北京上海广州地区的流感嗜血杆菌分离及药敏试验
作者：陈民钧 谢秀丽 张秀珍 张淑兰 王清涛 林桂清 吴坚 袁锦屏 唐英春 倪语星 胡必杰
单位：100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院(陈民钧、谢秀丽)；北京医院(张秀珍)；北京友谊医院(张淑兰)；北京红十字医院(王清涛)；北京中日友好医院(林桂清)；解放军总院(吴坚)；广州医学院附属医院(袁锦屏)；广州中山医学院附属医院(唐英春)；上海第二医科大学瑞金医院(倪语星)；上海医科大学中山医院(胡必杰)
关键词：
中华传染病杂志980417 流感嗜血杆菌可引起人类各种感染，包括常见的眼结膜炎，中耳炎，上呼吸道感染，它们多由非b型株引起。而严重感染，如脑膜炎，会厌炎、心包炎，肺炎，关节炎，骨髓炎，菌血症，面部蜂窝组织炎，多由b型株引起。5岁以下为高发年龄，最常见于6～8个月的婴幼儿，但也可见于成人及老年人[1]。在美国自从1985年将流感嗜血杆菌的b型抗原化学疫苗加入儿童免疫计划后，b型株引起的疾病发病率有所下降，1987年起多种多糖疫苗与白喉类毒素或破伤风类毒素结合，被推荐给18个月以下儿童的免疫计划，b型株感染率急剧地下降，减少了95%[2，3]。为了解我国流感嗜血杆菌的分离率及药敏谱，我们在北京、广州、上海三地区组织了10家教学医院进行了调查，并对其结果进行了分析，现报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
一、菌株来源
从门诊急诊呼吸道感染患者的痰及咽拭子标本进行流感嗜血杆菌的分离鉴定及药物敏感试验，共获得流感嗜血杆菌319株。
二、菌株分离鉴定方法
(一) 分离用培养基 1立升蒸馏水加40克胰消化大豆琼脂粉(Oxoid)，115°C15分钟蒸汽灭菌，冷却至80℃后，加脱纤维羊血至5%浓度，维持15分钟，再冷至50℃～55℃，加溶于水中的15毫克的辅酶I(NAD)和300毫克杆菌肽，立即倾倒平皿，4℃保存。
(二) 药敏用培养基 1升蒸馏水加嗜血杆菌试验用培养基琼脂粉(HTM，Oxoid)8.6克，115℃ 15分钟蒸气灭菌，将2整瓶生长因子(Hematin, Oxoid)用4ml无菌水充分溶解后，55℃下无菌加入，立即定量倾倒平皿至4mm厚，4℃保存。
, 百拇医药
(三) 鉴定培养基 同分离用培养基，不加杆菌肽。
(四) 分离鉴定步骤 将痰及咽拭子标本按常规方法种入分离培养基内，36℃下烛缸内培养过夜，挑选4～6个可疑菌落移种至鉴定培养基及Mueller Hinton (M-H, Oxoid)培养基上作卫星试验。在M-H培养基上贴X+V因子，X因子，V因子纸片。只在血平皿上卫星试验阳性、在M-H平皿上卫星试验阴性；以及只在X+V因子纸片周围生长、X因子，V因子纸片周围不生长的菌落可判定为流感嗜血杆菌，并进行以下试验：
1. 头孢硝噻酚试验(Nitrocefin,Oxoid)检测β-内酰胺酶。
2. 流感嗜血杆菌b型抗原乳胶凝集试验(bio Merieux Co.)检测b型株(Hib)，流感嗜血杆菌b型株送协和医院再检验。
3. 在HTM平皿上作8种抗生素的纸片扩散法药敏试验。
, 百拇医药
三、药敏试验
药敏试验采用NCCLS规定的纸片琼脂扩散法，按NCCLS的判定标准测量抑菌圈直径及判定耐药及敏感(表1)。
四、质量控制
用ATCC 49766监测头孢克罗的活性，用大肠杆菌ATCC 25923监测其他7种药的活性，NCCLS规定ATCC 49766对头孢克罗的抑菌范围为25～31mm，本资料中各医院所测值为25～31mm，平均为28.4mm。大肠肝菌ATCC 25922对其余抗生素的抑菌大小也在规定范围内。
五、电脑分析
各医院的原始数据均送至协和医
院，统一输入电脑中，用WHONET-3
, 百拇医药 软件进行分析。
结 果
一、各医院分离流感嗜血杆菌株数及咽试子标本和痰标本分离阳性率
见表2。
二、北京广州两地区流感嗜血杆菌的生物学特点
见表3。由于分离菌株数少，不能判定三地区b型株及产β-内酰胺酶株有多大差别，但三地区b型株分离株占5.9%，产β-内酰胺酶株占4.7%。
三、8种抗生素对流感嗜血杆菌的敏感性
见表4。表4中结果证实：北京地区的流感嗜血杆菌对头孢克罗、头孢呋辛、环丙沙星、多西环素，都是非常敏感的，敏感率分别为99%、99%、98%、95%。而且对氨苄青霉素也很敏感(92%)，氯霉素的敏感率为87%，红霉素及复方新诺明则较差。广州地区除了对头孢克罗及头孢呋肟高度敏感外，其它六种抗生素的敏感率从79%至3%。上海地区与北京相似，但前者对氨苄青霉素的敏感率为59%。
