7-硝基吲唑对大鼠脑缺血再灌流保护作用的研究
作者：高谦 余华峰
单位：高谦(北京市积水潭医院神经内科 100035)；余华峰(首都医科大学附属同仁医院神经内科)
关键词：神经元型一氧化氮合酶抑制剂；7-硝基吲唑；脑缺血再灌流
中国现代医学杂志000103目的：探讨神经元型一氧化氮合酶抑制剂(nNOSI)7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)对脑缺血再灌流保护作用的机理。方法：选用体重180～220g的雌性Wistar大鼠， 随机分组，左颈外动脉管腔内置渔线经颈内动脉送至大脑中动脉内，使之闭塞。1h后拔出栓子，再灌流0.5h到2h。于再灌流前治疗组给予7-NI(50mg/kg)，对照组和假手术组给予花生油5ml/kg，根据再灌流不同时相(0.5h，1h，2h)再分3个亚组。缺血再灌流期间定时测定脑匀浆NOS活性和MDA含量，用嗜银Ⅲ染色法作光镜病理检查。结果：再灌流后不同时相，7-NI组NOS活性、MDA含量均明显低于单纯缺血再灌流对照组(P<0.05)；光镜检查发现7-NI组顶页皮质早期变性的神经元数在各时相也均低于相应的对照组(P<0.05)。结论：于大鼠大脑中动脉闭塞1h给予7-NI(50mg/kg)后再灌流0.5 h到2h，7-NI有如下影响：抑制NOS活性；降低MDA含量；减轻光镜下病理的异常变化。证明7-NI对脑缺血再灌流早期有保护作用。
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分类号：R743.3▲
本文从动物实验方面观察7-硝基吲唑(7-NI)是否对脑缺血再灌流早期有保护作用，并且探讨其脑保护作用的部分机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康雌性Wistar大鼠，体重180～220g，随机分组，6%水合氯醛以5ml/kg腹腔注射(i.p.)麻醉大鼠，需要重复麻醉时给予基本剂量的3/5。麻醉期间及术中用100W烤灯维持肛温在36.5℃～37.5℃。
1.1.2 动物模型的建立 参考Longa等建立的方法[1]，采用线栓法可逆性闭塞大鼠左侧大脑中动脉，分离颈部各动脉后，将一顶端加热后呈膨圆、直径0.165mm的渔线插入左颈外动脉(ECA)，轻柔送入渔线至颈内动脉内，缓慢向前推进15mm～17mm至略感阻力，制成大脑中动脉闭塞模型(MCAO)。缺血1h后于麻醉状态下拔出栓子至ECA内，造成再灌流，缝合皮肤切口，到各时相处死，取脑备检测。
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1.1.3 主要试剂及仪器 7-NI与花生油购自美国Sigma公司，用前按10mg：1ml配成混悬液；其余为国产分析纯试剂，购自北京化学试剂公司；NOS及MDA测定试剂盒购自中国军事医学科学院放射医学研究所。美国Bacman L7-35型离心机；瑞士UVIKON810型双波长分光光度计；上海756MC型UV分光光度计。
1.2 实验分组及给药方法
单纯缺血再灌流组(对照组)为MCAO 1h给予花生油5ml/kg,i.p.后拔栓，分别再灌流0.5 h,1h,2h；治疗组为MCAO 1h给予花生油5ml/kg,i.p.后拔栓，分别再灌流0.5h,1h,2h;假手术组除不插入线栓外，余手术步骤同对照组，术后1h给予花生油5ml/kg,i.p，于术后1.5h,2h,3h断头检测(见表1)。
表1 实验分组情况 项目
组别
, http://www.100md.com
Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
生化检验
假手术组
对照组
治疗组
8
8
8
8
8
8
, 百拇医药 8
8
8
光镜检查
对照组
治疗组
5
5
5
5
5
5
注：Ⅰ1R0.5缺血1h再灌流0.5h，假手术组为术后1.5h;
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Ⅰ1R1缺血1h再灌流1h，假手术组为术后2h；
Ⅰ1R2缺血1h再灌流2h，假手术组为术后3h。
以下各表标注相同。本表内数字为入选试验动物数。
1.3 观察项目及方法
1.3.1 脑组织匀浆制备 到各时相后，快速断头取脑，分离出幕上部分，剥除软脑膜，取左侧大脑半球，以重量(g)/体积(ml)比1∶4加入40mM,pH=7.2磷酸钾缓冲液，用玻璃研磨器制成匀浆，10000r/min离心20min，取上清液备测。
1.3.2 NOS活性测定 采用双波长分光光度计法，测试步骤严格按试剂盒说明书进行，其原理为：在有氧和辅酶NADPH存在的情况下，NOS催化底物L-精氨酸，生成L-瓜氨酸和NO，通过NO作用于氧合血红蛋白生成高铁血红蛋白的量来间接判定NOS的活性。NOS活性单位表示法：每克组织每分钟产生NO的量定义为1个酶活力单位，即nmol.mim-1.g-1。
