常用显微摄影技术的简要体会
作者：杨天祝 李学平 马常升
单位：河北省基础医学研究所(石家庄050017)
关键词：显微摄影术；组织学技术
河北医科大学学报990343 中图号 R329-33
在形态学研究中，最终取得的照片质量，将是决定实验结果的最终依据。学术期刊编辑和审稿专家对论文的评价，也十分注重照片质量。获得一张好的照片，既取决于组织制备技术，也与显微摄影以及暗室技术有关。本文仅就显微摄影技术，以Olympus New Vanox型万能显微镜配套装置为例简要介绍如下。
1 显微摄像前的准备工作
1.1 组织切片的选择：根据论文需要选择组织切片。一类为保存实验原始资料而挑选的切片，由于组织切片年久后易于褪色，所以拍成胶片代替切片，目的是便于长期保存；另一类为入选论文的核心切片，也是显微摄影的重点。在选择组织切片时，应选择切片厚度均一,展片平整,背景反差明显,透明度良好,染色质量较好的切片，不要忘记以记号笔在入选切片周围打上记号，以便于及时而准确地重复找到欲摄部位。在拍摄范围内，不应有任何污尘、组织碎片、气泡及人工假象存在，拍摄时无妨将物镜与目镜不同组合，多拍摄一些帧幅，以便选优，不与前一类切片平均使用胶卷。
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1.2 选购胶卷：目前新式显微摄影装置多采用氦灯，其光路系统已由旧式钨丝照明转变成近似日光。所以选购胶卷时应为日光型者，即感光速度(ISO/ASA)为100的胶卷。其次，在挑选胶卷商品厂家时，最好对同一实验组织切片，选用同一厂家胶卷，这有利于摸索暗室洗像技术。再者，对黑白负片、彩色负片及彩色反转片(幻灯片)，购买与拍摄要有计划；若以黑白片与彩色片相比，应先拍彩色片，以防组织切片放置过长褪色。如果单纯为发表论文拍摄，则只需拍摄黑白片，如果既要彩色负片又要彩色反转片，应先拍反转片。彩色反转胶卷冲洗后，一般能如实反映组织切片的真实色调，因此除可作幻灯片使用外，还可作彩卷扩印时色彩还原的标准参照。通常情况下，彩色照片扩印往往颜色失真，相同的彩卷多次扩印时色调也多不一致，而且背景常有蓝色或绿色。到照像馆扩印彩照时，应以彩色反转片或原有的相同组织相同染色方法的彩照作为参照，并建议用彩色补偿滤片(CC滤片)消掉背影杂色，使无色的背景调为纯白色。通过实践，证明经过这种处理的彩色照片质量明显提高。
1.3 正确安装胶卷：向照相机内装卷时，常出现的失误是胶卷没有挂上，致使按下自动曝光装置上的“曝光键”后，胶卷并未转动，胶片并未感光，且因一般情况下，自动曝光装置并未因胶卷未挂上有任何异常的警示，故浪费大量精力与时间。正确的装卷方法如下：打开照相机背壳，将胶卷药膜面朝内装在倒卷轴上，拉动片头至摄取卷轴端，因后者上有数条纵沟，有时须将片头剪窄，以确保片头能够插入纵沟，并且不能使片头从另一纵沟伸出来，以手指将胶片边孔套按在摄取卷轴下端的齿轮齿上，按动自动曝光装置上的“曝光”键，确实见到胶片向前卷动到摄取卷轴时，才关闭照相机背，再按动一次“曝光”键，注意倒卷轴应随着转动。
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1.4 核查显微镜及其摄相装置各键钮状态：Olympus New Vanox上的键钮颇多。这里仅指出几点：①依据胶卷上的ISO/ASA值设定胶卷速度(film speed)。②依据胶卷品牌及型号设定倒易失效补偿值(reciprocity failure compensation)，此值一般在胶卷盒上没有标明，但在各种摄相装置说明书上均可查到知名胶卷品牌的此值。③核查摄相光路与相关各个键钮接通状态，当接通后，自动曝光装置控制面板上的“安全”灯将亮起来。
2 常用显微摄影技术细节