, http://www.100md.com
表1 对流感嗜血杆菌的抑菌圈判定值(NCCLS规定) 药 名
剂量
(μg)
抑菌圈直径(mm)
R
I
S
氨苄西林
10
≤18
19～21
≥22
头孢克罗
, http://www.100md.com
30
≤16
17～19
≥20
头孢呋辛
30
≤16
17～19
≥20
环丙沙星
5
≤20
≥21
, http://www.100md.com
红霉素
15
≤13
14～22
≥23
多西环素
30
≤12
13～15
≥16
氯霉素
30
≤25
, 百拇医药
26～28
≥29
TMP/SMZ
1.25/23.75
≤10
11～15
≥16
表2 流感嗜血杆菌的分离情况 医 院
例 数
分离株数
分 离 率(%)
咽拭
, 百拇医药 痰
北京协和医院
249
50
20.1
-
北京医院
400
38
9.5
-
北京友谊医院
371
, http://www.100md.com 36
9.7
-
北京解放军总院
213
26
12.2
-
北京朝阳红十字医院
309
38
12.3
-
, http://www.100md.com
北京中日友好医院
177
36
20.4
-
广州医院
60+107
31
41.5
5.6
中山医院
127+93
30
, 百拇医药
19.7
5.4
注：-为未作表4 319株流感嗜血杆菌对8种抗生素的敏感率 抗生素
北京(224)
上海(34)
广州(61)
合计(285)
I%
S%
I%
S%
I%
, 百拇医药
S%
I%
S%
氨苄西林
3
92
12
59
10
75
5
88
头孢克罗
1
, 百拇医药
99
0
97
7
93
2
98
头孢呋肟
1
99
6
88
2
98
, 百拇医药
1
99
环丙沙星
0
98
0
94
0
79
0
94
红霉素
71
24
, http://www.100md.com
59
29
64
3
69
22
多西环素
4
95
12
82
23
66
8
, http://www.100md.com
92
氯霉素
9
87
9
88
13
61
10
82
TMP/SMZ
4
56
6
, 百拇医药
62
3
51
4
55
表3 流感嗜血杆菌中的b型株及
产β-内酰胺酶株的分离率 地区
菌株数
b型
(%)
产β-内
酰胺酶(%)
北京
, 百拇医药
224
4(1.8)
9(4.0)
广州
61
4(6.5)
6(9.8)
上海
34
11(32.3)
NR
合计
319
, 百拇医药
19(5.9)
15(4.7)
讨 论
本资料中的我国三大城市的流感嗜血杆菌大多数来自门急诊的上呼吸道感染的轻症患者；尤以儿童为多。b型株及产β-内酰胺酶株的检出率分别为2.8%及5.3%。
流感嗜血杆菌对口服的头孢克罗及头孢呋肟很敏感，用散点图配对比较二者相关性很好，这是因为二者作用机制相同所致。说明都是治疗中轻症流感嗜血杆菌感染的合适的药。
所有耐氨苄西林的菌株，不论广州，上海或北京除一例外都对头孢克罗及头孢呋肟敏感，本例β-内酰胺酶阴性，却对氨苄西林耐药，估计是染色体介导的耐药性所致。
参考文献
1 Santosham M, Rivin B, Walff M, et al. Prevention of Haemophilus influenzae in Apache and Navajo children. J Infect Dis, 1992,165(sup):1441-1451.
, http://www.100md.com
2 Helena P, Makela A, Takala K, et al.Epidmiology of invasive Haemophilus influenzae type b disease. J Infect Dis, 1992,165(sup):s2-6.
3 Johnson PDR,Macinnesand SJ,Gilbert GL.Antibodies to Haemophilus influenzae type b outer membrane protein in children with epiglottisor meningitis and healthy controls. Infect Immunity, 1993,61:1531-1537.