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1.3.3 脂质过氧化物终产物丙二醛(MDA)的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法严格按试剂盒说明书进行，MDA含量以nmol/ml脑匀浆表示。
1.3.4 光镜病理学检查 石蜡切片的制作：大鼠用4%多聚甲醛二甲胂酸钠缓冲液心腔灌注1h后立即取脑，并置于上述灌注液中室温下再固定5d后，制成石蜡标本，观察冠状丘脑中1/3平面，该平面可看到海马前上部分。当切片切至下丘脑的腹内侧核和背内侧核排成X形，丘脑与纹状即将断开的层面时，开始留取切片，片厚5μm，连续4张。
嗜银Ⅲ染色法：用于观察脑缺血再灌流早期神经元缺血变化[2]。石蜡切片于正丙醇中脱水后，浸泡在100ml含4ml蒸馏水、0.8ml浓硫酸的正丙醇中，56℃酯化16h；正丙醇中下行加水后置于8%的醋酸中浸泡10min；将切片置于含硝酸银、硝酸铵、碳酸钠的硅钨酸盐显影剂中5～8min，直至切片背地变黄色；1%醋酸中冲洗30min后，正丙醇脱水、二甲苯冲洗，中性树酯封片。
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观察、计数：从低倍到高倍镜下观察海马、齿状回、额顶皮质的变性神经元的形态及数量，在40×10倍镜下以目镜网格测试系统计数海马各亚区、顶皮质区各3个视野的变性神经元的数量，将3个视野的记数总和作为统计参数。
1.4 统计学处理
各项检测所得结果均以均数±标准差记录。显著性检验采用t检验、单因素方差分析，当方差分析差异有显著性意义时，进一步用q检验作两两比较，检验水准取α=0.05，当P<0.05时认为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 缺血再灌流侧脑组织NOS活性的变化
假手术组3个时相NOS活性无明显差异(P>0.05)；对照组NOS活性在3个时相先较假手术组增高，后逐渐下降，但于Ⅰ1R2时仍高于假手术组水平；治疗组NOS活性的变化总的趋势与对照组相似，但每个时相均明显低于对照组(P<0.05)，于Ⅰ1R2时趋于恢复到假手术组水平(见表2)。
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表2 脑组织NOS活性的变化(nmol.min-1.g-1,n=8) 组 别
Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
假手术组
0.340±0.186
0.340±0.097
0.340±0.097
对照组
1.676±0.1451)
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1.360±0.1471)
0.729±0.1371)
治疗组
1.117±0.2011)2)
0.607±0.1621)2)
0.340±0.0902)
注：同时相q检验：1)与假手术组比较P<0.05，2)与对照组比较P<0.05
2.2 缺血再灌流侧脑组织MDA含量的变化
假手术组3个时相MDA含量无明显差异(P>0.05)；对照组、治疗组结果在3个时相均高于假手术组(P<0.05)，但治疗组在3个时相均明显低于对照组(P<0.05)；对照组结果总趋势逐渐增高，治疗组平缓下降(见表3)。
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表3 脑组织MDA含量的变化(nmol/ml,n=8) 组 别
Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
假手术组
5.993±0.179
6.125±0.038
6.609±0.062
对照组
9.219±0.435
17.58±1.747
, http://www.100md.com 18.99±0.960
治疗组
8.058±0.112
8.724±1.552
8.493±0.431
注：同时相q检验：与假手术组比较P<0.05，与对照组比较P<0.05
2.3 嗜银Ⅲ染色法结果
2.3.1 嗜银Ⅲ染色法呈色的变性神经元特点为：呈深黑褐色，胞体皱缩，核固缩，核浆分布不清，其树突银染，呈螺旋钻样或串珠样，很易辨认。
2.3.2 低倍镜下可见左侧额、顶叶皮质、尾壳核、海马CA3区、CA4区、齿状回中呈色的神经元数较多，但两组各时相左侧海马各亚区中呈色细胞数量变化不一，散在分布，如：同组、同时相不同标本有些CA4区有成簇的呈色细胞，而有些CA4区则几乎没有一个呈色细胞，尾壳核在该冠状切面仅见小部分，故仅计数左侧顶皮质第三层呈色的神经元。
