二膦酸盐作用的细胞学研究进展
作者：秦同文 王志敏 付焱 许贞久
单位：(河北医科大学药学院 石家庄 050017)
关键词：二膦酸盐类；治疗应用；细胞；药物作用；破骨细胞；药物作用
河北医科大学学报000540
中图号 R914.2
二膦酸盐(bisphosphonates,BPs)是焦磷酸盐(pyrophosphate,PPi)的稳定类似物,二膦酸盐能抑制各种药物引起的骨吸收,并对体内钙代谢有显著的作用,用于治疗与骨吸收增加有关的疾病:如Paget疾病、恶性高血钙、骨髓瘤和骨转移疾病,最近又用于治疗骨质疏松,二膦酸盐目前已成为研究的热点药物。有关二膦酸盐的作用机制,最初认为它能结合到羟磷灰石结晶上,并抑制其生长和溶解,但这种解释不足以说明它们的各种作用。有些作者根据二膦酸盐细胞内移生化作用研究二膦酸盐作用,根据其方式不同分成2类:与PPi最类似的二膦酸盐归于毒性的ATP类似物;而将活性更强的含氮二膦酸盐,能干扰甲戊二羟酸途径而产生凋亡的归于另一类。
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1 二膦酸盐对破骨细胞的作用
体内含二膦酸盐浓度最高的细胞是破骨细胞,后者通过骨髓中造血的前细胞(precursors)融合而形成高度特异的多核细胞。由于它们对钙亲和力大,在体内迅速从体液清除并结合到暴露着骨矿物的地方,如吸附在破骨细胞的周围,原来在体液中浓度很低的二膦酸盐,被吸收后局部浓度很高,然后从吸附在破骨细胞下面的酸性环境中的骨中释放[1]。Sato等测定了体内抑制骨吸收时,在破骨细胞下面的腔隙中二膦酸盐的局部浓度,可高达1M[2]。
二膦酸盐从骨表面释放后,很可能通过液相胞饮作用或通过钙络合的吞噬作用进入破骨细胞内部。体外已证明放射性标记的alendronate能进入细胞的液泡内。二膦酸盐也存在在其它亚细胞成分,如细胞质、线粒体和细胞核中。几乎可以肯定,二膦酸盐的作用部位是在细胞内,因为降钙素可使吸收了二膦酸盐后的破骨细胞免受这些药物的有害作用[3]。脂质体可以提高二膦酸盐在细胞内的释放,进入吞噬细胞(如巨噬细胞和网柱菌属变形虫)也可能增加二膦酸盐的强度。二膦酸盐一旦进入细胞内部,就可影响许多生化过程,使骨吸收能力丧失,甚至引起破骨细胞死亡。已证明二膦酸盐引起破骨细胞支架的破坏,包括丧失骨表面极化和密封带形成所需要的活性环和丧失皱状边缘(1个靠近骨表面高度旋绕膜),通过这一区域分泌水解酶和质子[4]。最近有报道[5,6]证明clodronate,pamidronate和residronate也引起体内外破骨细胞的凋亡,其特征为有明显的细胞和细胞核的形态学改变(包括细胞固缩和细胞核的破碎)。在体外二膦酸盐引起其它类型细胞(包括J744巨噬细胞和人的骨髓细胞)的凋亡。在体内,二膦酸盐引起J744巨噬细胞凋亡作用的结构-活性关系与其抑制骨重吸收的结构-活性关系是一致[7,8],由此说明二膦酸盐以类似的分子机理引起巨噬细胞和破骨细胞的凋亡。
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有许多报道,二膦酸盐在体外能抑制结缔组织(颅盖细胞、成纤维细胞和软骨细胞)和人的成骨细胞样的ROS17/2.8细胞的增生,对后者抑制的强度顺序与其抗吸收强度一致。由于成骨细胞能调节破骨细胞的活性,二膦酸盐有可能通过对成骨细胞的作用或防止分泌破骨细胞刺激因子或防止产生破骨细胞抑制因子,抑制破骨细胞或破骨细胞的形成。Sahni用ibandronate或clodronate处理大鼠成骨细胞样的CRP10/30细胞(破骨细胞活性强度刺激剂),然后用破骨细胞培养24 h,结果抑制了吸收,将CRP10/30细胞在二膦酸盐中即便放置5 min也可产生抑制作用,把经二膦酸盐处理的CRP10/30细胞调节培养基加到破骨细胞培养物中,也出现抑制[9]。这个作用好象是由于在二膦酸盐处理的CRP10/30细胞调节培养基中存在着低相对分子质量(1～10 kU)破骨细胞抑制因子,经破骨细胞抑制因子中介,而出现了这样的抑制作用,这种抑制因子尚有待鉴定。
2 二膦酸盐的靶分子
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二膦酸盐的靶分子和通过靶分子抑制骨吸收的机理还不大清楚,通过对含氮的二膦酸盐侧链构效关系的研究，认为二膦酸盐的抗吸收作用很可能是它的侧链与特殊的靶点结合，对二膦酸盐侧链或构型稍加改变，就会影响它的重吸收活性。二膦酸盐可能抑制细胞内酶,这种酶能与含磷酸盐或含焦磷酸盐的底物结合。已发现多种二膦酸盐在离体的破骨细胞和颅盖细胞中抑制蛋白质的合成,抑制糖酵解和减少乳酸盐的产生。最近Schmidt等证明alendronate和其它二膦酸盐可抑制某些蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP 如PTPσ和 PTPε),而不影响丝氨酸和苏氨酸磷酸酯酶[10]。tiludronate通过抑制蛋白磷酸酯酶活性而增加破骨细胞中蛋白磷酸化水平。此作用机理可能是,二膦酸盐通过对破骨细胞中骨吸收所必需的关键底物的蛋白去磷酸化如C-Src抑制,抑制破骨细胞的骨吸收能力。质子泵ATP酶对活性破骨细胞重吸收腔的酸化也是至关重要的。最近证明tiludronate直接对由破骨细胞膜得到的泡内外质子泵活性具有很强的抑制作用。与此相反,另一些人证明etidronate,pamidronate和clodronate通过间接作用,抑制细胞的代谢,或防止ATP酶进入浆膜,抑制破骨细胞中空泡的酸化[11]。
