几丁质及几丁糖与雪旺氏细胞相容性的实验研究△
作者：匡 勇1 侯春林1 苟三怀1 顾其胜2
单位：1 第二军医大学附属长征医院骨科(上海，200003)；2 上海其胜生物材料技术研究所
关键词：几丁质；几丁糖；雪旺氏细胞；细胞相容性
中国修复重建外科杂志980210 摘 要 为了观察几丁质及几丁糖对雪旺氏细胞生长的影响，用新生Wister鼠坐骨神经及臂丛神经的雪旺氏细胞接种于几丁质膜片及几丁糖液上，在培养1，3，7天时用光镜及扫描电镜进行观察。发现，几丁质及几丁糖上生长的雪旺氏细胞占94%，成纤维细胞占6%；对照组雪旺氏细胞占71%，成纤维细胞占29%。几丁糖内的细胞数多于几丁质膜片上的细胞数。认为，几丁质及几丁糖与雪旺氏细胞有着良好的组织相容性，几丁糖液优于几丁质膜片，两者均可抑制成纤维细胞的生长。
EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT ON GROWTH OF SCHWANN CELL FROM CHITIN AND CHITOSAN IN VITRO/Kuang Yong, Hou Chunlin, Gou Sanhuai, et al. Department of Orthopedics Surgery. Changzheng Hospital, The 2nd Military Medical University, Shanghai, P. R. China 200003
, 百拇医药
Abstract In order to study the effect of chitin and chitosan on the growth of Schwann cell (SC) of rats in vitro, the SC was isolated from sciatic nerve and brachial plexus of new-born rats. After the enzymatic and mechanical dissociation, the cell suspension was vaccinated on chitin membrane and chitosan fluid-coated glass coverslips. Then, the growth of SC was examined at 1, 3, 7 days after culture under light microscope and scanning electron microscope. The results showed that 94 percent of the cell grown from was SC and only 6% was fibroblast (FB), while that of the control SC 71% and FB 29% in population. The number of SC in chitosan suspension was more than that in chitin. Therefore, the conclusion was that the chitin and chitosan was histocompatible to SC, and chitosan suspension was superior to chitin, and both could inhibit the growth of fibroblast.
, 百拇医药
Key words Chitin Chitosan Schwann cell Cell compatibility
利用可吸收性生物材料取代自体神经移植来修复神经缺损已愈来愈受到人们的重视。几丁质及其衍生物几丁糖由于其具有良好的生物功能性及相容性已广泛应用于医学领域。在我们以往的实验中亦已证实几丁质是一种良好的神经桥接体，但其在神经修复中所起的作用尚不清楚，由于雪旺氏细胞(schwann's cell, SC)在神经再生中作用重大，因此，我们推测几丁质及几丁糖与SC应有着良好的相容性。实验旨在确定几丁质膜片及几丁糖溶液在体外环境下对鼠SC生长的影响，为几丁质及几丁糖的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 选用经酸碱处理提纯的精制蚕蛹壳几丁质，按几丁质管制作方法[1]制成1 cm×1 cm大小，厚0.5 mm的膜片；无菌封装的2%几丁糖液3 ml(上海其胜生物材料技术研究所提供)。选用出生1天～3天的Wister鼠20只(上海医科大学动物中心提供)。
