CML病人TCR Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点
作者：李扬秋 陈少华 杨力建 祁明芳9yn, http://www.100md.com
单位：李扬秋(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)；陈少华(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)；杨力建(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)；祁明芳(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)9yn, http://www.100md.com
关键词：T细胞受体Vβ基因；互补决定区3；T细胞克隆；白血病9yn, http://www.100md.com
免疫学杂志000308 [摘 要]目的 分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点。方法 利用RT-PCR扩增3例CML外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的CDR3，了解TCR VβT细胞的分布。阳性产物进一步经基因扫描分析，了解其克隆性。寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果 3例病人仅存在3～9个TCR Vβ亚家族T细胞，部分Vβ亚家族T细胞呈寡克隆性增殖，Vβ21的寡克隆T细胞见于全部的3例病人中。结论 CML病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞出现倾斜性分布和克隆性增殖，这可能是CML中机体对恶性细胞所引起的特异性免疫反应，但对不同病人的Vβ21寡克隆T细胞序列分析并未能发现完全同源的CDR3序列。9yn, http://www.100md.com
[中图分类号]R371.22；R733.7 [文献标识码]A9yn, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0189-049yn, http://www.100md.com
The feature of CDR3 sequence of TCR Vβ21 oligoclonal T cells in CML9yn, http://www.100md.com
LI Yang-qiu，CHEN Shao-hua，YANG Li-jian，QI Ming-fang9yn, http://www.100md.com
(Department Hematology，Jinan University，Guangzhou 510632，China)9yn, http://www.100md.com
[Abstract]Objective To investigate the clonal expansion and the feature of CDR3 sequence of T cells in patients with chronic myelogenous leukemia (CML).Methods The CDR3 of TCR Vβ 24 subfamily genes were amplified in peripheral blood mononuclear cells from 3 cases with CML using RT-PCR，to observe the distribution of TCR Vβ subfamily T cells，the PCR products were further analyzed by genescan technique to evaluate clonality of the detectable TCR Vβ T cells.The products of the oligoclonal T cells were analyzed by sequencing to define the sequence of CDR3.Resulst Only 3～9 Vβ subfamily T cells could be identified in 3 CML cases.Oligoclonal expansion T cells could be detected and Vβ21 oligoclonal T cells were identified in all 3 cases.Conclusions The skew distribution and clonal expansion of TCR Vβ subfamily T cells could be found on the patients with CML.It may be a feature of the host immune response for malignant cells in CML.However，the completely homologous CDR3 sequence of Vβ21 oligoclonal T cells from different cases could not be detected.
[Key words]T cell receptor Vβ gene；CDR3；T cell clonality；leukemiakk4/l, 百拇医药
T细胞受体(TCR)重排过程中，其可变区(V)、多样区(D)和结合区(J)的基因片段进行重排和随机插入核甘酸(N区)形成一高度可变区，称为互补决定区3(CDR3)。同一克隆T细胞重排后，其CDR3长度和序列完全相同，而不同克隆T细胞有所不同，其长度的差别可为3～24个碱基，故对CDR3长度和序列的分析，可以作为判别T细胞克隆性的指标[1]。利用RT-PCR和基因扫描方法分析TCR Vβ24个亚家族的CDR3长度确定T细胞克隆性是国外近年开展的新方法[2]。该方法被迅速用于分析肿瘤病人外周血或肿瘤组织浸润性T细胞中的克隆性增殖T细胞情况，借此深入了解机体对肿瘤细胞相关抗原的特异性反应情况[2，3]。kk4/l, 百拇医药