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Rogers按照二膦酸盐抑制破骨细胞的机理不同,将其分为2类:一类是与焦磷酸盐非常相似的clodronate和其它二膦酸盐被网柱菌属变形虫(其生长受二膦酸盐抑制的)[12,13]代谢成不水解的含有β,γ亚甲基的ATP类似物。另一类是具有较大侧链的二膦酸盐,如pamidronate和alendronate,它们不被代谢。第一类二膦酸盐在正反应中,很可能受第2类氨酰基-tRNA合成酶的催化,代替焦磷酸盐而被代谢,抑制了正反应(氨酰基-tRNA合成)[14]。由于这样的酶普遍存在,所以也将它们归于被dictyostelium代谢ATP类似物中。Rogers最近还证实,哺乳类动物细胞(鼠J744巨噬细胞和人的MG-63骨肉瘤细胞)也能代谢clodronate,从而证实了Felix等人的观察:clodronate被颅盖细胞内吸收后,可以进行修饰。Rogers和Frith 等在骨髓长期培养中,发现clodronate的代谢物在细胞间蓄集,引起细胞死亡和破骨细胞数目的减少,所以clodronate很可能是由于细胞毒素代谢物在细胞内的蓄集而抑制了骨的重吸收[15]。幸运的是二膦酸盐对骨矿物有高度亲和力而使代谢物的细胞毒素只蓄集在破骨细胞内。
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含氨基的二膦酸盐的作用机理可能与clodronate不同,它们不被代谢,不能抑制氨酰基-tRNA合成酶的活性[16]。Rogers最近证明含氨基的二膦酸盐通过抑制J744巨噬细胞中的角鲨烯合成酶和生物合成中的甲戊二羟酸途径中的其它酶来影响破骨细胞[17]。虽然合成胆固醇需要甲戊二羟酸途径几个中间体(farnesylpyrophosphate geranylgeranylpyrophosphate),但修饰(prenylation)转移后GPT-结合蛋白,如ras,rac,rho族蛋白(它们是调节细胞增殖、存活、膜交换和细胞支架机构的蛋白)也需要。Rogers发现含氨基的二膦酸盐如alendronate和ibandronate能抑制具有farnesyl或geranylgeranyl基J744巨噬细胞中这类蛋白的修饰,防止它们的细胞膜结合,并影响其功能[18]。有可能是氨基的二膦酸盐靶分子利用farnesylpyrophosphate或geranylgeranylpyrophosphate的甲戊二羟酸途径的酶。再者,二膦酸盐之所以对破骨细胞有选择作用是由于它们的骨矿物具有高度的亲和作用。
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3 二膦酸盐对其它细胞的作用
3.1 前破骨细胞:位于吸收破骨细胞下面(即在骨髓中)的二膦酸盐的浓度是可测知的,但到达骨面积上的二膦酸盐的正确浓度无法测知,因此在吸收过程中,当二膦酸盐从骨表面上重新离开时,有可能影响到其它细胞和破骨细胞。在体内骨吸收决定于通过单核细胞、前造血细胞融合而产生新的破骨细胞,二膦酸盐除作用于成熟破骨细胞外,可能经过对前破骨细胞的作用而抑制骨的吸收。Hughes等在体外长期培养人骨髓时,发现二膦酸盐剂量依赖性地抑制破骨细胞样的细胞形成,且它们的强度顺序与其在体内抑制骨吸收的强度是一致的。Boonekamp和Lowik等用低浓度的含氨基的二膦酸盐如pamidronate在体外通过抑制前破骨细胞的变形,成熟或融合,而抑制小鼠胎儿掌骨中的骨吸收[19]。较高浓度pamidronate以及强度较低的clodronate和etidronate通过影响成熟的破骨细胞而抑制吸收,因此二膦酸盐在体内对前破骨细胞和成熟破骨细胞都可能有影响,决定于二膦酸盐的类型和其在细胞周围的浓度。
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3.2 巨噬细胞:和破骨细胞一样,二膦酸盐似乎对巨噬细胞特别有害,这大概是由于细胞具有高度胞内液泡性质,能使相对大量的二膦酸盐进入细胞内部之故。因此,二膦酸盐能抑制巨噬细胞的增殖、活力、细胞迁移或功能而引起凋亡。这些细胞是刺激骨吸收的细胞因子的源泉,但含氨基的二膦酸盐如pamidronate和alendronate也引起暂时急性期反应,这大概是由于释放致炎前细胞因子如白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α之故,在体外pamidronate通过LPs刺激巨噬细胞,提高了IL-6的产量[20]。用动物关节炎模型说明的二膦酸盐的抗炎作用也可以用二膦酸盐能影响单核白细胞-巨噬细胞系统来说明,特别是包有clodronate的脂质体胶囊(对有吞噬细胞作用的巨噬细胞有毒性,而对其它细胞无毒性,在体外可抑制由活化的巨噬细胞中产生的细胞因子和一氧化氮),在未来,它们可能用于风湿性关节炎症中的巨噬细胞减少症。