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1.1.2 培养液的配制 培养液的成分为10%小牛血清(上海放射医学研究所)，90% DMEM(Gibco)，葡萄糖(6 mg/ml)，青霉素(100 μg/ml)，链霉素(100 μg/ml)。
1.1.3 SC的提取 将新生鼠颈动脉放血处死，浸泡于75%酒精30分钟，无菌操作下切取坐骨神经及臂丛神经，标本置于冷D-Hank's液中(4℃)，解剖显微镜下剔除神经外膜及束膜，剪碎，移入盛有0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶的离心管中，37℃消化30分钟后培养液反复清洗，并高速离心两次，去除上清液，制成SC悬液。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取平底玻璃培养皿3个，将3块1 cm×1 cm几丁质膜片等距离置于培养皿底部，取3块1 cm×1 cm盖玻片依几丁质膜片法置于另一培养皿中，每块玻片中央滴注一滴几丁糖液，无菌风干备用。第三个培养皿为空白对照组。用微量吸管吸取SC悬液，在每一块几丁质膜片及几丁糖玻片上接种150 μl SC悬液，对照组在相同距离接种三处。37℃，2.5% CO2培养，12小时后加入SC培养液，隔日换液一次。
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1.2.2 形态学观察及细胞计数 培养24小时后在倒置显微镜下观察。培养7天后在相差显微镜下按随机方法计数，计数时不重复视野内的细胞数，计数细胞至少1 000个。计数后即刻用2.5%戊二醛液固定，标本按常规制作后S-520扫描电镜观察。
2 结果
2.1 光镜
培养12小时加液时发现，几丁质膜片卷曲，膜片上细胞悬液几乎已干涸，加液后膜片逐渐平展，24小时后膜片上出现圆形及双极形细胞，数量较少(图1)。7天时双极细胞增多，对端排列，几丁质膜片出现脆裂。几丁糖24小时培养后出现大量双极细胞，其中几丁糖液内细胞较少，周缘细胞密集，且越靠近几丁糖排列越密集(图2)。72小时后细胞数量明显增加，少数细胞为三极状，细胞呈端对端漩涡状或栅栏状排列，几丁糖内细胞密度与周缘已相近(图3)。对照皿中培养24小时大部分细胞已贴壁，除大量双极细胞外，还有一些扁平状细胞，外形不规则，胞核及核仁清楚，少数细胞呈双核，体积较双极细胞大，位于双极细胞底层(图4)。培养7天时细胞数量剧增，呈典型的漩涡状排列(图5)。
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2.2 细胞计数
培养7天相差显微镜下可明显区分两种形态的细胞，一类为双极或三极细胞，呈端对端或漩涡状排列者为SC，另一类细胞形态不规则，呈扁平状为成纤维细胞(fibroblast, FB)。几丁质及几丁糖玻片上SC均占94%，FB为6%，对照组分别为71%及29%。
2.3 扫描电镜观察
几丁质7天时低倍电镜下SC为长梭形，端对端排列呈网状贴附于几丁质膜片上，膜片已碎裂，FB呈扁平状，形态不规则，在细胞密集处位于SC底层，数量明显少于SC(图6)。高倍镜下见SC胞体表面有小隆起，偶见绒毛状突起。胞体两极末端变薄并伸出胡须样伪足紧贴几丁质膜表面(图7)。双极细胞长度一般为50 μm～70 μm，也有长达100 μm以上的。几丁糖玻片上SC呈双极或三极状，对端排列，胞体较几丁质膜片上SC胞体更为细长，也可见小隆起及绒毛状突起，细胞长度在60 μm以上，最长可达130 μm。少量FB位于细胞密集处底部。整个视野中有针尖状小白点分布，可能为几丁糖分解所产生的碎屑(图8)。对照组SC的形态及排列同几丁糖组(图9)，但细胞更长，可达150 μm以上。同样，FB也位于SC密集处底部，但数量较多。
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图1 SC(▲)在几丁质膜片上呈圆形或双极形，数量较少(1DIV×50) 图2 几丁糖(△)周缘大量SC围绕，糖内细胞较少(1DIV×50) 图3 SC已进入几丁糖内，糖内、外细胞密度无明显差异(3DIV×50)