1 材料与方法kk4/l, 百拇医药
1.1 样本 经细胞形态学、组织化学和细胞遗传学确诊的CML病人3例(编号为C1、C2和C3)。1例出现TCR Vβ21寡克隆T细胞的T细胞白血病(T-ALL)的标本及T细胞株Molt-4和Jurkat作为单克隆对照。B细胞株Raji作为阴性对照。外周血单个核细胞的分离按常规方法进行。kk4/l, 百拇医药
1.2 RNA提取和cDNA合成 RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco，BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Superscript Ⅱ，Gibco，BRL)反转录合成cDNA第一链。均按常规方法进行。kk4/l, 百拇医药
1.3 引物 用于非标记PCR的24个 Vβ引物和一Cβ引物[2～4]，用于runoff reaction的5’端荧光素标记的Cβ-fam[2～4]引物和用于序列分析的5’端生物素标记的Cβ-bio 5’-Bio-CACAGCGACCTCGGG-TGGGAA引物均由德国柏林TIB MOLBIOL公司合成。kk4/l, 百拇医药
1.4 RT-PCR PCR按已报道的方法进行[2～4]。总反应体积为25μl，其中含1μl cDNA，任一Vβ引物(24个Vβ引物之一)和Cβ引物(0.5μmol/L)，0.1m mol/L dNTP，1.25U Taq聚合酶(Perkin Elmer)和1×PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪(Perkin Elmer)中进行。共进行40循环，每一循环包括：94°C 1min(首次3min)，60°C 1min和72°C 1min(末次10min)，PCR产物保存于4°C中备用。
1.5 T细胞克隆性分析'g], http://www.100md.com
1.5.1 Runoff reactions(标记PCR产物)：10μl的反应体系含2μl的未标记的PCR产物、0.1μmol/L Cβ-fam引物、3mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.25U Taq聚合酶和PCR缓冲液。PCR共进行35循环，退火温度为66°C，余同上[4]。'g], http://www.100md.com
1.5.2 基因扫描分析(CDR3长度分析)：有关操作步骤按使用指南进行。荧光素标记的PCR产物(2μl)加入2.5μl甲酰胺，0.5μl Genescan-500 Tamra分子量标准品(ABI，Perkin Elmer)和0.5μl加样缓冲液(Dextran 50mg/ml，EDTA 25mmol/L，Genescan-500 Tamra Kit)，经94°C、4min变性后，于6%聚丙酰胺凝胶中电泳，经373A DNA序列仪(ABI，Perkin Elmer)的基因扫描672分析软件分析产物的长度和荧光素强度。'g], http://www.100md.com
由于Vβ和Cβ引物是固定的，故Vβ/Cβ所扩增的PCR产物的大小决定于Vβ-Dβ、Dβ-Jβ之间重排时的连接片段N区和Dβ的长短，即VβNDβNJβ(CDR3)，不同的T细胞克隆的PCR产物长度和含量有所不同，通过PCR产物的状况，便可了解体内T细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam)标记的产物通过基因扫描软件分析，电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量；峰的形态提示产物的均一性(克隆性)，当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，电泳时，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头，所显示的结果为一单峰图象，提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞，即单克隆的细胞；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性[4]。'g], http://www.100md.com
1.6 PCR产物直接序列分析 100μl生物素标记PCR产物经磁珠(Dynabeads M-280 Streptavidin，Dynal A.S.Norway)纯化并重新溶解于20μl纯净水中。1μl纯化的产物用于直接序列分析，应用非放射性、双脱氧核苷酸末端终止法和T-Dye Terminator cycle sequencing ready reaction试剂盒(含AmpliTaq DNA聚合酶，ABI，Perkin Elmer)的方法。反应后的产物干燥后重悬于4μl加样缓冲液[配制：4μl重结晶去离子甲酰胺和1μl 50mmol/L Na2EDTA，pH8.0/blue dextran(30mg/ml)]，经90°C 2min热变性后，于6%聚丙酰胺凝胶及373A DNA序列仪(ABI，Perkin Elmer)中进行序列分析。
2 结果iaw, 百拇医药
2.1 TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况 RT-PCR扩增结果：3例CML病人外周血分别存在9、3和3个Vβ亚家族T细胞(见表1)，1例T-ALL存在18个Vβ亚家族T细胞，Molt-4和Jurkat细胞则均为表达单一TCR Vβ的T细胞，分别为Vβ2和Vβ8T细胞。iaw, 百拇医药
表1 RT-PCR和基因扫描分析TCR Vβ亚家族T细胞克隆性的结果iaw, 百拇医药
Tab 1 The result of clonality of TCR Vβ subfamily T cells by RT-PCR and genescan analysis Primeriaw, 百拇医药