3.3 肿瘤细胞:二膦酸盐选择性地用于治疗恶性高血钙和与肿瘤转移有关的溶骨性疾病。在转移疾病的动物模型中,二膦酸盐可减少骨转移的发展,减少肿瘤的负累,表面上是通过抑制破骨活性,防止释放刺激肿瘤生长因子而间接起作用的。虽然还没有证据证明二膦酸盐在体内直接影响肿瘤细胞,但作者发现pamidronate和incardronate(YM175)在体外在吸收破骨细胞周围可能达到的浓度(≥100 μm)下,可使细胞周期停止,人的骨髓细胞系凋亡。因此二膦酸盐在体内对骨髓瘤细胞可能有抗肿瘤作用。最近,Van der pluign等报道与骨矿物结合的二膦酸盐也能抑制乳腺癌细胞粘着和扩散到骨基质中去,因此,可防止肿瘤细胞转移到骨组织上[21],为证明在体内是否有这种有益的作用,还需要进一步研究,因为这将提倡大量使用二膦酸盐类药物来防止或预防转移性骨损伤的发展。
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参考文献
1，Sato M,Grasser W,Endo N,et al.Bisphosphonates action.Alendronate localisation in rat bone and effects on osteoclast ultrastructure.J Clin Invest,1991,88(6):2095
2，Murakami H,Takahashi N,Sasaki T,et al.A possible mechanism of the specific action of bisphosphonates on osteoclast:tiludronate preferentially affects polarized osteoclast having ruffled borders.Bone,1995,17(2):137
3，Monkkonen J,Taskinen M,Auriola SOK,et al.Growth inhibition of macrophige-like and other cell types by liposome-encapsulated,calcium-bound and free bisphosphonates in vitro.J Drug Target,1994,2(4):299
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4，Rogers MJ,Chilton KM,Coxon F,et al.Bisphosphonates induce apoptosis in mouse macrophage-like cells by a nitric-oxide-independent mechanism.J Bone Miner Res,1996,11(9):1482
5，Shipman CM,Rogers MJ,Appreley JF,et al.Bisphosphonates induce apoptosis in human myeloma cells; a novel antitumor activity.Br J Haematol,1997,98(3):665
6，Schmidt A,Rutledge SJ,Endo N,et al.Alendronate inhibition of protein tyrosine phosphatase activity.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(7):3068
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7，Rogers MJ,Russell RGG,Blackburn GM,et al.Metabolism of halogenated bisphosphonates by the cellular slime mould dictyostelium discoideum.Biochem Biophys Res Commun,1992,189(1):414
8，Rogers MJ,Watts DJ,Russell RGG,et al.Inhibitory effects of bisphosphonates on growth of amoebae of the cellular slime mould dictyostelium discoideum.J Bone Miner Res,1994,9(7):1029