图4 对照组SC间杂有较多FB(△)(1DIV×50) 图5 对照组大量SC生长，呈典型的漩涡状排列(7DIV×50) 图6 SC(▲)呈双极，数量增多，少许FB(△)位于SC底层，几丁质膜片(↑)已不完整(7DIV×300)
图7 SC呈橄榄形，表面有小隆起，胞体两极末端变薄并伸出胡须样伪足紧贴几丁质膜表面，几丁质膜已碎裂(↑)(7DIV×4 000) 图8 SC呈双极形，表面有隆起，周缘散在小颗粒(↑)，可能为几丁糖分解物(7DIV×4 000) 图9 对照组SC呈双极状，表面亦有小隆起(7DIV×4 000)
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3 讨论
周围神经的再生在很大程度上依赖于SC的增生与迁移[2]。当SC受到抑制时，神经再生及髓鞘形成将明显受到影响[3]；当SC缺乏时，再生神经无法逾越神经缺损处[4]。新近的研究表明[5]，SC不但能够引导神经再生，而且还分泌多种促神经再生的因子，如神经生长因子、运动神经营养因子等。这些研究都说明了SC在周围神经修复中的重要性。
近年来，利用可吸收性生物材料替代自体神经移植修复神经缺损已引起人们的重视。在不断地研究中发现一些材料的性能甚至已优于自体神经移植[6]。几丁质及几丁糖作为一种生物功能性及相容性极佳的生物材料已广泛应用于医学领域，我们曾经用几丁质管来桥接周围神经缺损获得满意效果[1]。但就生物材料与SC的相关性研究目前尚未见文献报道。我们设想如果一种材料能够促进SC生长则为一种理想的神经修复材料，如果抑制SC生长则应慎用。我们的研究表明，SC可以在几丁质膜片及几丁糖溶液中生长。尽管在培养早期几丁质膜片上的细胞生长不够理想，但随着时间推移细胞生长趋于良好。这种短暂性的抑制现象除与细胞悬液干涸有关外，可能与几丁质本身也有关系。相比之下，几丁糖液对SC的相容性优于几丁质膜片，虽然早期几丁糖内细胞数较少，但从密集围绕于几丁糖周缘的细胞量和形态可以看出，几丁糖对SC的生长无任何影响。这种糖内细胞少于周缘的现象可能与几丁糖本身粘滑，细胞无法贴附有关，随着时间推移，SC很快便进入糖内。几丁质及几丁糖的另一个特性是选择性地抑制FB[7]，从细胞计数中可以看出，实验组FB生长率仅为6%，而对照组则高达29%。这一特性在神经修复中的意义是早期可防止瘢痕长入再生神经中，晚期可避免瘢痕缩窄引起压迫。
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4 小结
几丁质及几丁糖对体外培养的新生Wister鼠SC具有较好的生物相容性，对FB有抑制作用，几丁糖液对SC的相容性优于几丁质膜片。
(致谢：本研究中SC的培养得到中国医学科学院上海脑研究所严恒林博士后、姜德鸣教授的大力支持，特此致谢。)
5 参考文献
1 苟三怀，侯春林，臧鸿声等.几丁质桥接周围神经缺损的实验研究.中国修复重建外科杂志，1993；7(3)：169
2 Lubinska L. Sedentary and migratory states of Schwann cell. Exp Cell Res Suppl, 1961;8:74
3 Love S. An experimental study of peripheral nerve regeneration after X-irradation. Brain, 1983;(106):39
, 百拇医药
4 Heumann R. Regeneration in celluar and a celluar autografts in the peripheral nere system. Neuropathol Appl Neurobiol, 1986;(12):27
5 顾立强，朱家恺，顾熊飞.雪旺氏细胞分泌蛋白及其神经营养活性物质的生化分析.中华显微外科杂志，1994；17(3)：201
6 Robinson PH, Lei BVD, Hoppen HJ et al. Nerve regeneration through a two-ply biodegrabable nerve guide in the rat and the influence of ACTH 4-9 nerve growth factor. Microsurgery, 1991;12:412
7 盛志坚，侯春林.几丁糖影响体外细胞生长的实验研究.中国修复重建外科杂志，1993；7(4)：244
△ 国家自然科学基金资助项目
(收稿：1997-04-07), http://www.100md.com
