草绿色链球菌A19才能抑制脑膜炎球菌的生长，死菌无效。
2.3 实验三的结果 与脑膜炎球菌同时转种的链球菌及已培养24 h的链球菌抑制效果最好，培养48 h后效果次之，培养96 h后效果最差。
2.4 草绿色链球菌A19抑菌作用的稳定性 从1992年1月3日至1996年11月28日将近5年的时间内，将此菌反复保存及转种20余次，用琼脂铺层法和本文描述的方法均表明，草绿色链球菌A19对脑膜炎球菌A29019有抑制作用。说明这种抑菌作用稳定，不会因保存与转种而丧失。
, 百拇医药
3 讨论
一种细菌对另一种细菌的抑制作用可能通过三种机理实现：①一种细菌的代谢产物抑制另一种细菌的生长(简称“代谢产物”机理)；②一种细菌死亡后的菌体成分抑制另一种细菌的生长(简称“菌体成分”机理)；③一种细菌摄取某些必需营养成分的能力强于另一种细菌，而使另一种细菌因得不到某些必需营养而无法生长繁殖(简称“竞争营养”机理)。
实验二的结果表明，草绿色链球菌A19死菌无抑菌作用，说明“菌体成分”机理不是草绿色链球菌A19抑制脑膜炎双球菌A29019的机理。
实验一和实验三的结果都不支持“竞争营养”机理。根据“竞争营养”机理，草绿色链球菌摄取了接种带上的必需营养成分后，再接种脑膜炎双球菌A29019，无论其接种量有多大，都无法生长繁殖成菌苔，与实验一的结果相矛盾。另外，根据“竞争营养”机理，草绿色链球菌培养时间越长，摄取营养成分应该越彻底，抑菌作用应该越强，这与实验三的结果相矛盾。
, http://www.100md.com
而“代谢产物”机理可以解释三个实验的结果。对实验一结果的解释：代谢产物量与被抑制菌菌量需一定比例才能发挥作用，有限的代谢产物肯定不能抑制大量细菌的生长；对实验二结果的解释：死菌不能产生新的代谢产物，原先的代谢产物则已扩散到培养基其它部分，在链球菌接种带达不到足够的浓度而难以抑制脑膜炎球菌的生长；对实验三结果的解释：随着草绿色链球菌培养时间的延长，细菌进入衰亡期，代谢产物不再增加，而且早期产生的代谢产物还会扩散到接种带以外的区域，使接种带区域有效成分的浓度降低，从而影响其对脑膜炎球菌的抑制作用。
根据以上分析认为，草绿色链球菌A19对脑膜炎双球菌A29019的抑制作用是通过前者的代谢产物来实现的。实验结果还显示，这种抑菌作用是稳定持久的。我们以前的研究结果表明，草绿色链球菌A19对多种致病菌和条件致病菌有抑制作用。因此，我们认为，“从草绿色链球菌A19代谢产物中提取有效抑菌成分应用于临床”是可能的。但起抑菌作用的代谢产物究竟是什么成分，尚有待进一步研究。
, 百拇医药 基金项目：河北省卫生厅重点课题资助项目(95041)
作者简介：邓金华，男，33岁，硕士，副主任医师
参考文献
[1] Filice GA. Risk of group A meningococcal disease: bacterial interference and crossreactive bacteria among mucosal flora. J Clin Microbiol, 1985，22(2):152～156.
[2] 邓金华，张志坤，李月平，等. 草绿色链球菌A19对其它细菌的抑制作用.中国微生态学杂志， 1995，7(3)：58.
收稿日期 1998-03-18, http://www.100md.com
单位：邓金华 卫德安 张志坤 李桂银 河北省卫生防疫站， 河北 石家庄 071000；John E Moore 英国贝尔法斯特医院
关键词：抑菌机理；草绿色链球菌；脑膜炎双球菌
疾病控制杂志990109
【摘要】 目的 探索草绿色链球菌A19抑制脑膜炎双球菌生长的机理。方法 采用半定量接种，活菌与死菌不同生长阶段的草绿色链球菌A19抑菌效果比较的方法。 结果 抑制作用由草绿色链球菌A19的代谢产物引起，且稳定持久。结论 揭示从草绿色链球菌A19的代谢产物中提取抑菌成分的可能性。
【中图分类号】 Q939.11； Q934 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)01-0023-02
, http://www.100md.com
Study on the mechanism for streptococcus viridans A19's inhibiting the growth of neisseria meaningitidis
Deng Jinhua, Wei Dean, Zhang Zhikun, Li Guiyin， John E Moore Hebei
Provincial Centers for Disease Prevention and Control, Shijiazhuang 071000, China
【Abstract】 Objective To explore the mechanism for streptococcus viridans A19's inhibiting the growth of neisseria menigitidis A19. Methods Incubacted living or dead streptococcus viridans A19 by semi-qualtity, specific analysis effection of anti-bacteria in the different growth stages. Result The inhibitory activity was caused by metabolite of streptococcus viridans A19 and was stable. Conclusion It was proposed that a chemical substance could be extracted from the metabolite and used in clinical practice.