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2.3.3 同时相比较 治疗组顶皮质呈色细胞数目均明显低于对照组(P<0.05，见表4)。
表4 7-NI对嗜银Ⅲ染色法皮质阳性神经元计数的影响(n=5) 组 别
Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
对照组
106.4±6.19
106.2±8.98
89.6±5.68
治疗组
57.8±6.421)
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53.4±3.511)
38.2±3.771)
注：同时相对照组与治疗组相比t检验1)P<0.05
3 讨论
3.1 7-NI对DOS活性的影响
实验结果显示，对照组三个时相NOS活性先增高，后逐渐下降，但始终高于假手术组，反映了脑缺血再灌流NOS活性上调；7-NI治疗组在3个时相均比对照组低(P<0.05)，在前两个时相高于假手术组，在Ⅰ1R2趋于恢复到假手术组水平(P>0.05)，7-NI为选择性nNOSⅠ，不抑制在体动物的eNOS[3]，所以早期使用7-NI后确实可抑制NOS活性。
3.2 7-NI对MDA的影响
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中枢神经系统富含脂质，膜脂质是维持细胞正常结构和功能的重要组成部分，脑缺血再灌流过程中，生物膜状态是细胞损伤从可逆向不可逆转变的重要环节，再灌流时强氧化剂如自由基、ROS引发的膜磷脂的脂质过氧化可破坏生物膜，伴大量脂质过氧化物形成，其终产物MDA也随之增高，所以，MDA含量的变化从另一角度反映了脑缺血再灌流后神经组织受损的程度，测定MDA可以反映ROS、自由基损伤过程中的脂质过氧化水平。
本实验发现，缺血再灌流对照组及治疗组MDA含量均显著同于假手术组，表明有大量强氧化剂产生，超过了体内抗氧化系统的清除能力，引起强烈的脂质过氧化作用，产生大量的脂质过氧化物终产物。但对照组与治疗组相比，治疗组在各时相MDA含量均低于对照组(P<0.05)，所以再灌流前给予7-NI可明显抑制缺血再灌流后MDA含量，这提示：7-NI在脑缺血再灌流中发挥保护作用的环节可能是抗氧化和抑制自由基的产生。
3.3 7-NI对脑缺血再灌流病理的影响
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Andras Czurko等[2]为研究短暂MCAO(1h)早期组织病理学变化，再灌注从数分钟到3d，发现再灌流早期(3h以内)用该方法观察变性神经元呈色的阳性反应多，3h以后减少，阳性神经元在缺血中心区的外侧纹状体、皮质和远离中心区的海马、丘脑网状核、杏仁体均可见，奇怪的是，他们观察到：这种染色呈色反应在海马CA3、CA4区、齿状回多，而在CA1区少，缺血对侧CA1区可有少量，这与本实验结果一致。
本实验观察到：对照组、治疗组缺血再灌流侧额顶皮质Ⅰ、Ⅱ区、尾壳核、海马CA3、CA4区、齿状回均有较多的嗜银阳性神经元，对侧区域亦有极少量，可能有自然死亡的神经元或与标本制作损伤有关。但本实验海马各亚区呈色细胞分布、数量无规律，推论：可能与标本例数少有关；缺血再灌流早期不宜选海马作比较对象，以选额顶皮质取材为好。由于Ashawal等[4]的实验提示缺血再灌流早期额顶皮质为半暗带，本实验治疗组在皮质区呈色神经元数各时相均比对照组少(P<0.05)，说明7-NI干预后，顶皮质即半暗带内早期变性的神经元数目可减少。
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3.4 7-NI在脑缺血再灌流早期保护作用的可能机理
局灶性脑缺血早期，大量NO主要来源于nNOS，直接引起脑损害[5]；在再灌流期，NO又与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸离子(ONOO-)，它的毒性比NO更强[6，7]。本实验证明，特异性nNOS抑制剂7-NI(50 mg/kg)能使MDA降低，减轻脑组织病理损伤，这与文献报道[3，8]一致，所以作者认为，7-NI是通过抑制神经元型NOS活性，使NO水平下降，抑制NO对神经元的直接损伤，且间接抑制ONOO-，抑制脂质过氧化，使MDA含量下降，稳定膜结构和功能，维护细胞内外环境的稳定性，维持线粒体功能，从而减轻脑缺血再灌流损伤后病理损害程度，由此推断选择nNOSⅠ 7-NI有益于脑缺血再灌流损伤早期治疗。其远期效果如对迟发神经元坏死、细胞凋亡、最终梗死体积形成的影响还有待进一步研究。