C1iaw, 百拇医药
C2iaw, 百拇医药
C3iaw, 百拇医药
T-ALLiaw, 百拇医药
Molt-4iaw, 百拇医药
Jurkatiaw, 百拇医药
Vβ1iaw, 百拇医药
poly*1iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
Vβ2iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
mono*4iaw, 百拇医药
Vβ3iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
Vβ5iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
poly
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ6|'\, http://www.100md.com
oligo|'\, http://www.100md.com
Vβ8|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
mono|'\, http://www.100md.com
Vβ9|'\, http://www.100md.com
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Vβ10|'\, http://www.100md.com
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Vβ12|'\, http://www.100md.com
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Vβ13|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
bi*3|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ14|'\, http://www.100md.com
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Vβ15|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ17|'\, http://www.100md.com
oligo*2|'\, http://www.100md.com
oligo|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ18|'\, http://www.100md.com
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Vβ19|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ21|'\, http://www.100md.com
oligo
oligo/:1, http://www.100md.com
oligo/:1, http://www.100md.com
mono/:1, http://www.100md.com
Vβ22/:1, http://www.100md.com
poly/:1, http://www.100md.com
Vβ23/:1, http://www.100md.com
poly/:1, http://www.100md.com
Vβ24/:1, http://www.100md.com
poly/:1, http://www.100md.com
*1：polyclone； *2：oligoclone； *3：biclone： *4：monoclone/:1, http://www.100md.com
2.2 T细胞克隆性分析结果 基因扫描分析结果显示：Molt-4和Jurkat的Vβ2或Vβ8 PCR产物均呈单峰图象(单克隆)；3例CML病人的Vβ21 PCR产物均呈一主峰及个别矮峰图象(寡克隆)，病例1和病例3均在Vβ17出现寡克隆T细胞，病例3还在Vβ13出现双克隆T细胞，其余的Vβ PCR产物均呈多峰图象(多克隆，见图1)，T-ALL的PCR产物在Vβ6和Vβ9呈寡克隆性，而在Vβ21呈单克隆性，余为多
/:1, http://www.100md.com
图1 上图：1例CML(C1)外周血TCR Vβ T细胞基因扫描分析结果，Vβ17和Vβ21为一主峰图象(寡克隆)，余为多峰图象(多克隆)。/:1, http://www.100md.com
下图：3例CML(C1-C3)和1例T-ALL的Vβ21 T细胞的基因扫描分析结果，C1-C3均为寡克隆图象，T-ALL为单峰图象(单克隆)。/:1, http://www.100md.com
Fig 1 Over Fig： The result of genescan analysis in TCR Vβ T cell of peripheral blood from 1 cases with CML(C1)./:1, http://www.100md.com
A dominant peak (oligoclone) was found in Vβ17 and Vβ21 subfamily，whereas multi-peak(polyclone)were showed in the other Vβ subfamilies.Under Fig：The result of genescan anlaysis in Vβ21 T cells
from 3 cases with CML and 1 case T-ALL，oligoclonal pictures were]l(6], 百拇医药
showed in C1-C3 and monopeak(monoclone) was showed in T-ALL.克隆性。]l(6], 百拇医药