9，Sahni M,Guenther HL,Fleisch H,et al.Bisphosphonates act on rat bone resorption through the mediation of osteoblasts.J Clin Invest,1993,91(5):2004
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10，Rogers MJ,Xiong X,Brown RJ,et al.Structure-activity relationships of new heterocycle-containing bisphosphonates as inhibitors of bone resorption and as inhibitors of growth of dictyostelium discoideum amoebae.Mol Pharmacol,1995,42(2):398
11，Rogers MJ,Ji X,Russell RGG,et al.Incorporation of bisphosphonates into adenine nucleotides by amoebae of the cellar slime mould dictyostelium discoideum.Biochem J,1994,303(1):303
12，Frith JC,Monkkonen J,Russell RGG,et al.Clodronate and liposome-encapsulated clodronate can be metabolised to a toxic ATP analogue,adenosine 5'-(6,g-dichloromethylen)triphosphate,by manmalian cells in vitro.J Bone Miner Res,1997,12(11):1358
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13，Pelorgeas S,Martin JB,Satre M.Cytotoxicity of dichloromethane diphosphonate and of 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonate in the amoebae of the slime mould dictyostelium discoideum.Biochem Pharmacol ,1992,44(11):2157
14，Rogers MJ,Brown RJ,Blackburn GM,et al.Bisphosphonates are incorporated into adenine nucleotides by human aminoacyl-tRNA synthetase enzymes.Biochem Biophys Res Commun,1996,224(3):863
15，Amin D,Cornell SA,Gustafson SK,et al.Bisphosphonates used for the treatment of bone disorders inhibitor squalene synthase and cholesterol biosynthesis.J Lipid Res,1992,33(11):1657
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16，Zhang FL,Casey PJ.Protein prenylation:molecular mechanisms and function consequences.Annu rev Biochem,1996,65(2):241
17，Coxon FP,Luckman SP,Russell RGG,et al.Bisphosphonates inhibit post-translational prenylation of GTP-binding proteins including ras and rab6.Bone,1997,20(4Suppl):12s
18，Hughes DE,Luckman SP,Russell RGG,et al.Involvement of the mevalonate pathway in osteoclast apoptosis and the mechanism of action of bisphosphonates.Bone,1997,20(4Suppl):114s
