钙在CVB3诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用
作者：黄志刚 乔建国 于维汉
单位：黄志刚(中国人民解放军305医院 老年病研究中心，北京 100017)；乔建国(武警总医院 心内科，北京 100039)；于维汉(哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：柯萨奇病毒B3；细胞凋亡；钙；共聚焦显微镜检查；心肌细胞
中国地方病学杂志000404 [摘要] 目的 探讨细胞内游离钙[Ca2+] i在柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导培养心肌细胞凋亡中的作用。方法 DNA裂点检测法(3′-末端标记)及透射电镜检测细胞凋亡。Fluo3-AM负载心肌细胞，共聚焦显微镜观察[Ca2+] i荧光强度变化。结果 感染24 h心肌细胞内CVB3滴度达峰值。感染10 h未见凋亡的心肌细胞，17、24和36 h凋亡细胞分别为5%、60%和90%，感染17 h心肌[Ca2+] i浓度达峰值。电镜结果提示CVB3感染组存在典型的凋亡心肌细胞。结论 CVB3可诱导培养心肌细胞的凋亡过程。细胞内Ca2+参与凋亡细胞的信息传导过程，并在凋亡早期发挥重要作用。
, 百拇医药
[中图分类号]R373.2+3;Q954.66+ [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)04-248-03
Role of cytosolic-Ca2+ in the myocardial cell apoptosis induced by Coxsakie B3 virus
HUANG Zhi-gang, QIAO Jan-guo, YU Wei-han
(PLA 305th Hospital Genealogy Research Center, Beijing 100017, China)
Abstract： Objective To explore the role of cytosolic free calcium ([Ca2+] i) in apoptosis induced by coxsackievirus B3 (CVB3) in cultured cardiomyocytes of rats.Methods Primary cultured cardiomyocyte was prepared from Wistar rats ages 2～3 d.The apoptosis in cardiomyocyte was determined by terminated deoxynucleotide transferase directed d-UTP nick and end labeling (TUNEL) method,and the apoptosis was observed under a transmission electron microscope.[Ca2+] i in single cardiomyocyte loaded with Fluo3-AM was measured by confocal microscope.Results The concentration of CVB3 in the medium reached the peak at 24 h after CVB3 infection.The apoptotic cells were not found in CVB3 -infected cardiomyocyte in the first 10 h,but amounted to 5% at 17 h,60% at 24 h,and 90% at 36 h.The peak value of [Ca2+] i elevation was reached at 17 h after CVB3 infection (P<0.01).The characteristics of apoptosis were also seen by transmission electron microscope.Conclusions CVB3 induced the apoptosis in cultured cardiomyocyte,and [Ca2+] i mobilization was involved in the signal transduction process in apoptosis cells,and played an important role especially in the early stage of apoptosis indued by CVB3
, 百拇医药
Key words：Coxsackieviruses B3; Apoptosis; Calcium; Confocal microscopy; Myocaridum cells