2.3 CDR3序列分析结果 对3例CML出现的Vβ21寡克隆性的PCR产物和1例T-ALL所出现的Vβ21单克隆性的PCR产物的序列分析的结果显示3例CML的V-D、D-J连接区和D区的序列有所不同，另外3者所利用的J片段分别为Jβ2.3、Jβ2.1和Jβ1.3(见表2)。]l(6], 百拇医药
表 2 2例CML和1例T-ALL病人外周血的Vβ21克隆性增殖T细胞的CDR3序列]l(6], 百拇医药
Tab2 CDR3 sequences of Vβ21 clonal expansion T cells in PBL form 3 CML and 1 T-ALL cases Case]l(6], 百拇医药
Vβ21]l(6], 百拇医药
NDN]l(6], 百拇医药
Jβ]l(6], 百拇医药
C1]l(6], 百拇医药
CGGCTCGTGTATCTCTGCCAGCAGC]l(6], 百拇医药
TATTGGGGG]l(6], 百拇医药
GATACGCAGGATTTTGGCACAGTCACCCGCTGACAGTGCTC(Jβ2.3)]l(6], 百拇医药
C2]l(6], 百拇医药
CGGCCGTGTATCTCTGTGCCATCAGC]l(6], 百拇医药
CTCACGGACGGAG]l(6], 百拇医药
ACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCA(Jβ2.1)]l(6], 百拇医药
C3]l(6], 百拇医药
CGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCAGC
CTACGGCCCzx$me, 百拇医药
TCTGGTAGACACCATATATTTTGGAGAGGGAAGTTGGCTCACTGTTGT(Jβ1.3)zx$me, 百拇医药
T-ALLzx$me, 百拇医药
CGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCzx$me, 百拇医药
CTCACGGAC GGAGzx$me, 百拇医药
TACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGG GACACGGCTCACCGTGCT(Jβ2.1)zx$me, 百拇医药
3 讨论zx$me, 百拇医药
在TCR的CDR3特点发现之后，利用其作为分析T细胞克隆性成为目前最为灵敏的分析方法。鉴于外周血以携带TCR α/β的T细胞为多数，故多利用TCR Vα或Vβ基因亚家族结合CDR3特点分析TCR的优势利用及其克隆性。分析方法众多，目前认为PCR-基因扫描-序列分析是特异性强、快捷、方便和客观的方法，为国外众多研究人员所采用[1，2，5]。zx$me, 百拇医药
正常人外周血T细胞的TCR β重排应是随机的，即呈多家族和多克隆[3～5]。而T细胞株为来自同一克隆的细胞，则应该只表达单家族和单克隆。本文检测2个T细胞株的结果完全与之相符，也显示基因扫描方法的正确性和可靠性。在特异性抗原刺激下，机体产生特异地针对性的克隆性T细胞，有报道黑色素瘤等肿瘤组织的浸润性T细胞(TIL)和外周血中出现TCR Vβ的优势利用和克隆性增殖[2，6]，此外，在许多免疫性疾病和病毒感染(如HIV等)病人的外周血T细胞也发现TCR VβT细胞的克隆性异常[7，8]。该研究在白血病中的报道较少，我们曾用此方法检测了部分白血病病人的外周血，发现大部分病人存在克隆性增殖的T细胞[3，4]。在此基础上，本研究分析3例出现TCR Vβ21寡克隆T细胞的CML病人外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的优势利用、克隆性增殖的情况及其CDR3序列的特点。实验发现3例CML病人仅选择性表达少数Vβ亚家族，该结果显示病人外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布或称为优势利用的特点，该特点与病人出现大量增殖的克隆性T细胞有关。基因扫描分析结果显示3例病人均存在克隆性增殖T细胞，这种克隆性增殖的T细胞可能是机体对肿瘤细胞相关抗原的一种直接反应，该推测也被一些间接的研究结果所支持，MACCALLI等报道黑色素瘤病人的T细胞与自身肿瘤细胞混合培养后对这些肿瘤细胞有特异杀伤作用，并证明其主要为表达某些TCR Vβ的克隆性T细胞，该结果明显提示，对抗自身肿瘤细胞的特异性杀伤性T细胞是那些对肿瘤相关抗原反应的克隆性T细胞[9]。在CML中，由于其细胞遗传学改变特点，t(9，22)(q34；q11)而形成bcr-ab1融合基因，病人能产生针对bcr/abl肽的CTL，本研究所发现的克隆性增殖T细胞是否与之相关，尚有待进一步研究[10]。由于多数报道所分析的病例数不多，未有明确提出肿瘤与哪一个或哪些TCR Vβ亚家族T细胞克隆有关，或者具体到哪种肿瘤与哪一TCR VβT细胞克隆相关，在同一种肿瘤的不同病例中出现的克隆性增殖T细胞不一定相同，并可能出现一个或多个TCR Vβ亚家族T细胞克隆[2，6]。本研究3例CML出现1～3个TCR Vβ亚家族寡克隆T细胞也与其它作者的发现相似。在同种肿瘤的不同病人所发现的克隆性T细胞多数分布在不同的Vβ亚家族，提示与个体特异免疫和肿瘤的异质性有关[1，6]。
本研究对3例病人共同出现的TCR Vβ亚家族寡克隆T细胞的CDR3序列的分析发现3者的Dβ、Jβ和N区不尽相同，在同一种肿瘤的不同人中发现相同的寡克隆T细胞已有报道，但这些相同的寡克隆T细胞是否其CDR3序列完全相同，则未有报道，其中涉及个体免疫反应和MHC限制性抗原的许多问题。由于本研究病例较少，有待积累资料，继续分析。cu, 百拇医药
在黑色素瘤病人中，利用病人克隆性增殖T细胞作为特异性免疫治疗的研究已开展[11]。在白血病中，尤其在CML中，由于染色体易位形成了异常的bcr-abl融合基因，可能更易于产生特异性的CTL，是开展特异性免疫治疗，清除微小残留病变的有利条件。本研究所报道的CML病人所表现的克隆性T细胞，可能用于判断病人的细胞免疫功能状态以及有可能为进一步开展特异性免疫治疗提供研究基础。cu, 百拇医药
[作者简介]李扬秋(1962-)，女，广东汕头市人，副研究员，博士。主要从事血液肿瘤免疫学研究。cu, 百拇医药