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19，Vitte C,Fleisch H,Guenther HL.Bisphosphonates induce osteoblasts to secrete an inhibitor of osteoclast-mediated resorption.Endocrinology,1996,137(6):2324
20，Selwenzer DH,Ostendorp-van de Ruit M.Interleukin-6 and the acute phase response during treatment of patients with Paget's disease with the nitrogen-containing bisphosphonate.J Bone Miner Res,1995,10(6):956
21，Makkonen N,Hirvonen MR,Teravainen T,et al.Different effects of three bisphosphonates on nitric oxide production by RAW264 macrophage-like cells in vitro.J Pharmacol Exp Ther,1996,277(2):1097
收稿日期：2000-01-04, 百拇医药
单位：(河北医科大学药学院 石家庄 050017)
关键词：二膦酸盐类；治疗应用；细胞；药物作用；破骨细胞；药物作用
河北医科大学学报000540
中图号 R914.2
二膦酸盐(bisphosphonates,BPs)是焦磷酸盐(pyrophosphate,PPi)的稳定类似物,二膦酸盐能抑制各种药物引起的骨吸收,并对体内钙代谢有显著的作用,用于治疗与骨吸收增加有关的疾病:如Paget疾病、恶性高血钙、骨髓瘤和骨转移疾病,最近又用于治疗骨质疏松,二膦酸盐目前已成为研究的热点药物。有关二膦酸盐的作用机制,最初认为它能结合到羟磷灰石结晶上,并抑制其生长和溶解,但这种解释不足以说明它们的各种作用。有些作者根据二膦酸盐细胞内移生化作用研究二膦酸盐作用,根据其方式不同分成2类:与PPi最类似的二膦酸盐归于毒性的ATP类似物;而将活性更强的含氮二膦酸盐,能干扰甲戊二羟酸途径而产生凋亡的归于另一类。
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1 二膦酸盐对破骨细胞的作用
体内含二膦酸盐浓度最高的细胞是破骨细胞,后者通过骨髓中造血的前细胞(precursors)融合而形成高度特异的多核细胞。由于它们对钙亲和力大,在体内迅速从体液清除并结合到暴露着骨矿物的地方,如吸附在破骨细胞的周围,原来在体液中浓度很低的二膦酸盐,被吸收后局部浓度很高,然后从吸附在破骨细胞下面的酸性环境中的骨中释放[1]。Sato等测定了体内抑制骨吸收时,在破骨细胞下面的腔隙中二膦酸盐的局部浓度,可高达1M[2]。
二膦酸盐从骨表面释放后,很可能通过液相胞饮作用或通过钙络合的吞噬作用进入破骨细胞内部。体外已证明放射性标记的alendronate能进入细胞的液泡内。二膦酸盐也存在在其它亚细胞成分,如细胞质、线粒体和细胞核中。几乎可以肯定,二膦酸盐的作用部位是在细胞内,因为降钙素可使吸收了二膦酸盐后的破骨细胞免受这些药物的有害作用[3]。脂质体可以提高二膦酸盐在细胞内的释放,进入吞噬细胞(如巨噬细胞和网柱菌属变形虫)也可能增加二膦酸盐的强度。二膦酸盐一旦进入细胞内部,就可影响许多生化过程,使骨吸收能力丧失,甚至引起破骨细胞死亡。已证明二膦酸盐引起破骨细胞支架的破坏,包括丧失骨表面极化和密封带形成所需要的活性环和丧失皱状边缘(1个靠近骨表面高度旋绕膜),通过这一区域分泌水解酶和质子[4]。最近有报道[5,6]证明clodronate,pamidronate和residronate也引起体内外破骨细胞的凋亡,其特征为有明显的细胞和细胞核的形态学改变(包括细胞固缩和细胞核的破碎)。在体外二膦酸盐引起其它类型细胞(包括J744巨噬细胞和人的骨髓细胞)的凋亡。在体内,二膦酸盐引起J744巨噬细胞凋亡作用的结构-活性关系与其抑制骨重吸收的结构-活性关系是一致[7,8],由此说明二膦酸盐以类似的分子机理引起巨噬细胞和破骨细胞的凋亡。
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有许多报道,二膦酸盐在体外能抑制结缔组织(颅盖细胞、成纤维细胞和软骨细胞)和人的成骨细胞样的ROS17/2.8细胞的增生,对后者抑制的强度顺序与其抗吸收强度一致。由于成骨细胞能调节破骨细胞的活性,二膦酸盐有可能通过对成骨细胞的作用或防止分泌破骨细胞刺激因子或防止产生破骨细胞抑制因子,抑制破骨细胞或破骨细胞的形成。Sahni用ibandronate或clodronate处理大鼠成骨细胞样的CRP10/30细胞(破骨细胞活性强度刺激剂),然后用破骨细胞培养24 h,结果抑制了吸收,将CRP10/30细胞在二膦酸盐中即便放置5 min也可产生抑制作用,把经二膦酸盐处理的CRP10/30细胞调节培养基加到破骨细胞培养物中,也出现抑制[9]。这个作用好象是由于在二膦酸盐处理的CRP10/30细胞调节培养基中存在着低相对分子质量(1～10 kU)破骨细胞抑制因子,经破骨细胞抑制因子中介,而出现了这样的抑制作用,这种抑制因子尚有待鉴定。