单位：1 第二军医大学附属长征医院骨科(上海，200003)；2 上海其胜生物材料技术研究所
关键词：几丁质；几丁糖；雪旺氏细胞；细胞相容性
中国修复重建外科杂志980210 摘 要 为了观察几丁质及几丁糖对雪旺氏细胞生长的影响，用新生Wister鼠坐骨神经及臂丛神经的雪旺氏细胞接种于几丁质膜片及几丁糖液上，在培养1，3，7天时用光镜及扫描电镜进行观察。发现，几丁质及几丁糖上生长的雪旺氏细胞占94%，成纤维细胞占6%；对照组雪旺氏细胞占71%，成纤维细胞占29%。几丁糖内的细胞数多于几丁质膜片上的细胞数。认为，几丁质及几丁糖与雪旺氏细胞有着良好的组织相容性，几丁糖液优于几丁质膜片，两者均可抑制成纤维细胞的生长。
EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT ON GROWTH OF SCHWANN CELL FROM CHITIN AND CHITOSAN IN VITRO/Kuang Yong, Hou Chunlin, Gou Sanhuai, et al. Department of Orthopedics Surgery. Changzheng Hospital, The 2nd Military Medical University, Shanghai, P. R. China 200003
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Abstract In order to study the effect of chitin and chitosan on the growth of Schwann cell (SC) of rats in vitro, the SC was isolated from sciatic nerve and brachial plexus of new-born rats. After the enzymatic and mechanical dissociation, the cell suspension was vaccinated on chitin membrane and chitosan fluid-coated glass coverslips. Then, the growth of SC was examined at 1, 3, 7 days after culture under light microscope and scanning electron microscope. The results showed that 94 percent of the cell grown from was SC and only 6% was fibroblast (FB), while that of the control SC 71% and FB 29% in population. The number of SC in chitosan suspension was more than that in chitin. Therefore, the conclusion was that the chitin and chitosan was histocompatible to SC, and chitosan suspension was superior to chitin, and both could inhibit the growth of fibroblast.
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Key words Chitin Chitosan Schwann cell Cell compatibility
利用可吸收性生物材料取代自体神经移植来修复神经缺损已愈来愈受到人们的重视。几丁质及其衍生物几丁糖由于其具有良好的生物功能性及相容性已广泛应用于医学领域。在我们以往的实验中亦已证实几丁质是一种良好的神经桥接体，但其在神经修复中所起的作用尚不清楚，由于雪旺氏细胞(schwann's cell, SC)在神经再生中作用重大，因此，我们推测几丁质及几丁糖与SC应有着良好的相容性。实验旨在确定几丁质膜片及几丁糖溶液在体外环境下对鼠SC生长的影响，为几丁质及几丁糖的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 选用经酸碱处理提纯的精制蚕蛹壳几丁质，按几丁质管制作方法[1]制成1 cm×1 cm大小，厚0.5 mm的膜片；无菌封装的2%几丁糖液3 ml(上海其胜生物材料技术研究所提供)。选用出生1天～3天的Wister鼠20只(上海医科大学动物中心提供)。