综上所述，选用适量7-NI，可减轻脑缺血再灌流后神经元的损伤，可能有利于改善脑卒中的预后，值得进一步观察研究，为临床治疗缺血性脑血管病应用nNOSⅠ提供了实验依据。■
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参考文献：
[1]Longa EZ,Wenstein PR.Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke, 1989;20:84～91
[2]Andras Czurko, Hitoo Nishino.“Collapsed"(argyrophilic,dark)neurons in rat model of transient focal cerebral ischemia.Neurosci Lett,1993;162:71～74
[3]Coert BA,Anderson RE,Meyer FB. A comparative study of the effects of two NOSⅠs and two NO donors on temporary focal cerebral ischemia in the Wistar rat.J Neurosurg, 1999;90:332～338
, http://www.100md.com
[4]Ashwal S,Tone B,Tian HR, et al.Core and penumbral NOS activity during cerebral ischemia and reperfusion.Stroke, 1998; 29:1037～1047
[5]Samdani AF, Dawson TM,Dawson VL.NOS in models of focal ischemia.Stroke,1997;28:1283～1288
[6]冯亦璞.缺血性脑卒中的病理生理及药物治疗现状.药学学报，1999；34：72～78
[7]Brorson JR,Schumacker PT,Zhang H.NO actely inhibits neuronal energy production.J Neurosci, 1999;19:147～158
[8]姜德华，金南革，玄汉石，等.7-NI减小大鼠暂时性局灶性脑梗塞灶范围.中风与神经疾病杂志，1998；15：342～344
杨期东审稿 黄其伟编辑
1999-07-10收稿, 百拇医药
单位：高谦(北京市积水潭医院神经内科 100035)；余华峰(首都医科大学附属同仁医院神经内科)
关键词：神经元型一氧化氮合酶抑制剂；7-硝基吲唑；脑缺血再灌流
中国现代医学杂志000103目的：探讨神经元型一氧化氮合酶抑制剂(nNOSI)7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)对脑缺血再灌流保护作用的机理。方法：选用体重180～220g的雌性Wistar大鼠， 随机分组，左颈外动脉管腔内置渔线经颈内动脉送至大脑中动脉内，使之闭塞。1h后拔出栓子，再灌流0.5h到2h。于再灌流前治疗组给予7-NI(50mg/kg)，对照组和假手术组给予花生油5ml/kg，根据再灌流不同时相(0.5h，1h，2h)再分3个亚组。缺血再灌流期间定时测定脑匀浆NOS活性和MDA含量，用嗜银Ⅲ染色法作光镜病理检查。结果：再灌流后不同时相，7-NI组NOS活性、MDA含量均明显低于单纯缺血再灌流对照组(P<0.05)；光镜检查发现7-NI组顶页皮质早期变性的神经元数在各时相也均低于相应的对照组(P<0.05)。结论：于大鼠大脑中动脉闭塞1h给予7-NI(50mg/kg)后再灌流0.5 h到2h，7-NI有如下影响：抑制NOS活性；降低MDA含量；减轻光镜下病理的异常变化。证明7-NI对脑缺血再灌流早期有保护作用。
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本文从动物实验方面观察7-硝基吲唑(7-NI)是否对脑缺血再灌流早期有保护作用，并且探讨其脑保护作用的部分机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康雌性Wistar大鼠，体重180～220g，随机分组，6%水合氯醛以5ml/kg腹腔注射(i.p.)麻醉大鼠，需要重复麻醉时给予基本剂量的3/5。麻醉期间及术中用100W烤灯维持肛温在36.5℃～37.5℃。
1.1.2 动物模型的建立 参考Longa等建立的方法[1]，采用线栓法可逆性闭塞大鼠左侧大脑中动脉，分离颈部各动脉后，将一顶端加热后呈膨圆、直径0.165mm的渔线插入左颈外动脉(ECA)，轻柔送入渔线至颈内动脉内，缓慢向前推进15mm～17mm至略感阻力，制成大脑中动脉闭塞模型(MCAO)。缺血1h后于麻醉状态下拔出栓子至ECA内，造成再灌流，缝合皮肤切口，到各时相处死，取脑备检测。