, 百拇医药
【Key words】 streptococcus viridans; neisseria meningitidis; inhibition mechanism
咽部正常菌能抑制脑膜炎双球菌的生长[1]。我们以前的研究结果表明，从正常人咽部分离出的草绿色链球菌A19除对脑膜炎双球菌抑制作用外，还对绿脓杆菌、伤寒杆菌、乙酸钙不动杆菌等有抑制作用[2]。由于它有较广泛的抑菌谱，我们设想，如果这种抑菌作用是由于它的菌体或代谢产物中含有某种抑菌物质，则有可能提取这种抑菌物质应用于临床。而对它的抑菌机理的研究，则有助于探索这种可能性。为此，我们选用了脑膜炎双球菌标准致病株A29019作靶菌，对草绿色链球菌A19的抑菌机理进行了研究。现报告如下。
1 材料与方法
实验一：脑膜炎双球菌A29019半定量接种的方法。
, 百拇医药
(1)将已经纯化的草绿色链球菌A19接种到1号巧克力平板上，成宽约1 cm贯穿平板中央的接种带；将已经纯化的脑膜炎双球菌A29019转种到2号巧克力血平板。在CO2环境37℃培养24 h。
(2)用铂金环刮取2号平板上的菌苔2 mm2左右，在3号巧克力血平板上按三步法划开，这样，单位面积2号平板菌苔、3号平板第一、第二、第三划线区域的脑膜炎球菌菌量依次减少。
(3)分别在2号平板菌苔处、3号平板的第一、第二、第三划线区域0.5 cm×0.5 cm范围内用铂金环刮菌，按垂直于草绿色链球菌A19接种带的方向划线接种到1号平板。CO2环境下37℃培养24 h后观察结果。
实验二：比较草绿色链球菌A19活菌与死菌抑菌作用的方法。
在巧克力血平板上接种草绿色球菌A19，成宽约1 cm贯穿平板中央的接种带，37℃培养24 h后，用一已消毒的黑色厚纸板盖在平板上方，盖住半截草绿色链球菌接种带，然后将平板连同厚纸板一起放在紫外线灯下0.5 m处照射1 h，这样厚板遮盖下的链球菌将不被杀死，而未遮盖的链球菌接种带上的细菌将被紫外线照射致死。为了验证这一点，照射后分别在纸板遮盖区和非遮盖区的链球菌带上取菌转种到另一巧克力平板，37℃培养24 h后观察是否能转出菌落。
, 百拇医药
在厚纸板遮盖区和非遮盖区的链球菌接种带上转菌后，再按垂直于接种带的方向分别在这两个区域接种脑膜炎双球菌A29019，在CO2环境下37℃培养24 h，观察这两个区域链球菌的抑菌作用。
实验三：比较不同生长阶段的草绿色链球菌A19的抑菌作用的方法。
在巧克力血平板上转种宽约1 cm的链球菌A19带，随后立即在接种带的一端按垂直于接种带的方向划线接种脑膜炎双球菌A29019，24 h、48 h、96 h后在链球菌接种带的不同区域按同样方法接种脑膜炎双球菌A29019，每次接种脑膜炎双球菌后，将平板放在CO2环境37℃进行培养，在最后一次接种脑膜炎球菌后的24 h观察结果。
2 实验结果
2.1 实验一的结果 在第一划线区域取菌的抑菌效果最好：链球菌接种带上无脑膜炎球菌菌苔，链球菌接种带两侧有连续的菌苔；从脑膜炎球菌原始菌苔取菌划线的结果则为：链球菌接种带上及两侧均有连续的脑膜炎球菌菌苔，也就是说，脑膜炎球菌菌量大时，草绿色链球菌A19不能抑制其生长和繁殖；从第二、三划线区域取菌划线的结果呈现不连续的菌苔，不便判断抑菌效果。
, 百拇医药
2.2 实验二的结果 紫外线照射平板后，转种实验结果为，在黑色厚纸板遮盖下的链球菌接种带出现链球菌菌落，而非遮盖区链球菌接种带未出现任何菌落。表明紫外线照射造成死菌的方法是可靠的，黑色厚纸板能使其下面的菌落免受紫外线照射致死。