2 二膦酸盐的靶分子
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二膦酸盐的靶分子和通过靶分子抑制骨吸收的机理还不大清楚,通过对含氮的二膦酸盐侧链构效关系的研究，认为二膦酸盐的抗吸收作用很可能是它的侧链与特殊的靶点结合，对二膦酸盐侧链或构型稍加改变，就会影响它的重吸收活性。二膦酸盐可能抑制细胞内酶,这种酶能与含磷酸盐或含焦磷酸盐的底物结合。已发现多种二膦酸盐在离体的破骨细胞和颅盖细胞中抑制蛋白质的合成,抑制糖酵解和减少乳酸盐的产生。最近Schmidt等证明alendronate和其它二膦酸盐可抑制某些蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP 如PTPσ和 PTPε),而不影响丝氨酸和苏氨酸磷酸酯酶[10]。tiludronate通过抑制蛋白磷酸酯酶活性而增加破骨细胞中蛋白磷酸化水平。此作用机理可能是,二膦酸盐通过对破骨细胞中骨吸收所必需的关键底物的蛋白去磷酸化如C-Src抑制,抑制破骨细胞的骨吸收能力。质子泵ATP酶对活性破骨细胞重吸收腔的酸化也是至关重要的。最近证明tiludronate直接对由破骨细胞膜得到的泡内外质子泵活性具有很强的抑制作用。与此相反,另一些人证明etidronate,pamidronate和clodronate通过间接作用,抑制细胞的代谢,或防止ATP酶进入浆膜,抑制破骨细胞中空泡的酸化[11]。
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Rogers按照二膦酸盐抑制破骨细胞的机理不同,将其分为2类:一类是与焦磷酸盐非常相似的clodronate和其它二膦酸盐被网柱菌属变形虫(其生长受二膦酸盐抑制的)[12,13]代谢成不水解的含有β,γ亚甲基的ATP类似物。另一类是具有较大侧链的二膦酸盐,如pamidronate和alendronate,它们不被代谢。第一类二膦酸盐在正反应中,很可能受第2类氨酰基-tRNA合成酶的催化,代替焦磷酸盐而被代谢,抑制了正反应(氨酰基-tRNA合成)[14]。由于这样的酶普遍存在,所以也将它们归于被dictyostelium代谢ATP类似物中。Rogers最近还证实,哺乳类动物细胞(鼠J744巨噬细胞和人的MG-63骨肉瘤细胞)也能代谢clodronate,从而证实了Felix等人的观察:clodronate被颅盖细胞内吸收后,可以进行修饰。Rogers和Frith 等在骨髓长期培养中,发现clodronate的代谢物在细胞间蓄集,引起细胞死亡和破骨细胞数目的减少,所以clodronate很可能是由于细胞毒素代谢物在细胞内的蓄集而抑制了骨的重吸收[15]。幸运的是二膦酸盐对骨矿物有高度亲和力而使代谢物的细胞毒素只蓄集在破骨细胞内。
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含氨基的二膦酸盐的作用机理可能与clodronate不同,它们不被代谢,不能抑制氨酰基-tRNA合成酶的活性[16]。Rogers最近证明含氨基的二膦酸盐通过抑制J744巨噬细胞中的角鲨烯合成酶和生物合成中的甲戊二羟酸途径中的其它酶来影响破骨细胞[17]。虽然合成胆固醇需要甲戊二羟酸途径几个中间体(farnesylpyrophosphate geranylgeranylpyrophosphate),但修饰(prenylation)转移后GPT-结合蛋白,如ras,rac,rho族蛋白(它们是调节细胞增殖、存活、膜交换和细胞支架机构的蛋白)也需要。Rogers发现含氨基的二膦酸盐如alendronate和ibandronate能抑制具有farnesyl或geranylgeranyl基J744巨噬细胞中这类蛋白的修饰,防止它们的细胞膜结合,并影响其功能[18]。有可能是氨基的二膦酸盐靶分子利用farnesylpyrophosphate或geranylgeranylpyrophosphate的甲戊二羟酸途径的酶。再者,二膦酸盐之所以对破骨细胞有选择作用是由于它们的骨矿物具有高度的亲和作用。
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3 二膦酸盐对其它细胞的作用
