小鼠单离前庭神经节细胞培养和形态学观察
作者：杨仕明 姜泗长 杨伟炎 顾瑞 山下敏夫
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科 杨仕明 姜泗长 杨伟炎 顾瑞日本关西医科大学耳鼻咽喉科 山下敏夫
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志990621 本研究建立前庭神经节细胞(vestibular ganglion cells, VGC)的分离及体外培养技术，并用免疫组化染色观察和识别培养的神经细胞。
一、材料和方法
1.细胞分离和培养：出生后1～5 d的ICR/ICR 小鼠100只，由日本关西医科大学实验动物中心提供。动物处死后将颞骨置于4℃ Earle缓冲盐水液 (earle buffered saline solution，EBSS； GBICO，美国)，自内耳道摘取前庭神经节，37℃下酶消化25 min，EBSS冲洗2次，加入培养液。单离的细胞被接种到硅胶培养皿底部的玻片上，培养皿体积约200 μL。玻片预先涂覆50 μg/ml的鼠尾胶原(5 μg/cm2；Becton Dickinson Labware，美国) 备用。于免疫组化染色时，细胞被接种于双槽塑料培养皿(Lab-Tak，美国)，置于37℃ 5% CO2 孵箱中培养。培养液组成：27% Eagle minimum essential medium (GIBCO，美国 )，33% EBSS, 40%马血清(GIBCO，美国)和100 IU/ml青霉素(Sigma，美国)。葡萄糖最终浓度6.6 g/L。培养液中马血清渐减 (每次换液减少10%)而加入等量人血清。
, 百拇医药
2.免疫细胞化学染色：培养7～14 d将标本置于4%甲醛固定30 min。采用Rabejac等[1] 的免疫荧光法和ABC法染色。一抗为抗神经微丝(neuroflia-ments，NF)抗体(Sigma，美国)。
免疫荧光法：标本经15%羊血清和0.3% Triton X-100 (PBS稀释)处理60 min，加入一抗(1∶250)孵育2 h后，滴加荧光素标记的羊抗兔IgG (1∶50；Jackson Immunoresearch，美国 )孵育1 h，荧光显微镜下观察。
ABC法：选用美国Vector Laboratories公司生产的Vectastain ABC试剂盒。标本经5%健康羊血清封闭30 min。一抗孵育2 h(同荧光法)。用新鲜配制的0.01%过氧化氢和0.05%二氨基联苯胺显色30 min后显微镜下观察。
上述两种染色方法实验过程均在室温下进行。对照组略去一抗，均未见阳性染色。
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二、结果
1.单离VGC培养结果：单离小鼠VGC接种后24 h，在倒置相差显微镜下观察大部分细胞贴壁，72 h后细胞有明显的突起长出，胞体呈圆形或椭圆形，双折射现象明显；突起较细而长，多数为双极型。成纤维细胞在72 h内增长迅速，覆盖于培养皿底部，随着培养液中人血清的浓度渐增其过度增长受到抑制，而伴有神经突起的VGC生长更为表浅，更易于观察，培养10～14 d后神经突起不再延长。培养至20 d，VGC仍能保持良好的形态，但细胞数量自14 d后有渐减的趋势。VGC存活天数为5～24 d，平均(
±s，下同)为(11.66±2.88) d。
2.免疫组化染色结果：免疫荧光法(图1)和ABC法(图2)结果显示抗NF-200 000抗体对VGC胞体和突起均呈阳性染色，并且经染色后更易于观察神经突起。神经突起长度为32.34 ～ 72.68 μm，平均为(59.77 ± 8.82) μm。 VGC胞体大小不均，直径约10～ 25 μm，阳性染色不因胞体大小不同而有明显差异，典型VGC呈椭圆形或圆形，为双极型，还发现少量多极型并经阳性染色而确认(图2)，神经细胞之间经突起相互连接形成局部的神经网络(图1，2)。非神经细胞不着色，易与神经细胞相区别。
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三、讨论
本实验的结果显示单离的VGC可培养至20 d以上，并且神经突起生长良好。突起之间相互连接，形成神经网络，因此，我们认为本实验已成功建立单离及培养VGC技术。NF是神经细胞所特有的细胞内蛋白，它们具有可被免疫细胞化学染色标识的特性，因此，用抗神经微丝抗体免疫组化染色，检测培养细胞中的NF，可较容易证明其为神经细胞。已报道，VGC内具有神经微丝蛋白[2]。本实验结果表明，抗NF-200 000抗体对培养的小鼠VGC胞体和突起均具有很好的染色，可以证明它们的神经细胞特性。
图1 荧光显微镜观察单离培养1周的前庭神经节细胞形态特征。
为细胞胞体，
为长的细胞突起。抗神经微丝抗体免疫组化染色 ×200
, http://www.100md.com
图2 荧光显微镜观察显示双极型()和多极型()前庭神经节细胞。抗神经微丝抗体免疫组化染色ABC法 ×200
参考文献
1 Rabejac D, Raymond J, Dechesne CJ. Characterization of different neuron populations in mouse statoacoustic ganglion cultures. Brain Res,1994,652: 249-256.
2 Hafidi A, Romond R. Neurofilament immunoreactivity in vestibular ganglion neurons of the adult rat. Hear Res, 1989, 42: 203-209.