2.1 摄影者对显微摄影装置的调整：包括两目镜瞳孔间距的调整和个人屈光不正的校正。前者指将两目镜的距离按个人的瞳孔间距进行调整，拉动目镜或捻转瞳孔间距调节螺旋。校正屈光时应转动目镜筒上的屈光度调节环，使物镜视野中心的“十”字由单线调成双线，达到完全清晰，并且左右眼应分别调整。每个拍摄者都不宜省略这一步。
2.2 物镜与摄相目镜不同组合的选择：摄影目镜除放大功能外，并不具备空间分辨功能，只有物镜才具有空间分辨力。在一般条件下，对组织切片厚度在20 μm以下者，应尽量选择较高倍物镜，例如欲放大实物50倍时，选择“20×”物镜配以“2.5×”目镜的组合方式，其清晰度比“10×”物镜及“5×”目镜的组合方式要高些。但是也要考虑切片薄厚和观察标本的特异性的问题，例如在厚度为30 μm以上的冰冻切片上，观察蜿蜒走行的神经纤维或血管时，由于较低倍物镜的焦点深度较长，有利于从不同深度、层次或角度，连续观察分析不在同一平面上走行的神经或血管影像。在这种情况下，还可将物镜与目镜不同组合多次拍摄，最终择其效果最佳者。
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2.3 Kohler照明法：这是指聚光器的调控使用问题。经验较少的摄影者往往缺少对聚光器高度的调节，也不知光源是否偏离视野中心。不少人只进行了物镜与组织切片间的所谓“上聚焦”，而没有进行聚光器与组织切片间的“下聚焦”，这当然也无法获得最佳清晰度的成像底片。 Kohler 照明法操做步骤如下：①将视场光阑(field iris diaphragm)缩至最小，使光阑叶片的通孔呈现其八角形影像；②两手分别捻转载片台下的左右定心螺丝(centering screws)，使光阑影像与视场中心圆圈重合，以校正光路；③调节聚光器高度，使八角形光阑影像由模糊变清晰，即“下聚焦”；④散大该光阑至135帧幅边框(指常规135型负片画幅，24 mm×36 mm)影像外周。再次微调聚光器高度，使光阑象最清晰为止。每变换一次放大倍率时，都要重复进行如上调整步骤。
2.4 提高摄影反差：组织结构对比反差的好坏，当然取决于组织制备技术的质量。这是提高显微摄影质量的重要环节。但是一般情况下，为了弥补切片中对比反差的不足，常可采用如下的补救措施：①按照物镜上的数值孔径(numerical aperture)值，即NA值，相应地进行聚光器孔径光阑(aperture iris diaphragm )的匹配调节。一般质量优良的物镜镜头上，除标有放大倍率外，同时还标有NA值，例如，2x:0.08；4x:0.13；10x:0.30；20x:0.46；40x:0.70；100x:1.25，这两组数字中，前一数值代表放大率，后一数值代表NA值，其中NA值越大者空间分辨率相对越高。在New Vanox型显微镜聚光器下方，另设有与物镜NA值相协调的调节转盘，用以调整影像反差，其最佳条件系按所用物镜NA的60 %～70 %值来调节聚光器NA值转盘，例如10 x物镜宜调至0.30 %×70 %=0.21为宜。②如果按此法调节NA值转盘后，若由于组织制备欠佳致使影像反差仍然不足时，则可将物镜孔径光阑的NA值再适当缩小，例如10x物镜可调至0.19等。③如经过上述措施影像反差仍不好，则可将视场光阑从135(指常规135照片画幅24 mm×36 mm)边框外缩至边框内，然后在暗室扩放时，再将视场光阑影像除去。当然，上述的后两种措施，只不过是一种稍作修正的补救办法而已。
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2.5 低倍摄影难度大：低倍摄影有其特殊优点，例如在1(物)×2.5(目)放大倍率下，可拍摄大鼠脑切片一侧全貌，对总览特异性标记物的分布有一目了然之效果，但是低倍物镜分辨力低，焦深较长，利用微调螺旋进行精确聚焦有一定难度。为避免视力的个体差异,应采取欠焦、过焦、正焦3步,聚焦不宜反复进行。