柯萨奇病毒B3(CVB3)是小RNA病毒科肠道病毒属，为结构简单的裸体病毒，呈嗜心肌性，为病毒性心肌炎的主要致病因素。研究表明CVB3可直接损伤心肌，导致心肌细胞溶解坏死。凋亡机制参与了慢性病毒性心肌炎的病理损伤过程[1]，并且于心肌中持续存在CVB病毒RNA[2]。而慢性期心肌内CTL等炎细胞明显减少，其凋亡是否由持续存在的CVB RNA所诱导，故推想CVB3在一定条件下可能具有诱导心肌细胞凋亡作用。而Ca2+作为一重要的第二信使参与胞浆代谢，基因转录和表达，同时亦参与细胞分化、再生和凋亡的调节过程。本研究试图揭示CVB3可诱导心肌细胞凋亡，以及细胞内游离钙([Ca2+] i)在凋亡过程中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂 TUNEL检测细胞凋亡试剂盒、Oncon产品。Fluo3-AM MPEOR USA产品(溶于Mg2SO4 1 g/L,贮存于-20℃暗处)。Pluronic F-127 Sigma产品。
1.2 病毒滴定 以HeLa细胞观测感染CVB3 0、10、17、24、36 h不同时间培养心肌细胞病毒悬液致细胞病变作用。常规采用Reed-Muench方法计算TCID50。
1.3 制备培养的心肌细胞 无菌摘取出生后2～3 d的Wistar大鼠的心脏(动物由哈医大动物实验中心提供，二级实验动物，证号No：00921)，将其切成1mm3的小块，以0.2%胶原酶消化成单细胞悬液，经20%FCS的RPMI-1640悬浮洗涤，及反复纯化后，计数活细胞百分数大于90%，调细胞悬液为5×108/L加入25 cm2培养瓶和6孔培养板中(孔内放25 mm圆形盖玻片)，于CO2培养箱中培养48 h后，将细胞分成2个组。一组正常组，另一组为感染组。以RPMI 1640稀释的103TCID50CVB3吸附1.5 h，继续加生长液培养。用于凋亡检测，电镜检查，病毒滴定，Fluo3-AM负载及[Ca2+] i的测定。
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1.4 TUNEL法检测凋亡细胞 按美国Oncon公司生产的试剂盒方法检测。正常细胞核呈淡兰色，凋亡细胞呈淡褐色。
1.5 透射电镜检查 收集培养不同时间的心肌细胞(正常组及对照组)，进行常规透射电镜病理标本制作及超微结构观察。
1.6 Fluo3-AM负载 将盖玻片上培养的心肌细胞，以无钙PBS液冲洗2次(于37℃温度下)，以含有0.03%F-127的Fluo3-AM 4 μmol/L工作液冲洗40 min,再以CaCl2 1.5 μmol/L的PBS冲洗，除去细胞外Fluo3-AM然后行[Ca2+] i测定。
1.7 [Ca2+] i的测定 取附有Fluo3-AM负载后的培养心肌细胞的盖玻片，载于Futtofloul(R)细胞室上，向室内如入400 μl 5% FCS无酚红RPMI1640维持液。使用Insight Plus激光共聚焦显微镜，在40×物镜下观察，以488 nm的兰激光激发，探测530 nm处的荧光发射，动态记录出Fluo3-AM所指示的Ca2+的荧光强度变化(FI)。
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1.8 统计学分析 数据以(
±s)表示，样本均数的比较用t检验。
2 结果
2.1 培养细胞悬液TCID50 正常组无感染。感染组：CVB3感染24 h时TCID50达峰值(表1)。
2.2 心肌细胞凋亡 正常细胞呈淡兰色，凋亡细胞呈淡褐色。正常组无凋亡细胞，感染组于CVB3感染17 h可观察到凋亡细胞，于36 h凋亡百分率最高(表1)。
表1 培养心肌细胞、[Ca2+] i荧光强度TUNEL
阳性率、TCID50 时间
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(h)
[Ca2+] i/FI
TUNEL
阳性%
TCID50
正常组
感染组
0
10
17
24
36
970±59
, http://www.100md.com
984±35a
1008±42a
986±72a
964±46
106±214a
2262±382c
1386±272d
0
0
5.0
60.0
, http://www.100md.com
90.0
0
0.5
2.0
4.77
4.23
注：[Ca2+] i以荧光强度(FI)表示，8只鼠，x±s，aP<0.05,cP<0.01,dP<0.05(与0h比较)
2.3 [Ca2+] i荧光强度变化 [Ca2+] i荧光强度于24 h内正常组无变化。感染组感染10 h内[Ca2+] i无显著变化。但17 h时FI由静息水平达到高峰，与正常组比较P<0.01。并持续升高至感染后24 h，其与正常组比较P<0.05(表1，图1)。
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图1 培养心肌细胞[Ca2+] i荧光强度变化
A：CVB3感染前；B：CVB3感染17 h，FI显著增高
2.4 形态学改变