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1.1.3 主要试剂及仪器 7-NI与花生油购自美国Sigma公司，用前按10mg：1ml配成混悬液；其余为国产分析纯试剂，购自北京化学试剂公司；NOS及MDA测定试剂盒购自中国军事医学科学院放射医学研究所。美国Bacman L7-35型离心机；瑞士UVIKON810型双波长分光光度计；上海756MC型UV分光光度计。
1.2 实验分组及给药方法
单纯缺血再灌流组(对照组)为MCAO 1h给予花生油5ml/kg,i.p.后拔栓，分别再灌流0.5 h,1h,2h；治疗组为MCAO 1h给予花生油5ml/kg,i.p.后拔栓，分别再灌流0.5h,1h,2h;假手术组除不插入线栓外，余手术步骤同对照组，术后1h给予花生油5ml/kg,i.p，于术后1.5h,2h,3h断头检测(见表1)。
表1 实验分组情况 项目
组别
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Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
生化检验
假手术组
对照组
治疗组
8
8
8
8
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8
8
光镜检查
对照组
治疗组
5
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注：Ⅰ1R0.5缺血1h再灌流0.5h，假手术组为术后1.5h;
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Ⅰ1R1缺血1h再灌流1h，假手术组为术后2h；
Ⅰ1R2缺血1h再灌流2h，假手术组为术后3h。
以下各表标注相同。本表内数字为入选试验动物数。
1.3 观察项目及方法
1.3.1 脑组织匀浆制备 到各时相后，快速断头取脑，分离出幕上部分，剥除软脑膜，取左侧大脑半球，以重量(g)/体积(ml)比1∶4加入40mM,pH=7.2磷酸钾缓冲液，用玻璃研磨器制成匀浆，10000r/min离心20min，取上清液备测。
1.3.2 NOS活性测定 采用双波长分光光度计法，测试步骤严格按试剂盒说明书进行，其原理为：在有氧和辅酶NADPH存在的情况下，NOS催化底物L-精氨酸，生成L-瓜氨酸和NO，通过NO作用于氧合血红蛋白生成高铁血红蛋白的量来间接判定NOS的活性。NOS活性单位表示法：每克组织每分钟产生NO的量定义为1个酶活力单位，即nmol.mim-1.g-1。
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1.3.3 脂质过氧化物终产物丙二醛(MDA)的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法严格按试剂盒说明书进行，MDA含量以nmol/ml脑匀浆表示。
1.3.4 光镜病理学检查 石蜡切片的制作：大鼠用4%多聚甲醛二甲胂酸钠缓冲液心腔灌注1h后立即取脑，并置于上述灌注液中室温下再固定5d后，制成石蜡标本，观察冠状丘脑中1/3平面，该平面可看到海马前上部分。当切片切至下丘脑的腹内侧核和背内侧核排成X形，丘脑与纹状即将断开的层面时，开始留取切片，片厚5μm，连续4张。
嗜银Ⅲ染色法：用于观察脑缺血再灌流早期神经元缺血变化[2]。石蜡切片于正丙醇中脱水后，浸泡在100ml含4ml蒸馏水、0.8ml浓硫酸的正丙醇中，56℃酯化16h；正丙醇中下行加水后置于8%的醋酸中浸泡10min；将切片置于含硝酸银、硝酸铵、碳酸钠的硅钨酸盐显影剂中5～8min，直至切片背地变黄色；1%醋酸中冲洗30min后，正丙醇脱水、二甲苯冲洗，中性树酯封片。
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观察、计数：从低倍到高倍镜下观察海马、齿状回、额顶皮质的变性神经元的形态及数量，在40×10倍镜下以目镜网格测试系统计数海马各亚区、顶皮质区各3个视野的变性神经元的数量，将3个视野的记数总和作为统计参数。
1.4 统计学处理
各项检测所得结果均以均数±标准差记录。显著性检验采用t检验、单因素方差分析，当方差分析差异有显著性意义时，进一步用q检验作两两比较，检验水准取α=0.05，当P<0.05时认为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 缺血再灌流侧脑组织NOS活性的变化