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1.1.2 培养液的配制 培养液的成分为10%小牛血清(上海放射医学研究所)，90% DMEM(Gibco)，葡萄糖(6 mg/ml)，青霉素(100 μg/ml)，链霉素(100 μg/ml)。
1.1.3 SC的提取 将新生鼠颈动脉放血处死，浸泡于75%酒精30分钟，无菌操作下切取坐骨神经及臂丛神经，标本置于冷D-Hank's液中(4℃)，解剖显微镜下剔除神经外膜及束膜，剪碎，移入盛有0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶的离心管中，37℃消化30分钟后培养液反复清洗，并高速离心两次，去除上清液，制成SC悬液。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取平底玻璃培养皿3个，将3块1 cm×1 cm几丁质膜片等距离置于培养皿底部，取3块1 cm×1 cm盖玻片依几丁质膜片法置于另一培养皿中，每块玻片中央滴注一滴几丁糖液，无菌风干备用。第三个培养皿为空白对照组。用微量吸管吸取SC悬液，在每一块几丁质膜片及几丁糖玻片上接种150 μl SC悬液，对照组在相同距离接种三处。37℃，2.5% CO2培养，12小时后加入SC培养液，隔日换液一次。
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1.2.2 形态学观察及细胞计数 培养24小时后在倒置显微镜下观察。培养7天后在相差显微镜下按随机方法计数，计数时不重复视野内的细胞数，计数细胞至少1 000个。计数后即刻用2.5%戊二醛液固定，标本按常规制作后S-520扫描电镜观察。
2 结果
2.1 光镜
培养12小时加液时发现，几丁质膜片卷曲，膜片上细胞悬液几乎已干涸，加液后膜片逐渐平展，24小时后膜片上出现圆形及双极形细胞，数量较少(图1)。7天时双极细胞增多，对端排列，几丁质膜片出现脆裂。几丁糖24小时培养后出现大量双极细胞，其中几丁糖液内细胞较少，周缘细胞密集，且越靠近几丁糖排列越密集(图2)。72小时后细胞数量明显增加，少数细胞为三极状，细胞呈端对端漩涡状或栅栏状排列，几丁糖内细胞密度与周缘已相近(图3)。对照皿中培养24小时大部分细胞已贴壁，除大量双极细胞外，还有一些扁平状细胞，外形不规则，胞核及核仁清楚，少数细胞呈双核，体积较双极细胞大，位于双极细胞底层(图4)。培养7天时细胞数量剧增，呈典型的漩涡状排列(图5)。
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2.2 细胞计数
培养7天相差显微镜下可明显区分两种形态的细胞，一类为双极或三极细胞，呈端对端或漩涡状排列者为SC，另一类细胞形态不规则，呈扁平状为成纤维细胞(fibroblast, FB)。几丁质及几丁糖玻片上SC均占94%，FB为6%，对照组分别为71%及29%。
2.3 扫描电镜观察
几丁质7天时低倍电镜下SC为长梭形，端对端排列呈网状贴附于几丁质膜片上，膜片已碎裂，FB呈扁平状，形态不规则，在细胞密集处位于SC底层，数量明显少于SC(图6)。高倍镜下见SC胞体表面有小隆起，偶见绒毛状突起。胞体两极末端变薄并伸出胡须样伪足紧贴几丁质膜表面(图7)。双极细胞长度一般为50 μm～70 μm，也有长达100 μm以上的。几丁糖玻片上SC呈双极或三极状，对端排列，胞体较几丁质膜片上SC胞体更为细长，也可见小隆起及绒毛状突起，细胞长度在60 μm以上，最长可达130 μm。少量FB位于细胞密集处底部。整个视野中有针尖状小白点分布，可能为几丁糖分解所产生的碎屑(图8)。对照组SC的形态及排列同几丁糖组(图9)，但细胞更长，可达150 μm以上。同样，FB也位于SC密集处底部，但数量较多。
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图1 SC(▲)在几丁质膜片上呈圆形或双极形，数量较少(1DIV×50) 图2 几丁糖(△)周缘大量SC围绕，糖内细胞较少(1DIV×50) 图3 SC已进入几丁糖内，糖内、外细胞密度无明显差异(3DIV×50)