2.6 油浸镜头的使用：100×的物镜多为油浸镜头，然而，使用后常因镜头擦不净而使镜头受损。替代的办法是滴加超纯水或双蒸水，观察效果与香柏油差别不大。由于100×物镜镜头与切片距离极近，极易碰损镜头，必须先以40×物镜聚焦，再转至100×物镜，轻轻转动聚焦微调螺旋至焦点。为避免镜头损伤，新型100×物镜常有弹簧装置，可使镜头微动伸缩而避免其损伤。
2.7 其它技术细节:①按照常规,彩色胶卷应加LBD(色温变换)滤片,黑白胶卷应加IF550(绿色)滤片。LBD滤片可使日光型彩卷获得最佳色温补偿，IF550 滤片则可使黑白卷分光感度与人眼者接近。尽管有人认为不一定需要滤光处理，但作者的经验看来，还是加滤光片为好，因为摄影取决于胶片的化学感光度，并不取决于人们眼睛对视野的直观感受。②曝光时间的选定，也是一个必需注意的问题。已知在光强与曝光时间两个参数之间，有许多不同的组合，均在曝光的“安全”范围内，但所谓的“安全”范围，并不等于最佳条件，所以作者认为限定曝光时间还是十分必要的，其道理在于胶卷化学感光度有一定限制，一个胶卷36个帧幅若随意变动曝光时间，在36张之间差异将很大，而冲洗胶卷是在同一条件下，难免有些帧幅显影不佳。依据作者的经验，曝光时间一般限定在0.5～1 s，底片的影像效果较佳。③要将重点拍摄的结构置于视场中心，因为自动曝光装置测得的曝光时间，是以视场中心区为标准，而偏离中心区越远越不准。有时为了兼顾结构局解关系，而重点结构又不在视场中心时，则可采取点(spot)曝光法。④若需将一张切片上的结构拍为几张,之后拼接时,可在New Vanox 显微摄影仪器上设有一个锁定键(lock)，有利于解决这一问题，以使同一结构的几个帧幅曝光时间一致，然后在洗照片时将这组照片同时放入显影液与定影液。
(1999-01-29 收稿), 百拇医药
单位：河北省基础医学研究所(石家庄050017)
关键词：显微摄影术；组织学技术
河北医科大学学报990343 中图号 R329-33
在形态学研究中，最终取得的照片质量，将是决定实验结果的最终依据。学术期刊编辑和审稿专家对论文的评价，也十分注重照片质量。获得一张好的照片，既取决于组织制备技术，也与显微摄影以及暗室技术有关。本文仅就显微摄影技术，以Olympus New Vanox型万能显微镜配套装置为例简要介绍如下。
1 显微摄像前的准备工作
1.1 组织切片的选择：根据论文需要选择组织切片。一类为保存实验原始资料而挑选的切片，由于组织切片年久后易于褪色，所以拍成胶片代替切片，目的是便于长期保存；另一类为入选论文的核心切片，也是显微摄影的重点。在选择组织切片时，应选择切片厚度均一,展片平整,背景反差明显,透明度良好,染色质量较好的切片，不要忘记以记号笔在入选切片周围打上记号，以便于及时而准确地重复找到欲摄部位。在拍摄范围内，不应有任何污尘、组织碎片、气泡及人工假象存在，拍摄时无妨将物镜与目镜不同组合，多拍摄一些帧幅，以便选优，不与前一类切片平均使用胶卷。
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1.2 选购胶卷：目前新式显微摄影装置多采用氦灯，其光路系统已由旧式钨丝照明转变成近似日光。所以选购胶卷时应为日光型者，即感光速度(ISO/ASA)为100的胶卷。其次，在挑选胶卷商品厂家时，最好对同一实验组织切片，选用同一厂家胶卷，这有利于摸索暗室洗像技术。再者，对黑白负片、彩色负片及彩色反转片(幻灯片)，购买与拍摄要有计划；若以黑白片与彩色片相比，应先拍彩色片，以防组织切片放置过长褪色。如果单纯为发表论文拍摄，则只需拍摄黑白片，如果既要彩色负片又要彩色反转片，应先拍反转片。彩色反转胶卷冲洗后，一般能如实反映组织切片的真实色调，因此除可作幻灯片使用外，还可作彩卷扩印时色彩还原的标准参照。通常情况下，彩色照片扩印往往颜色失真，相同的彩卷多次扩印时色调也多不一致，而且背景常有蓝色或绿色。到照像馆扩印彩照时，应以彩色反转片或原有的相同组织相同染色方法的彩照作为参照，并建议用彩色补偿滤片(CC滤片)消掉背影杂色，使无色的背景调为纯白色。通过实践，证明经过这种处理的彩色照片质量明显提高。