假手术组3个时相NOS活性无明显差异(P>0.05)；对照组NOS活性在3个时相先较假手术组增高，后逐渐下降，但于Ⅰ1R2时仍高于假手术组水平；治疗组NOS活性的变化总的趋势与对照组相似，但每个时相均明显低于对照组(P<0.05)，于Ⅰ1R2时趋于恢复到假手术组水平(见表2)。
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表2 脑组织NOS活性的变化(nmol.min-1.g-1,n=8) 组 别
Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
假手术组
0.340±0.186
0.340±0.097
0.340±0.097
对照组
1.676±0.1451)
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1.360±0.1471)
0.729±0.1371)
治疗组
1.117±0.2011)2)
0.607±0.1621)2)
0.340±0.0902)
注：同时相q检验：1)与假手术组比较P<0.05，2)与对照组比较P<0.05
2.2 缺血再灌流侧脑组织MDA含量的变化
假手术组3个时相MDA含量无明显差异(P>0.05)；对照组、治疗组结果在3个时相均高于假手术组(P<0.05)，但治疗组在3个时相均明显低于对照组(P<0.05)；对照组结果总趋势逐渐增高，治疗组平缓下降(见表3)。
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表3 脑组织MDA含量的变化(nmol/ml,n=8) 组 别
Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
假手术组
5.993±0.179
6.125±0.038
6.609±0.062
对照组
9.219±0.435
17.58±1.747
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治疗组
8.058±0.112
8.724±1.552
8.493±0.431
注：同时相q检验：与假手术组比较P<0.05，与对照组比较P<0.05
2.3 嗜银Ⅲ染色法结果
2.3.1 嗜银Ⅲ染色法呈色的变性神经元特点为：呈深黑褐色，胞体皱缩，核固缩，核浆分布不清，其树突银染，呈螺旋钻样或串珠样，很易辨认。
2.3.2 低倍镜下可见左侧额、顶叶皮质、尾壳核、海马CA3区、CA4区、齿状回中呈色的神经元数较多，但两组各时相左侧海马各亚区中呈色细胞数量变化不一，散在分布，如：同组、同时相不同标本有些CA4区有成簇的呈色细胞，而有些CA4区则几乎没有一个呈色细胞，尾壳核在该冠状切面仅见小部分，故仅计数左侧顶皮质第三层呈色的神经元。
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2.3.3 同时相比较 治疗组顶皮质呈色细胞数目均明显低于对照组(P<0.05，见表4)。
表4 7-NI对嗜银Ⅲ染色法皮质阳性神经元计数的影响(n=5) 组 别
Ⅰ1R0.5
Ⅰ1R1
Ⅰ1R2
对照组
106.4±6.19
106.2±8.98
89.6±5.68
治疗组
57.8±6.421)
, 百拇医药
53.4±3.511)
38.2±3.771)
注：同时相对照组与治疗组相比t检验1)P<0.05
3 讨论
3.1 7-NI对DOS活性的影响
实验结果显示，对照组三个时相NOS活性先增高，后逐渐下降，但始终高于假手术组，反映了脑缺血再灌流NOS活性上调；7-NI治疗组在3个时相均比对照组低(P<0.05)，在前两个时相高于假手术组，在Ⅰ1R2趋于恢复到假手术组水平(P>0.05)，7-NI为选择性nNOSⅠ，不抑制在体动物的eNOS[3]，所以早期使用7-NI后确实可抑制NOS活性。
3.2 7-NI对MDA的影响
, 百拇医药
中枢神经系统富含脂质，膜脂质是维持细胞正常结构和功能的重要组成部分，脑缺血再灌流过程中，生物膜状态是细胞损伤从可逆向不可逆转变的重要环节，再灌流时强氧化剂如自由基、ROS引发的膜磷脂的脂质过氧化可破坏生物膜，伴大量脂质过氧化物形成，其终产物MDA也随之增高，所以，MDA含量的变化从另一角度反映了脑缺血再灌流后神经组织受损的程度，测定MDA可以反映ROS、自由基损伤过程中的脂质过氧化水平。
本实验发现，缺血再灌流对照组及治疗组MDA含量均显著同于假手术组，表明有大量强氧化剂产生，超过了体内抗氧化系统的清除能力，引起强烈的脂质过氧化作用，产生大量的脂质过氧化物终产物。但对照组与治疗组相比，治疗组在各时相MDA含量均低于对照组(P<0.05)，所以再灌流前给予7-NI可明显抑制缺血再灌流后MDA含量，这提示：7-NI在脑缺血再灌流中发挥保护作用的环节可能是抗氧化和抑制自由基的产生。