图4 对照组SC间杂有较多FB(△)(1DIV×50) 图5 对照组大量SC生长，呈典型的漩涡状排列(7DIV×50) 图6 SC(▲)呈双极，数量增多，少许FB(△)位于SC底层，几丁质膜片(↑)已不完整(7DIV×300)
图7 SC呈橄榄形，表面有小隆起，胞体两极末端变薄并伸出胡须样伪足紧贴几丁质膜表面，几丁质膜已碎裂(↑)(7DIV×4 000) 图8 SC呈双极形，表面有隆起，周缘散在小颗粒(↑)，可能为几丁糖分解物(7DIV×4 000) 图9 对照组SC呈双极状，表面亦有小隆起(7DIV×4 000)
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3 讨论
周围神经的再生在很大程度上依赖于SC的增生与迁移[2]。当SC受到抑制时，神经再生及髓鞘形成将明显受到影响[3]；当SC缺乏时，再生神经无法逾越神经缺损处[4]。新近的研究表明[5]，SC不但能够引导神经再生，而且还分泌多种促神经再生的因子，如神经生长因子、运动神经营养因子等。这些研究都说明了SC在周围神经修复中的重要性。
近年来，利用可吸收性生物材料替代自体神经移植修复神经缺损已引起人们的重视。在不断地研究中发现一些材料的性能甚至已优于自体神经移植[6]。几丁质及几丁糖作为一种生物功能性及相容性极佳的生物材料已广泛应用于医学领域，我们曾经用几丁质管来桥接周围神经缺损获得满意效果[1]。但就生物材料与SC的相关性研究目前尚未见文献报道。我们设想如果一种材料能够促进SC生长则为一种理想的神经修复材料，如果抑制SC生长则应慎用。我们的研究表明，SC可以在几丁质膜片及几丁糖溶液中生长。尽管在培养早期几丁质膜片上的细胞生长不够理想，但随着时间推移细胞生长趋于良好。这种短暂性的抑制现象除与细胞悬液干涸有关外，可能与几丁质本身也有关系。相比之下，几丁糖液对SC的相容性优于几丁质膜片，虽然早期几丁糖内细胞数较少，但从密集围绕于几丁糖周缘的细胞量和形态可以看出，几丁糖对SC的生长无任何影响。这种糖内细胞少于周缘的现象可能与几丁糖本身粘滑，细胞无法贴附有关，随着时间推移，SC很快便进入糖内。几丁质及几丁糖的另一个特性是选择性地抑制FB[7]，从细胞计数中可以看出，实验组FB生长率仅为6%，而对照组则高达29%。这一特性在神经修复中的意义是早期可防止瘢痕长入再生神经中，晚期可避免瘢痕缩窄引起压迫。
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几丁质及几丁糖对体外培养的新生Wister鼠SC具有较好的生物相容性，对FB有抑制作用，几丁糖液对SC的相容性优于几丁质膜片。
(致谢：本研究中SC的培养得到中国医学科学院上海脑研究所严恒林博士后、姜德鸣教授的大力支持，特此致谢。)
5 参考文献
1 苟三怀，侯春林，臧鸿声等.几丁质桥接周围神经缺损的实验研究.中国修复重建外科杂志，1993；7(3)：169
2 Lubinska L. Sedentary and migratory states of Schwann cell. Exp Cell Res Suppl, 1961;8:74
3 Love S. An experimental study of peripheral nerve regeneration after X-irradation. Brain, 1983;(106):39
, 百拇医药
4 Heumann R. Regeneration in celluar and a celluar autografts in the peripheral nere system. Neuropathol Appl Neurobiol, 1986;(12):27
5 顾立强，朱家恺，顾熊飞.雪旺氏细胞分泌蛋白及其神经营养活性物质的生化分析.中华显微外科杂志，1994；17(3)：201
6 Robinson PH, Lei BVD, Hoppen HJ et al. Nerve regeneration through a two-ply biodegrabable nerve guide in the rat and the influence of ACTH 4-9 nerve growth factor. Microsurgery, 1991;12:412
7 盛志坚，侯春林.几丁糖影响体外细胞生长的实验研究.中国修复重建外科杂志，1993；7(4)：244
△ 国家自然科学基金资助项目
(收稿：1997-04-07), http://www.100md.com