3.1 前破骨细胞:位于吸收破骨细胞下面(即在骨髓中)的二膦酸盐的浓度是可测知的,但到达骨面积上的二膦酸盐的正确浓度无法测知,因此在吸收过程中,当二膦酸盐从骨表面上重新离开时,有可能影响到其它细胞和破骨细胞。在体内骨吸收决定于通过单核细胞、前造血细胞融合而产生新的破骨细胞,二膦酸盐除作用于成熟破骨细胞外,可能经过对前破骨细胞的作用而抑制骨的吸收。Hughes等在体外长期培养人骨髓时,发现二膦酸盐剂量依赖性地抑制破骨细胞样的细胞形成,且它们的强度顺序与其在体内抑制骨吸收的强度是一致的。Boonekamp和Lowik等用低浓度的含氨基的二膦酸盐如pamidronate在体外通过抑制前破骨细胞的变形,成熟或融合,而抑制小鼠胎儿掌骨中的骨吸收[19]。较高浓度pamidronate以及强度较低的clodronate和etidronate通过影响成熟的破骨细胞而抑制吸收,因此二膦酸盐在体内对前破骨细胞和成熟破骨细胞都可能有影响,决定于二膦酸盐的类型和其在细胞周围的浓度。
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3.2 巨噬细胞:和破骨细胞一样,二膦酸盐似乎对巨噬细胞特别有害,这大概是由于细胞具有高度胞内液泡性质,能使相对大量的二膦酸盐进入细胞内部之故。因此,二膦酸盐能抑制巨噬细胞的增殖、活力、细胞迁移或功能而引起凋亡。这些细胞是刺激骨吸收的细胞因子的源泉,但含氨基的二膦酸盐如pamidronate和alendronate也引起暂时急性期反应,这大概是由于释放致炎前细胞因子如白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α之故,在体外pamidronate通过LPs刺激巨噬细胞,提高了IL-6的产量[20]。用动物关节炎模型说明的二膦酸盐的抗炎作用也可以用二膦酸盐能影响单核白细胞-巨噬细胞系统来说明,特别是包有clodronate的脂质体胶囊(对有吞噬细胞作用的巨噬细胞有毒性,而对其它细胞无毒性,在体外可抑制由活化的巨噬细胞中产生的细胞因子和一氧化氮),在未来,它们可能用于风湿性关节炎症中的巨噬细胞减少症。
3.3 肿瘤细胞:二膦酸盐选择性地用于治疗恶性高血钙和与肿瘤转移有关的溶骨性疾病。在转移疾病的动物模型中,二膦酸盐可减少骨转移的发展,减少肿瘤的负累,表面上是通过抑制破骨活性,防止释放刺激肿瘤生长因子而间接起作用的。虽然还没有证据证明二膦酸盐在体内直接影响肿瘤细胞,但作者发现pamidronate和incardronate(YM175)在体外在吸收破骨细胞周围可能达到的浓度(≥100 μm)下,可使细胞周期停止,人的骨髓细胞系凋亡。因此二膦酸盐在体内对骨髓瘤细胞可能有抗肿瘤作用。最近,Van der pluign等报道与骨矿物结合的二膦酸盐也能抑制乳腺癌细胞粘着和扩散到骨基质中去,因此,可防止肿瘤细胞转移到骨组织上[21],为证明在体内是否有这种有益的作用,还需要进一步研究,因为这将提倡大量使用二膦酸盐类药物来防止或预防转移性骨损伤的发展。
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参考文献
1，Sato M,Grasser W,Endo N,et al.Bisphosphonates action.Alendronate localisation in rat bone and effects on osteoclast ultrastructure.J Clin Invest,1991,88(6):2095
2，Murakami H,Takahashi N,Sasaki T,et al.A possible mechanism of the specific action of bisphosphonates on osteoclast:tiludronate preferentially affects polarized osteoclast having ruffled borders.Bone,1995,17(2):137
3，Monkkonen J,Taskinen M,Auriola SOK,et al.Growth inhibition of macrophige-like and other cell types by liposome-encapsulated,calcium-bound and free bisphosphonates in vitro.J Drug Target,1994,2(4):299
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4，Rogers MJ,Chilton KM,Coxon F,et al.Bisphosphonates induce apoptosis in mouse macrophage-like cells by a nitric-oxide-independent mechanism.J Bone Miner Res,1996,11(9):1482
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收稿日期：2000-01-04, 百拇医药