[参考文献]cu, 百拇医药
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[收稿日期]1999-09-08；[修回日期]1999-11-12(李扬秋 陈少华 杨力建 祁明芳)
单位：李扬秋(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)；陈少华(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)；杨力建(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)；祁明芳(暨南大学医学院血液病研究室，广东 广州 510632)9yn, http://www.100md.com
关键词：T细胞受体Vβ基因；互补决定区3；T细胞克隆；白血病9yn, http://www.100md.com
免疫学杂志000308 [摘 要]目的 分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点。方法 利用RT-PCR扩增3例CML外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的CDR3，了解TCR VβT细胞的分布。阳性产物进一步经基因扫描分析，了解其克隆性。寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果 3例病人仅存在3～9个TCR Vβ亚家族T细胞，部分Vβ亚家族T细胞呈寡克隆性增殖，Vβ21的寡克隆T细胞见于全部的3例病人中。结论 CML病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞出现倾斜性分布和克隆性增殖，这可能是CML中机体对恶性细胞所引起的特异性免疫反应，但对不同病人的Vβ21寡克隆T细胞序列分析并未能发现完全同源的CDR3序列。9yn, http://www.100md.com
[中图分类号]R371.22；R733.7 [文献标识码]A9yn, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0189-049yn, http://www.100md.com
The feature of CDR3 sequence of TCR Vβ21 oligoclonal T cells in CML9yn, http://www.100md.com
LI Yang-qiu，CHEN Shao-hua，YANG Li-jian，QI Ming-fang9yn, http://www.100md.com
(Department Hematology，Jinan University，Guangzhou 510632，China)9yn, http://www.100md.com
[Abstract]Objective To investigate the clonal expansion and the feature of CDR3 sequence of T cells in patients with chronic myelogenous leukemia (CML).Methods The CDR3 of TCR Vβ 24 subfamily genes were amplified in peripheral blood mononuclear cells from 3 cases with CML using RT-PCR，to observe the distribution of TCR Vβ subfamily T cells，the PCR products were further analyzed by genescan technique to evaluate clonality of the detectable TCR Vβ T cells.The products of the oligoclonal T cells were analyzed by sequencing to define the sequence of CDR3.Resulst Only 3～9 Vβ subfamily T cells could be identified in 3 CML cases.Oligoclonal expansion T cells could be detected and Vβ21 oligoclonal T cells were identified in all 3 cases.Conclusions The skew distribution and clonal expansion of TCR Vβ subfamily T cells could be found on the patients with CML.It may be a feature of the host immune response for malignant cells in CML.However，the completely homologous CDR3 sequence of Vβ21 oligoclonal T cells from different cases could not be detected.
[Key words]T cell receptor Vβ gene；CDR3；T cell clonality；leukemiakk4/l, 百拇医药
T细胞受体(TCR)重排过程中，其可变区(V)、多样区(D)和结合区(J)的基因片段进行重排和随机插入核甘酸(N区)形成一高度可变区，称为互补决定区3(CDR3)。同一克隆T细胞重排后，其CDR3长度和序列完全相同，而不同克隆T细胞有所不同，其长度的差别可为3～24个碱基，故对CDR3长度和序列的分析，可以作为判别T细胞克隆性的指标[1]。利用RT-PCR和基因扫描方法分析TCR Vβ24个亚家族的CDR3长度确定T细胞克隆性是国外近年开展的新方法[2]。该方法被迅速用于分析肿瘤病人外周血或肿瘤组织浸润性T细胞中的克隆性增殖T细胞情况，借此深入了解机体对肿瘤细胞相关抗原的特异性反应情况[2，3]。kk4/l, 百拇医药