(收稿：1999-01-28 修回：1999-08-28), 百拇医药
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科 杨仕明 姜泗长 杨伟炎 顾瑞日本关西医科大学耳鼻咽喉科 山下敏夫
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志990621 本研究建立前庭神经节细胞(vestibular ganglion cells, VGC)的分离及体外培养技术，并用免疫组化染色观察和识别培养的神经细胞。
一、材料和方法
1.细胞分离和培养：出生后1～5 d的ICR/ICR 小鼠100只，由日本关西医科大学实验动物中心提供。动物处死后将颞骨置于4℃ Earle缓冲盐水液 (earle buffered saline solution，EBSS； GBICO，美国)，自内耳道摘取前庭神经节，37℃下酶消化25 min，EBSS冲洗2次，加入培养液。单离的细胞被接种到硅胶培养皿底部的玻片上，培养皿体积约200 μL。玻片预先涂覆50 μg/ml的鼠尾胶原(5 μg/cm2；Becton Dickinson Labware，美国) 备用。于免疫组化染色时，细胞被接种于双槽塑料培养皿(Lab-Tak，美国)，置于37℃ 5% CO2 孵箱中培养。培养液组成：27% Eagle minimum essential medium (GIBCO，美国 )，33% EBSS, 40%马血清(GIBCO，美国)和100 IU/ml青霉素(Sigma，美国)。葡萄糖最终浓度6.6 g/L。培养液中马血清渐减 (每次换液减少10%)而加入等量人血清。
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2.免疫细胞化学染色：培养7～14 d将标本置于4%甲醛固定30 min。采用Rabejac等[1] 的免疫荧光法和ABC法染色。一抗为抗神经微丝(neuroflia-ments，NF)抗体(Sigma，美国)。
免疫荧光法：标本经15%羊血清和0.3% Triton X-100 (PBS稀释)处理60 min，加入一抗(1∶250)孵育2 h后，滴加荧光素标记的羊抗兔IgG (1∶50；Jackson Immunoresearch，美国 )孵育1 h，荧光显微镜下观察。
ABC法：选用美国Vector Laboratories公司生产的Vectastain ABC试剂盒。标本经5%健康羊血清封闭30 min。一抗孵育2 h(同荧光法)。用新鲜配制的0.01%过氧化氢和0.05%二氨基联苯胺显色30 min后显微镜下观察。
上述两种染色方法实验过程均在室温下进行。对照组略去一抗，均未见阳性染色。
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二、结果
1.单离VGC培养结果：单离小鼠VGC接种后24 h，在倒置相差显微镜下观察大部分细胞贴壁，72 h后细胞有明显的突起长出，胞体呈圆形或椭圆形，双折射现象明显；突起较细而长，多数为双极型。成纤维细胞在72 h内增长迅速，覆盖于培养皿底部，随着培养液中人血清的浓度渐增其过度增长受到抑制，而伴有神经突起的VGC生长更为表浅，更易于观察，培养10～14 d后神经突起不再延长。培养至20 d，VGC仍能保持良好的形态，但细胞数量自14 d后有渐减的趋势。VGC存活天数为5～24 d，平均(
±s，下同)为(11.66±2.88) d。2.免疫组化染色结果：免疫荧光法(图1)和ABC法(图2)结果显示抗NF-200 000抗体对VGC胞体和突起均呈阳性染色，并且经染色后更易于观察神经突起。神经突起长度为32.34 ～ 72.68 μm，平均为(59.77 ± 8.82) μm。 VGC胞体大小不均，直径约10～ 25 μm，阳性染色不因胞体大小不同而有明显差异，典型VGC呈椭圆形或圆形，为双极型，还发现少量多极型并经阳性染色而确认(图2)，神经细胞之间经突起相互连接形成局部的神经网络(图1，2)。非神经细胞不着色，易与神经细胞相区别。
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三、讨论
本实验的结果显示单离的VGC可培养至20 d以上，并且神经突起生长良好。突起之间相互连接，形成神经网络，因此，我们认为本实验已成功建立单离及培养VGC技术。NF是神经细胞所特有的细胞内蛋白，它们具有可被免疫细胞化学染色标识的特性，因此，用抗神经微丝抗体免疫组化染色，检测培养细胞中的NF，可较容易证明其为神经细胞。已报道，VGC内具有神经微丝蛋白[2]。本实验结果表明，抗NF-200 000抗体对培养的小鼠VGC胞体和突起均具有很好的染色，可以证明它们的神经细胞特性。
图1 荧光显微镜观察单离培养1周的前庭神经节细胞形态特征。
为细胞胞体，为长的细胞突起。抗神经微丝抗体免疫组化染色 ×200, http://www.100md.com
图2 荧光显微镜观察显示双极型(
)和多极型()前庭神经节细胞。抗神经微丝抗体免疫组化染色ABC法 ×200参考文献
1 Rabejac D, Raymond J, Dechesne CJ. Characterization of different neuron populations in mouse statoacoustic ganglion cultures. Brain Res,1994,652: 249-256.
2 Hafidi A, Romond R. Neurofilament immunoreactivity in vestibular ganglion neurons of the adult rat. Hear Res, 1989, 42: 203-209.
(收稿：1999-01-28 修回：1999-08-28), 百拇医药