2.4.1 倒置显微镜观察 正常组心肌细胞贴壁生长，排列紧密呈棱形或梭形。感染组：CVB3感染17 h前几乎无明显形态改变，但24 h可见部分细胞变圆，折光性增强，与周围细胞失去联系，但仍保持贴壁，36 h圆形细胞增多，并出现体积缩小的悬浮细胞。
2.4.2 透射电镜观察 正常组心肌细胞核膜完整光滑，常染色质细致丰富，有少许溶酶体，肌丝完整。感染组于24、36 h可见部分心肌细胞核染色质边集凝聚，胞浆浓缩，细胞器无大改变的典型凋亡形态改变。但同时可见许多细胞表现为线粒体肿胀、溶酶体增多、内质网扩张、肌丝分解、核膜断裂甚至全部细胞器分解消失等坏死征象，以36 h改变最明显。
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3 讨论
许多RNA病毒基因产物可诱导靶细胞凋亡，如腺病毒E1A蛋白[3]、HIVqp120蛋白[4]。CVB3为小RNA病毒，既往研究认为是以溶解性坏死的方式损伤心肌细胞。但在我们的实验中发现心肌受CVB3攻击后电镜下除可见大量的溶细胞现象，如线粒体肿胀、溶酶体增多、内质网扩张、肌丝分解、核膜断裂、甚至全部细胞器分解消失等外，尚可见典型的凋亡形态改变，如核染色质边集凝聚、胞浆浓缩、细胞器无大改变等。TUNEL法原位检测也证实受CVB3攻击的心肌细胞存在DNA裂点，即存在凋亡细胞。TUNEL法检测结果显示CVB3感染24 h时有60%凋亡阳性细胞，感染36 h达90%，并且以完整形态附于玻片上。而电镜下感染24、36 h时细胞大部分呈溶细胞现象。分析：①电镜标本制备过程中受CVB3攻击的心肌细胞经分离、洗涤、离心等处理后，发生暴发性肿胀溶解坏死。②CVB3感染24、36 h时部分细胞变圆收缩、甚至脱落形成悬浮细胞，此部分细胞在TUNEL法原位标测中反复冲洗可能发生丢失或溶解，而电镜检查却包括此部分细胞，致使溶细胞现象多于凋亡现象。而早期凋亡细胞仍附于玻片上，并被TUNEL法所标记。此点亦证实DNA断裂先于细胞溶解，即体外培养系中凋亡细胞早期可维持质膜完整，具有凋亡征象，而晚期时则发生继发性坏死的理论。③从TUNEL检测理论分析：CVB3病毒RNA复制时产生的3′末端并不影响凋亡检测，因为CVB3为小RNA病毒，于胞浆光滑内质网上复制,不在细胞核中复制，况且试剂盒的TDT酶为DNA依赖性3′末端转移酶，不会将标记物标记在复制的RNA3′末端。TUNEL阳性结果支持电镜凋亡形态结果。CVB3可诱导心肌细胞发生凋亡。
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共聚焦显微镜检测[Ca2+] i及病毒滴定结果显示：CVB3诱导心肌细胞[Ca2+] i达高峰时间(感染17h)，显著早于其诱导心肌细胞发生凋亡高峰时间(感染24h)，并于凋亡过程中保持较高水平。结合凋亡高峰期间CVB3亦大量复制的结果，提示CVB3诱导的心肌细胞凋亡，[Ca2+] i参与了其凋亡信息传递过程。在体CVB3心肌炎模型中心肌C-myc基因高表达。推测增高的[Ca2+] i，使细胞核内钙离子浓度增高，激活了凋亡相关的初始反应基因，如C-fos，C-myc基因的高表达，或Bcl-2的低表达或不表达等[5]。从而触发靶细胞的死亡程序，最终激活核酸内切酶，损伤DNA导致凋亡的发生。
综上所述，研究结果表明：CVB3可诱导培养的大鼠心肌细胞发生凋亡，[Ca2+] i参与其凋亡早期的信息传递过程。
, 百拇医药
[基金来源]黑龙江省自然科学基金(D9718)
[作者简介]黄志刚(1963-)，男，医学博士。
参考文献
[1] 钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系[J].中国地方病学杂志，1997，16(4)：203-206.
[2] Archard LC,Bowles NE,Cunningham L,et al.Molecular probes for detection of persisting enterovirus infection of human heart and their prognostic value[J].Eur Heart J,1991,12:56-59.
[3] Debbas M,White E.Wide type p53 mediates apoptosis by E1A,which is inhibited by E1B[J].Genes Dev,1993,7:546-554.
, 百拇医药
[4] Terai C,Kombluth RS,Pauza CD,et al.Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T 1ymphoblasts acutely infected with HIV-1[J].J Clin Invest,1991,87:1710-1715.
[5] Hale AJ,Smith CA,Sutherland LC,et al.Apoptosis:molecular regulation of cell death[J].Eur J Biochem,1996,236:1-26.