1.3 正确安装胶卷：向照相机内装卷时，常出现的失误是胶卷没有挂上，致使按下自动曝光装置上的“曝光键”后，胶卷并未转动，胶片并未感光，且因一般情况下，自动曝光装置并未因胶卷未挂上有任何异常的警示，故浪费大量精力与时间。正确的装卷方法如下：打开照相机背壳，将胶卷药膜面朝内装在倒卷轴上，拉动片头至摄取卷轴端，因后者上有数条纵沟，有时须将片头剪窄，以确保片头能够插入纵沟，并且不能使片头从另一纵沟伸出来，以手指将胶片边孔套按在摄取卷轴下端的齿轮齿上，按动自动曝光装置上的“曝光”键，确实见到胶片向前卷动到摄取卷轴时，才关闭照相机背，再按动一次“曝光”键，注意倒卷轴应随着转动。
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1.4 核查显微镜及其摄相装置各键钮状态：Olympus New Vanox上的键钮颇多。这里仅指出几点：①依据胶卷上的ISO/ASA值设定胶卷速度(film speed)。②依据胶卷品牌及型号设定倒易失效补偿值(reciprocity failure compensation)，此值一般在胶卷盒上没有标明，但在各种摄相装置说明书上均可查到知名胶卷品牌的此值。③核查摄相光路与相关各个键钮接通状态，当接通后，自动曝光装置控制面板上的“安全”灯将亮起来。
2 常用显微摄影技术细节
2.1 摄影者对显微摄影装置的调整：包括两目镜瞳孔间距的调整和个人屈光不正的校正。前者指将两目镜的距离按个人的瞳孔间距进行调整，拉动目镜或捻转瞳孔间距调节螺旋。校正屈光时应转动目镜筒上的屈光度调节环，使物镜视野中心的“十”字由单线调成双线，达到完全清晰，并且左右眼应分别调整。每个拍摄者都不宜省略这一步。
2.2 物镜与摄相目镜不同组合的选择：摄影目镜除放大功能外，并不具备空间分辨功能，只有物镜才具有空间分辨力。在一般条件下，对组织切片厚度在20 μm以下者，应尽量选择较高倍物镜，例如欲放大实物50倍时，选择“20×”物镜配以“2.5×”目镜的组合方式，其清晰度比“10×”物镜及“5×”目镜的组合方式要高些。但是也要考虑切片薄厚和观察标本的特异性的问题，例如在厚度为30 μm以上的冰冻切片上，观察蜿蜒走行的神经纤维或血管时，由于较低倍物镜的焦点深度较长，有利于从不同深度、层次或角度，连续观察分析不在同一平面上走行的神经或血管影像。在这种情况下，还可将物镜与目镜不同组合多次拍摄，最终择其效果最佳者。
, http://www.100md.com
2.3 Kohler照明法：这是指聚光器的调控使用问题。经验较少的摄影者往往缺少对聚光器高度的调节，也不知光源是否偏离视野中心。不少人只进行了物镜与组织切片间的所谓“上聚焦”，而没有进行聚光器与组织切片间的“下聚焦”，这当然也无法获得最佳清晰度的成像底片。 Kohler 照明法操做步骤如下：①将视场光阑(field iris diaphragm)缩至最小，使光阑叶片的通孔呈现其八角形影像；②两手分别捻转载片台下的左右定心螺丝(centering screws)，使光阑影像与视场中心圆圈重合，以校正光路；③调节聚光器高度，使八角形光阑影像由模糊变清晰，即“下聚焦”；④散大该光阑至135帧幅边框(指常规135型负片画幅，24 mm×36 mm)影像外周。再次微调聚光器高度，使光阑象最清晰为止。每变换一次放大倍率时，都要重复进行如上调整步骤。