3.3 7-NI对脑缺血再灌流病理的影响
, 百拇医药
Andras Czurko等[2]为研究短暂MCAO(1h)早期组织病理学变化，再灌注从数分钟到3d，发现再灌流早期(3h以内)用该方法观察变性神经元呈色的阳性反应多，3h以后减少，阳性神经元在缺血中心区的外侧纹状体、皮质和远离中心区的海马、丘脑网状核、杏仁体均可见，奇怪的是，他们观察到：这种染色呈色反应在海马CA3、CA4区、齿状回多，而在CA1区少，缺血对侧CA1区可有少量，这与本实验结果一致。
本实验观察到：对照组、治疗组缺血再灌流侧额顶皮质Ⅰ、Ⅱ区、尾壳核、海马CA3、CA4区、齿状回均有较多的嗜银阳性神经元，对侧区域亦有极少量，可能有自然死亡的神经元或与标本制作损伤有关。但本实验海马各亚区呈色细胞分布、数量无规律，推论：可能与标本例数少有关；缺血再灌流早期不宜选海马作比较对象，以选额顶皮质取材为好。由于Ashawal等[4]的实验提示缺血再灌流早期额顶皮质为半暗带，本实验治疗组在皮质区呈色神经元数各时相均比对照组少(P<0.05)，说明7-NI干预后，顶皮质即半暗带内早期变性的神经元数目可减少。
, 百拇医药
3.4 7-NI在脑缺血再灌流早期保护作用的可能机理
局灶性脑缺血早期，大量NO主要来源于nNOS，直接引起脑损害[5]；在再灌流期，NO又与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸离子(ONOO-)，它的毒性比NO更强[6，7]。本实验证明，特异性nNOS抑制剂7-NI(50 mg/kg)能使MDA降低，减轻脑组织病理损伤，这与文献报道[3，8]一致，所以作者认为，7-NI是通过抑制神经元型NOS活性，使NO水平下降，抑制NO对神经元的直接损伤，且间接抑制ONOO-，抑制脂质过氧化，使MDA含量下降，稳定膜结构和功能，维护细胞内外环境的稳定性，维持线粒体功能，从而减轻脑缺血再灌流损伤后病理损害程度，由此推断选择nNOSⅠ 7-NI有益于脑缺血再灌流损伤早期治疗。其远期效果如对迟发神经元坏死、细胞凋亡、最终梗死体积形成的影响还有待进一步研究。
综上所述，选用适量7-NI，可减轻脑缺血再灌流后神经元的损伤，可能有利于改善脑卒中的预后，值得进一步观察研究，为临床治疗缺血性脑血管病应用nNOSⅠ提供了实验依据。■
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参考文献：
[1]Longa EZ,Wenstein PR.Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke, 1989;20:84～91
[2]Andras Czurko, Hitoo Nishino.“Collapsed"(argyrophilic,dark)neurons in rat model of transient focal cerebral ischemia.Neurosci Lett,1993;162:71～74
[3]Coert BA,Anderson RE,Meyer FB. A comparative study of the effects of two NOSⅠs and two NO donors on temporary focal cerebral ischemia in the Wistar rat.J Neurosurg, 1999;90:332～338
, http://www.100md.com
[4]Ashwal S,Tone B,Tian HR, et al.Core and penumbral NOS activity during cerebral ischemia and reperfusion.Stroke, 1998; 29:1037～1047
[5]Samdani AF, Dawson TM,Dawson VL.NOS in models of focal ischemia.Stroke,1997;28:1283～1288
[6]冯亦璞.缺血性脑卒中的病理生理及药物治疗现状.药学学报，1999；34：72～78
[7]Brorson JR,Schumacker PT,Zhang H.NO actely inhibits neuronal energy production.J Neurosci, 1999;19:147～158
[8]姜德华，金南革，玄汉石，等.7-NI减小大鼠暂时性局灶性脑梗塞灶范围.中风与神经疾病杂志，1998；15：342～344
杨期东审稿 黄其伟编辑
1999-07-10收稿, 百拇医药