(收稿：1997-05-21 修回：1998-01-20), http://www.100md.com
单位：100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院(陈民钧、谢秀丽)；北京医院(张秀珍)；北京友谊医院(张淑兰)；北京红十字医院(王清涛)；北京中日友好医院(林桂清)；解放军总院(吴坚)；广州医学院附属医院(袁锦屏)；广州中山医学院附属医院(唐英春)；上海第二医科大学瑞金医院(倪语星)；上海医科大学中山医院(胡必杰)
关键词：
中华传染病杂志980417 流感嗜血杆菌可引起人类各种感染，包括常见的眼结膜炎，中耳炎，上呼吸道感染，它们多由非b型株引起。而严重感染，如脑膜炎，会厌炎、心包炎，肺炎，关节炎，骨髓炎，菌血症，面部蜂窝组织炎，多由b型株引起。5岁以下为高发年龄，最常见于6～8个月的婴幼儿，但也可见于成人及老年人[1]。在美国自从1985年将流感嗜血杆菌的b型抗原化学疫苗加入儿童免疫计划后，b型株引起的疾病发病率有所下降，1987年起多种多糖疫苗与白喉类毒素或破伤风类毒素结合，被推荐给18个月以下儿童的免疫计划，b型株感染率急剧地下降，减少了95%[2，3]。为了解我国流感嗜血杆菌的分离率及药敏谱，我们在北京、广州、上海三地区组织了10家教学医院进行了调查，并对其结果进行了分析，现报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
一、菌株来源
从门诊急诊呼吸道感染患者的痰及咽拭子标本进行流感嗜血杆菌的分离鉴定及药物敏感试验，共获得流感嗜血杆菌319株。
二、菌株分离鉴定方法
(一) 分离用培养基 1立升蒸馏水加40克胰消化大豆琼脂粉(Oxoid)，115°C15分钟蒸汽灭菌，冷却至80℃后，加脱纤维羊血至5%浓度，维持15分钟，再冷至50℃～55℃，加溶于水中的15毫克的辅酶I(NAD)和300毫克杆菌肽，立即倾倒平皿，4℃保存。
(二) 药敏用培养基 1升蒸馏水加嗜血杆菌试验用培养基琼脂粉(HTM，Oxoid)8.6克，115℃ 15分钟蒸气灭菌，将2整瓶生长因子(Hematin, Oxoid)用4ml无菌水充分溶解后，55℃下无菌加入，立即定量倾倒平皿至4mm厚，4℃保存。
, 百拇医药
(三) 鉴定培养基 同分离用培养基，不加杆菌肽。
(四) 分离鉴定步骤 将痰及咽拭子标本按常规方法种入分离培养基内，36℃下烛缸内培养过夜，挑选4～6个可疑菌落移种至鉴定培养基及Mueller Hinton (M-H, Oxoid)培养基上作卫星试验。在M-H培养基上贴X+V因子，X因子，V因子纸片。只在血平皿上卫星试验阳性、在M-H平皿上卫星试验阴性；以及只在X+V因子纸片周围生长、X因子，V因子纸片周围不生长的菌落可判定为流感嗜血杆菌，并进行以下试验：
1. 头孢硝噻酚试验(Nitrocefin,Oxoid)检测β-内酰胺酶。
2. 流感嗜血杆菌b型抗原乳胶凝集试验(bio Merieux Co.)检测b型株(Hib)，流感嗜血杆菌b型株送协和医院再检验。
3. 在HTM平皿上作8种抗生素的纸片扩散法药敏试验。
, 百拇医药
三、药敏试验
药敏试验采用NCCLS规定的纸片琼脂扩散法，按NCCLS的判定标准测量抑菌圈直径及判定耐药及敏感(表1)。
四、质量控制
用ATCC 49766监测头孢克罗的活性，用大肠杆菌ATCC 25923监测其他7种药的活性，NCCLS规定ATCC 49766对头孢克罗的抑菌范围为25～31mm，本资料中各医院所测值为25～31mm，平均为28.4mm。大肠肝菌ATCC 25922对其余抗生素的抑菌大小也在规定范围内。
五、电脑分析
各医院的原始数据均送至协和医
院，统一输入电脑中，用WHONET-3
, 百拇医药 软件进行分析。
结 果
一、各医院分离流感嗜血杆菌株数及咽试子标本和痰标本分离阳性率
见表2。
二、北京广州两地区流感嗜血杆菌的生物学特点
见表3。由于分离菌株数少，不能判定三地区b型株及产β-内酰胺酶株有多大差别，但三地区b型株分离株占5.9%，产β-内酰胺酶株占4.7%。
三、8种抗生素对流感嗜血杆菌的敏感性
见表4。表4中结果证实：北京地区的流感嗜血杆菌对头孢克罗、头孢呋辛、环丙沙星、多西环素，都是非常敏感的，敏感率分别为99%、99%、98%、95%。而且对氨苄青霉素也很敏感(92%)，氯霉素的敏感率为87%，红霉素及复方新诺明则较差。广州地区除了对头孢克罗及头孢呋肟高度敏感外，其它六种抗生素的敏感率从79%至3%。上海地区与北京相似，但前者对氨苄青霉素的敏感率为59%。