[收稿日期]1999-10-22;[修订日期]2000-02-01, http://www.100md.com
单位：黄志刚(中国人民解放军305医院 老年病研究中心，北京 100017)；乔建国(武警总医院 心内科，北京 100039)；于维汉(哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：柯萨奇病毒B3；细胞凋亡；钙；共聚焦显微镜检查；心肌细胞
中国地方病学杂志000404 [摘要] 目的 探讨细胞内游离钙[Ca2+] i在柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导培养心肌细胞凋亡中的作用。方法 DNA裂点检测法(3′-末端标记)及透射电镜检测细胞凋亡。Fluo3-AM负载心肌细胞，共聚焦显微镜观察[Ca2+] i荧光强度变化。结果 感染24 h心肌细胞内CVB3滴度达峰值。感染10 h未见凋亡的心肌细胞，17、24和36 h凋亡细胞分别为5%、60%和90%，感染17 h心肌[Ca2+] i浓度达峰值。电镜结果提示CVB3感染组存在典型的凋亡心肌细胞。结论 CVB3可诱导培养心肌细胞的凋亡过程。细胞内Ca2+参与凋亡细胞的信息传导过程，并在凋亡早期发挥重要作用。
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[中图分类号]R373.2+3;Q954.66+ [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)04-248-03
Role of cytosolic-Ca2+ in the myocardial cell apoptosis induced by Coxsakie B3 virus
HUANG Zhi-gang, QIAO Jan-guo, YU Wei-han
(PLA 305th Hospital Genealogy Research Center, Beijing 100017, China)
Abstract： Objective To explore the role of cytosolic free calcium ([Ca2+] i) in apoptosis induced by coxsackievirus B3 (CVB3) in cultured cardiomyocytes of rats.Methods Primary cultured cardiomyocyte was prepared from Wistar rats ages 2～3 d.The apoptosis in cardiomyocyte was determined by terminated deoxynucleotide transferase directed d-UTP nick and end labeling (TUNEL) method,and the apoptosis was observed under a transmission electron microscope.[Ca2+] i in single cardiomyocyte loaded with Fluo3-AM was measured by confocal microscope.Results The concentration of CVB3 in the medium reached the peak at 24 h after CVB3 infection.The apoptotic cells were not found in CVB3 -infected cardiomyocyte in the first 10 h,but amounted to 5% at 17 h,60% at 24 h,and 90% at 36 h.The peak value of [Ca2+] i elevation was reached at 17 h after CVB3 infection (P<0.01).The characteristics of apoptosis were also seen by transmission electron microscope.Conclusions CVB3 induced the apoptosis in cultured cardiomyocyte,and [Ca2+] i mobilization was involved in the signal transduction process in apoptosis cells,and played an important role especially in the early stage of apoptosis indued by CVB3
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Key words：Coxsackieviruses B3; Apoptosis; Calcium; Confocal microscopy; Myocaridum cells