2.4 提高摄影反差：组织结构对比反差的好坏，当然取决于组织制备技术的质量。这是提高显微摄影质量的重要环节。但是一般情况下，为了弥补切片中对比反差的不足，常可采用如下的补救措施：①按照物镜上的数值孔径(numerical aperture)值，即NA值，相应地进行聚光器孔径光阑(aperture iris diaphragm )的匹配调节。一般质量优良的物镜镜头上，除标有放大倍率外，同时还标有NA值，例如，2x:0.08；4x:0.13；10x:0.30；20x:0.46；40x:0.70；100x:1.25，这两组数字中，前一数值代表放大率，后一数值代表NA值，其中NA值越大者空间分辨率相对越高。在New Vanox型显微镜聚光器下方，另设有与物镜NA值相协调的调节转盘，用以调整影像反差，其最佳条件系按所用物镜NA的60 %～70 %值来调节聚光器NA值转盘，例如10 x物镜宜调至0.30 %×70 %=0.21为宜。②如果按此法调节NA值转盘后，若由于组织制备欠佳致使影像反差仍然不足时，则可将物镜孔径光阑的NA值再适当缩小，例如10x物镜可调至0.19等。③如经过上述措施影像反差仍不好，则可将视场光阑从135(指常规135照片画幅24 mm×36 mm)边框外缩至边框内，然后在暗室扩放时，再将视场光阑影像除去。当然，上述的后两种措施，只不过是一种稍作修正的补救办法而已。
, http://www.100md.com
2.5 低倍摄影难度大：低倍摄影有其特殊优点，例如在1(物)×2.5(目)放大倍率下，可拍摄大鼠脑切片一侧全貌，对总览特异性标记物的分布有一目了然之效果，但是低倍物镜分辨力低，焦深较长，利用微调螺旋进行精确聚焦有一定难度。为避免视力的个体差异,应采取欠焦、过焦、正焦3步,聚焦不宜反复进行。
2.6 油浸镜头的使用：100×的物镜多为油浸镜头，然而，使用后常因镜头擦不净而使镜头受损。替代的办法是滴加超纯水或双蒸水，观察效果与香柏油差别不大。由于100×物镜镜头与切片距离极近，极易碰损镜头，必须先以40×物镜聚焦，再转至100×物镜，轻轻转动聚焦微调螺旋至焦点。为避免镜头损伤，新型100×物镜常有弹簧装置，可使镜头微动伸缩而避免其损伤。
2.7 其它技术细节:①按照常规,彩色胶卷应加LBD(色温变换)滤片,黑白胶卷应加IF550(绿色)滤片。LBD滤片可使日光型彩卷获得最佳色温补偿，IF550 滤片则可使黑白卷分光感度与人眼者接近。尽管有人认为不一定需要滤光处理，但作者的经验看来，还是加滤光片为好，因为摄影取决于胶片的化学感光度，并不取决于人们眼睛对视野的直观感受。②曝光时间的选定，也是一个必需注意的问题。已知在光强与曝光时间两个参数之间，有许多不同的组合，均在曝光的“安全”范围内，但所谓的“安全”范围，并不等于最佳条件，所以作者认为限定曝光时间还是十分必要的，其道理在于胶卷化学感光度有一定限制，一个胶卷36个帧幅若随意变动曝光时间，在36张之间差异将很大，而冲洗胶卷是在同一条件下，难免有些帧幅显影不佳。依据作者的经验，曝光时间一般限定在0.5～1 s，底片的影像效果较佳。③要将重点拍摄的结构置于视场中心，因为自动曝光装置测得的曝光时间，是以视场中心区为标准，而偏离中心区越远越不准。有时为了兼顾结构局解关系，而重点结构又不在视场中心时，则可采取点(spot)曝光法。④若需将一张切片上的结构拍为几张,之后拼接时,可在New Vanox 显微摄影仪器上设有一个锁定键(lock)，有利于解决这一问题，以使同一结构的几个帧幅曝光时间一致，然后在洗照片时将这组照片同时放入显影液与定影液。
(1999-01-29 收稿), 百拇医药