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表1 对流感嗜血杆菌的抑菌圈判定值(NCCLS规定) 药 名
剂量
(μg)
抑菌圈直径(mm)
R
I
S
氨苄西林
10
≤18
19～21
≥22
头孢克罗
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30
≤16
17～19
≥20
头孢呋辛
30
≤16
17～19
≥20
环丙沙星
5
≤20
≥21
, http://www.100md.com
红霉素
15
≤13
14～22
≥23
多西环素
30
≤12
13～15
≥16
氯霉素
30
≤25
, 百拇医药
26～28
≥29
TMP/SMZ
1.25/23.75
≤10
11～15
≥16
表2 流感嗜血杆菌的分离情况 医 院
例 数
分离株数
分 离 率(%)
咽拭
, 百拇医药 痰
北京协和医院
249
50
20.1
-
北京医院
400
38
9.5
-
北京友谊医院
371
, http://www.100md.com 36
9.7
-
北京解放军总院
213
26
12.2
-
北京朝阳红十字医院
309
38
12.3
-
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北京中日友好医院
177
36
20.4
-
广州医院
60+107
31
41.5
5.6
中山医院
127+93
30
, 百拇医药
19.7
5.4
注：-为未作表4 319株流感嗜血杆菌对8种抗生素的敏感率 抗生素
北京(224)
上海(34)
广州(61)
合计(285)
I%
S%
I%
S%
I%
, 百拇医药
S%
I%
S%
氨苄西林
3
92
12
59
10
75
5
88
头孢克罗
1
, 百拇医药
99
0
97
7
93
2
98
头孢呋肟
1
99
6
88
2
98
, 百拇医药
1
99
环丙沙星
0
98
0
94
0
79
0
94
红霉素
71
24
, http://www.100md.com
59
29
64
3
69
22
多西环素
4
95
12
82
23
66
8
, http://www.100md.com
92
氯霉素
9
87
9
88
13
61
10
82
TMP/SMZ
4
56
6
, 百拇医药
62
3
51
4
55
表3 流感嗜血杆菌中的b型株及
产β-内酰胺酶株的分离率 地区
菌株数
b型
(%)
产β-内
酰胺酶(%)
北京
, 百拇医药
224
4(1.8)
9(4.0)
广州
61
4(6.5)
6(9.8)
上海
34
11(32.3)
NR
合计
319
, 百拇医药
19(5.9)
15(4.7)
讨 论
本资料中的我国三大城市的流感嗜血杆菌大多数来自门急诊的上呼吸道感染的轻症患者；尤以儿童为多。b型株及产β-内酰胺酶株的检出率分别为2.8%及5.3%。
流感嗜血杆菌对口服的头孢克罗及头孢呋肟很敏感，用散点图配对比较二者相关性很好，这是因为二者作用机制相同所致。说明都是治疗中轻症流感嗜血杆菌感染的合适的药。
所有耐氨苄西林的菌株，不论广州，上海或北京除一例外都对头孢克罗及头孢呋肟敏感，本例β-内酰胺酶阴性，却对氨苄西林耐药，估计是染色体介导的耐药性所致。
参考文献
1 Santosham M, Rivin B, Walff M, et al. Prevention of Haemophilus influenzae in Apache and Navajo children. J Infect Dis, 1992,165(sup):1441-1451.
, http://www.100md.com
2 Helena P, Makela A, Takala K, et al.Epidmiology of invasive Haemophilus influenzae type b disease. J Infect Dis, 1992,165(sup):s2-6.
3 Johnson PDR,Macinnesand SJ,Gilbert GL.Antibodies to Haemophilus influenzae type b outer membrane protein in children with epiglottisor meningitis and healthy controls. Infect Immunity, 1993,61:1531-1537.
(收稿：1997-05-21 修回：1998-01-20), http://www.100md.com