柯萨奇病毒B3(CVB3)是小RNA病毒科肠道病毒属，为结构简单的裸体病毒，呈嗜心肌性，为病毒性心肌炎的主要致病因素。研究表明CVB3可直接损伤心肌，导致心肌细胞溶解坏死。凋亡机制参与了慢性病毒性心肌炎的病理损伤过程[1]，并且于心肌中持续存在CVB病毒RNA[2]。而慢性期心肌内CTL等炎细胞明显减少，其凋亡是否由持续存在的CVB RNA所诱导，故推想CVB3在一定条件下可能具有诱导心肌细胞凋亡作用。而Ca2+作为一重要的第二信使参与胞浆代谢，基因转录和表达，同时亦参与细胞分化、再生和凋亡的调节过程。本研究试图揭示CVB3可诱导心肌细胞凋亡，以及细胞内游离钙([Ca2+] i)在凋亡过程中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂 TUNEL检测细胞凋亡试剂盒、Oncon产品。Fluo3-AM MPEOR USA产品(溶于Mg2SO4 1 g/L,贮存于-20℃暗处)。Pluronic F-127 Sigma产品。
1.2 病毒滴定 以HeLa细胞观测感染CVB3 0、10、17、24、36 h不同时间培养心肌细胞病毒悬液致细胞病变作用。常规采用Reed-Muench方法计算TCID50。
1.3 制备培养的心肌细胞 无菌摘取出生后2～3 d的Wistar大鼠的心脏(动物由哈医大动物实验中心提供，二级实验动物，证号No：00921)，将其切成1mm3的小块，以0.2%胶原酶消化成单细胞悬液，经20%FCS的RPMI-1640悬浮洗涤，及反复纯化后，计数活细胞百分数大于90%，调细胞悬液为5×108/L加入25 cm2培养瓶和6孔培养板中(孔内放25 mm圆形盖玻片)，于CO2培养箱中培养48 h后，将细胞分成2个组。一组正常组，另一组为感染组。以RPMI 1640稀释的103TCID50CVB3吸附1.5 h，继续加生长液培养。用于凋亡检测，电镜检查，病毒滴定，Fluo3-AM负载及[Ca2+] i的测定。
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1.4 TUNEL法检测凋亡细胞 按美国Oncon公司生产的试剂盒方法检测。正常细胞核呈淡兰色，凋亡细胞呈淡褐色。
1.5 透射电镜检查 收集培养不同时间的心肌细胞(正常组及对照组)，进行常规透射电镜病理标本制作及超微结构观察。
1.6 Fluo3-AM负载 将盖玻片上培养的心肌细胞，以无钙PBS液冲洗2次(于37℃温度下)，以含有0.03%F-127的Fluo3-AM 4 μmol/L工作液冲洗40 min,再以CaCl2 1.5 μmol/L的PBS冲洗，除去细胞外Fluo3-AM然后行[Ca2+] i测定。
1.7 [Ca2+] i的测定 取附有Fluo3-AM负载后的培养心肌细胞的盖玻片，载于Futtofloul(R)细胞室上，向室内如入400 μl 5% FCS无酚红RPMI1640维持液。使用Insight Plus激光共聚焦显微镜，在40×物镜下观察，以488 nm的兰激光激发，探测530 nm处的荧光发射，动态记录出Fluo3-AM所指示的Ca2+的荧光强度变化(FI)。
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1.8 统计学分析 数据以(
±s)表示，样本均数的比较用t检验。2 结果
2.1 培养细胞悬液TCID50 正常组无感染。感染组：CVB3感染24 h时TCID50达峰值(表1)。
2.2 心肌细胞凋亡 正常细胞呈淡兰色，凋亡细胞呈淡褐色。正常组无凋亡细胞，感染组于CVB3感染17 h可观察到凋亡细胞，于36 h凋亡百分率最高(表1)。
表1 培养心肌细胞、[Ca2+] i荧光强度TUNEL
阳性率、TCID50 时间
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(h)
[Ca2+] i/FI
TUNEL
阳性%
TCID50
正常组
感染组
0
10
17
24
36
970±59
, http://www.100md.com
984±35a
1008±42a
986±72a
964±46
106±214a
2262±382c
1386±272d
0
0
5.0
60.0
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90.0
0
0.5
2.0
4.77
4.23
注：[Ca2+] i以荧光强度(FI)表示，8只鼠，x±s，aP<0.05,cP<0.01,dP<0.05(与0h比较)
2.3 [Ca2+] i荧光强度变化 [Ca2+] i荧光强度于24 h内正常组无变化。感染组感染10 h内[Ca2+] i无显著变化。但17 h时FI由静息水平达到高峰，与正常组比较P<0.01。并持续升高至感染后24 h，其与正常组比较P<0.05(表1，图1)。
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图1 培养心肌细胞[Ca2+] i荧光强度变化
A：CVB3感染前；B：CVB3感染17 h，FI显著增高
2.4 形态学改变
2.4.1 倒置显微镜观察 正常组心肌细胞贴壁生长，排列紧密呈棱形或梭形。感染组：CVB3感染17 h前几乎无明显形态改变，但24 h可见部分细胞变圆，折光性增强，与周围细胞失去联系，但仍保持贴壁，36 h圆形细胞增多，并出现体积缩小的悬浮细胞。