1 材料与方法kk4/l, 百拇医药
1.1 样本 经细胞形态学、组织化学和细胞遗传学确诊的CML病人3例(编号为C1、C2和C3)。1例出现TCR Vβ21寡克隆T细胞的T细胞白血病(T-ALL)的标本及T细胞株Molt-4和Jurkat作为单克隆对照。B细胞株Raji作为阴性对照。外周血单个核细胞的分离按常规方法进行。kk4/l, 百拇医药
1.2 RNA提取和cDNA合成 RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco，BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Superscript Ⅱ，Gibco，BRL)反转录合成cDNA第一链。均按常规方法进行。kk4/l, 百拇医药
1.3 引物 用于非标记PCR的24个 Vβ引物和一Cβ引物[2～4]，用于runoff reaction的5’端荧光素标记的Cβ-fam[2～4]引物和用于序列分析的5’端生物素标记的Cβ-bio 5’-Bio-CACAGCGACCTCGGG-TGGGAA引物均由德国柏林TIB MOLBIOL公司合成。kk4/l, 百拇医药
1.4 RT-PCR PCR按已报道的方法进行[2～4]。总反应体积为25μl，其中含1μl cDNA，任一Vβ引物(24个Vβ引物之一)和Cβ引物(0.5μmol/L)，0.1m mol/L dNTP，1.25U Taq聚合酶(Perkin Elmer)和1×PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪(Perkin Elmer)中进行。共进行40循环，每一循环包括：94°C 1min(首次3min)，60°C 1min和72°C 1min(末次10min)，PCR产物保存于4°C中备用。
1.5 T细胞克隆性分析'g], http://www.100md.com
1.5.1 Runoff reactions(标记PCR产物)：10μl的反应体系含2μl的未标记的PCR产物、0.1μmol/L Cβ-fam引物、3mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.25U Taq聚合酶和PCR缓冲液。PCR共进行35循环，退火温度为66°C，余同上[4]。'g], http://www.100md.com
1.5.2 基因扫描分析(CDR3长度分析)：有关操作步骤按使用指南进行。荧光素标记的PCR产物(2μl)加入2.5μl甲酰胺，0.5μl Genescan-500 Tamra分子量标准品(ABI，Perkin Elmer)和0.5μl加样缓冲液(Dextran 50mg/ml，EDTA 25mmol/L，Genescan-500 Tamra Kit)，经94°C、4min变性后，于6%聚丙酰胺凝胶中电泳，经373A DNA序列仪(ABI，Perkin Elmer)的基因扫描672分析软件分析产物的长度和荧光素强度。'g], http://www.100md.com
由于Vβ和Cβ引物是固定的，故Vβ/Cβ所扩增的PCR产物的大小决定于Vβ-Dβ、Dβ-Jβ之间重排时的连接片段N区和Dβ的长短，即VβNDβNJβ(CDR3)，不同的T细胞克隆的PCR产物长度和含量有所不同，通过PCR产物的状况，便可了解体内T细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam)标记的产物通过基因扫描软件分析，电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量；峰的形态提示产物的均一性(克隆性)，当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，电泳时，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头，所显示的结果为一单峰图象，提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞，即单克隆的细胞；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性[4]。'g], http://www.100md.com
1.6 PCR产物直接序列分析 100μl生物素标记PCR产物经磁珠(Dynabeads M-280 Streptavidin，Dynal A.S.Norway)纯化并重新溶解于20μl纯净水中。1μl纯化的产物用于直接序列分析，应用非放射性、双脱氧核苷酸末端终止法和T-Dye Terminator cycle sequencing ready reaction试剂盒(含AmpliTaq DNA聚合酶，ABI，Perkin Elmer)的方法。反应后的产物干燥后重悬于4μl加样缓冲液[配制：4μl重结晶去离子甲酰胺和1μl 50mmol/L Na2EDTA，pH8.0/blue dextran(30mg/ml)]，经90°C 2min热变性后，于6%聚丙酰胺凝胶及373A DNA序列仪(ABI，Perkin Elmer)中进行序列分析。
2 结果iaw, 百拇医药
2.1 TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况 RT-PCR扩增结果：3例CML病人外周血分别存在9、3和3个Vβ亚家族T细胞(见表1)，1例T-ALL存在18个Vβ亚家族T细胞，Molt-4和Jurkat细胞则均为表达单一TCR Vβ的T细胞，分别为Vβ2和Vβ8T细胞。iaw, 百拇医药
表1 RT-PCR和基因扫描分析TCR Vβ亚家族T细胞克隆性的结果iaw, 百拇医药
Tab 1 The result of clonality of TCR Vβ subfamily T cells by RT-PCR and genescan analysis Primeriaw, 百拇医药