在纸板遮盖区和非遮盖区链球菌接种带划线接种脑膜炎球菌并培养24 h后，纸板遮盖区链球菌接种带两侧呈现连续的脑膜炎球菌菌苔，而接种带上无菌苔；在非遮盖区则呈现垂直贯穿链球菌接种带的脑膜炎球菌连续菌苔。说明，只有活的草绿色链球菌A19才能抑制脑膜炎球菌的生长，死菌无效。
2.3 实验三的结果 与脑膜炎球菌同时转种的链球菌及已培养24 h的链球菌抑制效果最好，培养48 h后效果次之，培养96 h后效果最差。
2.4 草绿色链球菌A19抑菌作用的稳定性 从1992年1月3日至1996年11月28日将近5年的时间内，将此菌反复保存及转种20余次，用琼脂铺层法和本文描述的方法均表明，草绿色链球菌A19对脑膜炎球菌A29019有抑制作用。说明这种抑菌作用稳定，不会因保存与转种而丧失。
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3 讨论
一种细菌对另一种细菌的抑制作用可能通过三种机理实现：①一种细菌的代谢产物抑制另一种细菌的生长(简称“代谢产物”机理)；②一种细菌死亡后的菌体成分抑制另一种细菌的生长(简称“菌体成分”机理)；③一种细菌摄取某些必需营养成分的能力强于另一种细菌，而使另一种细菌因得不到某些必需营养而无法生长繁殖(简称“竞争营养”机理)。
实验二的结果表明，草绿色链球菌A19死菌无抑菌作用，说明“菌体成分”机理不是草绿色链球菌A19抑制脑膜炎双球菌A29019的机理。
实验一和实验三的结果都不支持“竞争营养”机理。根据“竞争营养”机理，草绿色链球菌摄取了接种带上的必需营养成分后，再接种脑膜炎双球菌A29019，无论其接种量有多大，都无法生长繁殖成菌苔，与实验一的结果相矛盾。另外，根据“竞争营养”机理，草绿色链球菌培养时间越长，摄取营养成分应该越彻底，抑菌作用应该越强，这与实验三的结果相矛盾。
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而“代谢产物”机理可以解释三个实验的结果。对实验一结果的解释：代谢产物量与被抑制菌菌量需一定比例才能发挥作用，有限的代谢产物肯定不能抑制大量细菌的生长；对实验二结果的解释：死菌不能产生新的代谢产物，原先的代谢产物则已扩散到培养基其它部分，在链球菌接种带达不到足够的浓度而难以抑制脑膜炎球菌的生长；对实验三结果的解释：随着草绿色链球菌培养时间的延长，细菌进入衰亡期，代谢产物不再增加，而且早期产生的代谢产物还会扩散到接种带以外的区域，使接种带区域有效成分的浓度降低，从而影响其对脑膜炎球菌的抑制作用。
根据以上分析认为，草绿色链球菌A19对脑膜炎双球菌A29019的抑制作用是通过前者的代谢产物来实现的。实验结果还显示，这种抑菌作用是稳定持久的。我们以前的研究结果表明，草绿色链球菌A19对多种致病菌和条件致病菌有抑制作用。因此，我们认为，“从草绿色链球菌A19代谢产物中提取有效抑菌成分应用于临床”是可能的。但起抑菌作用的代谢产物究竟是什么成分，尚有待进一步研究。
, 百拇医药 基金项目：河北省卫生厅重点课题资助项目(95041)
作者简介：邓金华，男，33岁，硕士，副主任医师
参考文献
[1] Filice GA. Risk of group A meningococcal disease: bacterial interference and crossreactive bacteria among mucosal flora. J Clin Microbiol, 1985，22(2):152～156.
[2] 邓金华，张志坤，李月平，等. 草绿色链球菌A19对其它细菌的抑制作用.中国微生态学杂志， 1995，7(3)：58.
收稿日期 1998-03-18, http://www.100md.com