2.4.2 透射电镜观察 正常组心肌细胞核膜完整光滑，常染色质细致丰富，有少许溶酶体，肌丝完整。感染组于24、36 h可见部分心肌细胞核染色质边集凝聚，胞浆浓缩，细胞器无大改变的典型凋亡形态改变。但同时可见许多细胞表现为线粒体肿胀、溶酶体增多、内质网扩张、肌丝分解、核膜断裂甚至全部细胞器分解消失等坏死征象，以36 h改变最明显。
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3 讨论
许多RNA病毒基因产物可诱导靶细胞凋亡，如腺病毒E1A蛋白[3]、HIVqp120蛋白[4]。CVB3为小RNA病毒，既往研究认为是以溶解性坏死的方式损伤心肌细胞。但在我们的实验中发现心肌受CVB3攻击后电镜下除可见大量的溶细胞现象，如线粒体肿胀、溶酶体增多、内质网扩张、肌丝分解、核膜断裂、甚至全部细胞器分解消失等外，尚可见典型的凋亡形态改变，如核染色质边集凝聚、胞浆浓缩、细胞器无大改变等。TUNEL法原位检测也证实受CVB3攻击的心肌细胞存在DNA裂点，即存在凋亡细胞。TUNEL法检测结果显示CVB3感染24 h时有60%凋亡阳性细胞，感染36 h达90%，并且以完整形态附于玻片上。而电镜下感染24、36 h时细胞大部分呈溶细胞现象。分析：①电镜标本制备过程中受CVB3攻击的心肌细胞经分离、洗涤、离心等处理后，发生暴发性肿胀溶解坏死。②CVB3感染24、36 h时部分细胞变圆收缩、甚至脱落形成悬浮细胞，此部分细胞在TUNEL法原位标测中反复冲洗可能发生丢失或溶解，而电镜检查却包括此部分细胞，致使溶细胞现象多于凋亡现象。而早期凋亡细胞仍附于玻片上，并被TUNEL法所标记。此点亦证实DNA断裂先于细胞溶解，即体外培养系中凋亡细胞早期可维持质膜完整，具有凋亡征象，而晚期时则发生继发性坏死的理论。③从TUNEL检测理论分析：CVB3病毒RNA复制时产生的3′末端并不影响凋亡检测，因为CVB3为小RNA病毒，于胞浆光滑内质网上复制,不在细胞核中复制，况且试剂盒的TDT酶为DNA依赖性3′末端转移酶，不会将标记物标记在复制的RNA3′末端。TUNEL阳性结果支持电镜凋亡形态结果。CVB3可诱导心肌细胞发生凋亡。
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共聚焦显微镜检测[Ca2+] i及病毒滴定结果显示：CVB3诱导心肌细胞[Ca2+] i达高峰时间(感染17h)，显著早于其诱导心肌细胞发生凋亡高峰时间(感染24h)，并于凋亡过程中保持较高水平。结合凋亡高峰期间CVB3亦大量复制的结果，提示CVB3诱导的心肌细胞凋亡，[Ca2+] i参与了其凋亡信息传递过程。在体CVB3心肌炎模型中心肌C-myc基因高表达。推测增高的[Ca2+] i，使细胞核内钙离子浓度增高，激活了凋亡相关的初始反应基因，如C-fos，C-myc基因的高表达，或Bcl-2的低表达或不表达等[5]。从而触发靶细胞的死亡程序，最终激活核酸内切酶，损伤DNA导致凋亡的发生。
综上所述，研究结果表明：CVB3可诱导培养的大鼠心肌细胞发生凋亡，[Ca2+] i参与其凋亡早期的信息传递过程。
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[基金来源]黑龙江省自然科学基金(D9718)
[作者简介]黄志刚(1963-)，男，医学博士。
参考文献
[1] 钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系[J].中国地方病学杂志，1997，16(4)：203-206.
[2] Archard LC,Bowles NE,Cunningham L,et al.Molecular probes for detection of persisting enterovirus infection of human heart and their prognostic value[J].Eur Heart J,1991,12:56-59.
[3] Debbas M,White E.Wide type p53 mediates apoptosis by E1A,which is inhibited by E1B[J].Genes Dev,1993,7:546-554.
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[4] Terai C,Kombluth RS,Pauza CD,et al.Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T 1ymphoblasts acutely infected with HIV-1[J].J Clin Invest,1991,87:1710-1715.
[5] Hale AJ,Smith CA,Sutherland LC,et al.Apoptosis:molecular regulation of cell death[J].Eur J Biochem,1996,236:1-26.
[收稿日期]1999-10-22;[修订日期]2000-02-01, http://www.100md.com