C1iaw, 百拇医药
C2iaw, 百拇医药
C3iaw, 百拇医药
T-ALLiaw, 百拇医药
Molt-4iaw, 百拇医药
Jurkatiaw, 百拇医药
Vβ1iaw, 百拇医药
poly*1iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
Vβ2iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
mono*4iaw, 百拇医药
Vβ3iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
Vβ5iaw, 百拇医药
polyiaw, 百拇医药
poly
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ6|'\, http://www.100md.com
oligo|'\, http://www.100md.com
Vβ8|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
mono|'\, http://www.100md.com
Vβ9|'\, http://www.100md.com
oligo|'\, http://www.100md.com
Vβ10|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ12|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ13|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
bi*3|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ14|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ15|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ17|'\, http://www.100md.com
oligo*2|'\, http://www.100md.com
oligo|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ18|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ19|'\, http://www.100md.com
poly|'\, http://www.100md.com
Vβ21|'\, http://www.100md.com
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oligo/:1, http://www.100md.com
oligo/:1, http://www.100md.com
mono/:1, http://www.100md.com
Vβ22/:1, http://www.100md.com
poly/:1, http://www.100md.com
Vβ23/:1, http://www.100md.com
poly/:1, http://www.100md.com
Vβ24/:1, http://www.100md.com
poly/:1, http://www.100md.com
*1：polyclone； *2：oligoclone； *3：biclone： *4：monoclone/:1, http://www.100md.com
2.2 T细胞克隆性分析结果 基因扫描分析结果显示：Molt-4和Jurkat的Vβ2或Vβ8 PCR产物均呈单峰图象(单克隆)；3例CML病人的Vβ21 PCR产物均呈一主峰及个别矮峰图象(寡克隆)，病例1和病例3均在Vβ17出现寡克隆T细胞，病例3还在Vβ13出现双克隆T细胞，其余的Vβ PCR产物均呈多峰图象(多克隆，见图1)，T-ALL的PCR产物在Vβ6和Vβ9呈寡克隆性，而在Vβ21呈单克隆性，余为多
/:1, http://www.100md.com图1 上图：1例CML(C1)外周血TCR Vβ T细胞基因扫描分析结果，Vβ17和Vβ21为一主峰图象(寡克隆)，余为多峰图象(多克隆)。/:1, http://www.100md.com
下图：3例CML(C1-C3)和1例T-ALL的Vβ21 T细胞的基因扫描分析结果，C1-C3均为寡克隆图象，T-ALL为单峰图象(单克隆)。/:1, http://www.100md.com
Fig 1 Over Fig： The result of genescan analysis in TCR Vβ T cell of peripheral blood from 1 cases with CML(C1)./:1, http://www.100md.com
A dominant peak (oligoclone) was found in Vβ17 and Vβ21 subfamily，whereas multi-peak(polyclone)were showed in the other Vβ subfamilies.Under Fig：The result of genescan anlaysis in Vβ21 T cells
from 3 cases with CML and 1 case T-ALL，oligoclonal pictures were]l(6], 百拇医药
showed in C1-C3 and monopeak(monoclone) was showed in T-ALL.克隆性。]l(6], 百拇医药
2.3 CDR3序列分析结果 对3例CML出现的Vβ21寡克隆性的PCR产物和1例T-ALL所出现的Vβ21单克隆性的PCR产物的序列分析的结果显示3例CML的V-D、D-J连接区和D区的序列有所不同，另外3者所利用的J片段分别为Jβ2.3、Jβ2.1和Jβ1.3(见表2)。]l(6], 百拇医药
表 2 2例CML和1例T-ALL病人外周血的Vβ21克隆性增殖T细胞的CDR3序列]l(6], 百拇医药
Tab2 CDR3 sequences of Vβ21 clonal expansion T cells in PBL form 3 CML and 1 T-ALL cases Case]l(6], 百拇医药
Vβ21]l(6], 百拇医药
NDN]l(6], 百拇医药
Jβ]l(6], 百拇医药
C1]l(6], 百拇医药
CGGCTCGTGTATCTCTGCCAGCAGC]l(6], 百拇医药
TATTGGGGG]l(6], 百拇医药
GATACGCAGGATTTTGGCACAGTCACCCGCTGACAGTGCTC(Jβ2.3)]l(6], 百拇医药
C2]l(6], 百拇医药
CGGCCGTGTATCTCTGTGCCATCAGC]l(6], 百拇医药
CTCACGGACGGAG]l(6], 百拇医药
ACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCA(Jβ2.1)]l(6], 百拇医药
C3]l(6], 百拇医药
CGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCAGC
CTACGGCCCzx$me, 百拇医药
TCTGGTAGACACCATATATTTTGGAGAGGGAAGTTGGCTCACTGTTGT(Jβ1.3)zx$me, 百拇医药
T-ALLzx$me, 百拇医药
CGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCzx$me, 百拇医药
CTCACGGAC GGAGzx$me, 百拇医药
TACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGG GACACGGCTCACCGTGCT(Jβ2.1)zx$me, 百拇医药
3 讨论zx$me, 百拇医药
在TCR的CDR3特点发现之后，利用其作为分析T细胞克隆性成为目前最为灵敏的分析方法。鉴于外周血以携带TCR α/β的T细胞为多数，故多利用TCR Vα或Vβ基因亚家族结合CDR3特点分析TCR的优势利用及其克隆性。分析方法众多，目前认为PCR-基因扫描-序列分析是特异性强、快捷、方便和客观的方法，为国外众多研究人员所采用[1，2，5]。zx$me, 百拇医药
正常人外周血T细胞的TCR β重排应是随机的，即呈多家族和多克隆[3～5]。而T细胞株为来自同一克隆的细胞，则应该只表达单家族和单克隆。本文检测2个T细胞株的结果完全与之相符，也显示基因扫描方法的正确性和可靠性。在特异性抗原刺激下，机体产生特异地针对性的克隆性T细胞，有报道黑色素瘤等肿瘤组织的浸润性T细胞(TIL)和外周血中出现TCR Vβ的优势利用和克隆性增殖[2，6]，此外，在许多免疫性疾病和病毒感染(如HIV等)病人的外周血T细胞也发现TCR VβT细胞的克隆性异常[7，8]。该研究在白血病中的报道较少，我们曾用此方法检测了部分白血病病人的外周血，发现大部分病人存在克隆性增殖的T细胞[3，4]。在此基础上，本研究分析3例出现TCR Vβ21寡克隆T细胞的CML病人外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的优势利用、克隆性增殖的情况及其CDR3序列的特点。实验发现3例CML病人仅选择性表达少数Vβ亚家族，该结果显示病人外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布或称为优势利用的特点，该特点与病人出现大量增殖的克隆性T细胞有关。基因扫描分析结果显示3例病人均存在克隆性增殖T细胞，这种克隆性增殖的T细胞可能是机体对肿瘤细胞相关抗原的一种直接反应，该推测也被一些间接的研究结果所支持，MACCALLI等报道黑色素瘤病人的T细胞与自身肿瘤细胞混合培养后对这些肿瘤细胞有特异杀伤作用，并证明其主要为表达某些TCR Vβ的克隆性T细胞，该结果明显提示，对抗自身肿瘤细胞的特异性杀伤性T细胞是那些对肿瘤相关抗原反应的克隆性T细胞[9]。在CML中，由于其细胞遗传学改变特点，t(9，22)(q34；q11)而形成bcr-ab1融合基因，病人能产生针对bcr/abl肽的CTL，本研究所发现的克隆性增殖T细胞是否与之相关，尚有待进一步研究[10]。由于多数报道所分析的病例数不多，未有明确提出肿瘤与哪一个或哪些TCR Vβ亚家族T细胞克隆有关，或者具体到哪种肿瘤与哪一TCR VβT细胞克隆相关，在同一种肿瘤的不同病例中出现的克隆性增殖T细胞不一定相同，并可能出现一个或多个TCR Vβ亚家族T细胞克隆[2，6]。本研究3例CML出现1～3个TCR Vβ亚家族寡克隆T细胞也与其它作者的发现相似。在同种肿瘤的不同病人所发现的克隆性T细胞多数分布在不同的Vβ亚家族，提示与个体特异免疫和肿瘤的异质性有关[1，6]。
本研究对3例病人共同出现的TCR Vβ亚家族寡克隆T细胞的CDR3序列的分析发现3者的Dβ、Jβ和N区不尽相同，在同一种肿瘤的不同人中发现相同的寡克隆T细胞已有报道，但这些相同的寡克隆T细胞是否其CDR3序列完全相同，则未有报道，其中涉及个体免疫反应和MHC限制性抗原的许多问题。由于本研究病例较少，有待积累资料，继续分析。cu, 百拇医药
在黑色素瘤病人中，利用病人克隆性增殖T细胞作为特异性免疫治疗的研究已开展[11]。在白血病中，尤其在CML中，由于染色体易位形成了异常的bcr-abl融合基因，可能更易于产生特异性的CTL，是开展特异性免疫治疗，清除微小残留病变的有利条件。本研究所报道的CML病人所表现的克隆性T细胞，可能用于判断病人的细胞免疫功能状态以及有可能为进一步开展特异性免疫治疗提供研究基础。cu, 百拇医药
[作者简介]李扬秋(1962-)，女，广东汕头市人，副研究员，博士。主要从事血液肿瘤免疫学研究。cu, 百拇医药
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[收稿日期]1999-09-08；[修回日期]1999-11-12(李扬秋 陈少华 杨力建 祁明芳)