缺锌对大鼠睾丸精子细胞凋亡的影响
作者：李积胜 徐鹏霄 贺智
单位：300162 天津，中国人民武装警察部队医学院
关键词：锌；缺乏症；睾丸；细胞凋亡
中华医学杂志/980205 【摘要】 目的 了解缺锌对睾丸发育及其功能的影响，研究缺锌对睾丸生精细胞凋亡的影响。方法 选用Wistar雄性大鼠16只，均分为对照组和缺锌组。喂养4周后，采用原子吸收分光光度法，测定血清和睾丸锌的含量；采用原位缺口平移技术观察睾丸曲细精管中细胞凋亡数目的变化。结果在缺锌组大鼠血清锌(16.4±0.8 μmol/L)较对照组血清锌(21.6±1.4 μmol/L)明显降低的情况下，锌缺大鼠睾丸内锌含量(39.7±10.8 μg/g)也较对照组(54.4±12.4 μg/g)明显降低，睾丸曲细精管生精细胞凋亡的数目(21.4±3.8 No./10个曲细精管)则较对照组的凋亡细胞数目(6.9±1.3No./10个曲细精管)明显增多。结论 锌是睾丸发育所必需的营养素，缺锌可诱发睾丸生精细胞凋亡。
, 百拇医药
Effect of zinc deficiency on apoptosis of spermatogenic cells of rat tostis Li Jisheng, Xu Pengxiao, He Zhi. Department of Anatomy, Chinese People′s Armed Police Force Medical College, Tianjin 300162
【Abstract】 Objective To study the changes of testis apoptosis in zinc deficient rats will promote the understanding of the molecular mechanism of zinc deficiency in the development and function of testis. Methods 16 Wistar rats were divided randomly into zinc control group (ZC) and zinc deficiency group (ZD). The serum and testis zinc contents were measured with atomic absorse method; the apoptosis of spermatogenic cells was studied with in situ nick translation (ISNT) technique. Results Under zinc deficient status, the zinc contents of the serum and testis were obviously decreased (P<0.05). The apoptosis number of spermatogenic cells was significantly increased (P<0.01). Conclusion The adequate amount of zinc is essential to the development of testis, whereas zinc deficiency can harmfully affect it. This effect is perhaps carried out in different ways, but the increasing apoptosis numbers of spermatogenic cells might be one of molecular miechanisms of the effect of zinc defficiency on testis development.
, 百拇医药
【Key words】 Zinc defficiency diseases Testis Apoptosis
(Natl Med J China, 1998, 78：91-93)
已有实验表明[1]，细胞内锌在调节细胞凋亡方面起重要作用。锌对睾丸的发育是十分重要的。缺锌可影响睾丸的发育、精子的形成和睾酮的分泌[2，3]，但关于缺锌对睾丸发育影响的机制目前尚不清楚。鉴此，本研究采用检测细胞凋亡的原位缺口平移法(in situ nick translation, ISNT)，观测缺锌大鼠睾丸生精细胞凋亡的变化。
材料与方法
一、动物分组和饲养
选用健康Wistar雄性大鼠16只，2个月龄，重150～170g，随机均分为两组：缺锌组和对照组。动物分组饲养于不锈钢笼内，自由用饮去离子水，两组动物饲料配方和饲养方法详见文献[4]。喂养4周后进行实验。
, 百拇医药
二、观测指标和方法
1.睾丸和血清锌的测定：两组大鼠麻醉、开胸，心脏抽血2ml后，灌注固定，分离血清和一侧睾丸，采用IL-AA951型原子吸收分光光度计，测定血清和睾丸锌含量。
2.睾丸原位缺口平移标记：组织切片：取两组大鼠的另一侧睾丸做冠状位冰冻切片，片厚30 μm，切片贴于涂有铬明胶的载片上，37℃烘箱烘烤过夜，行原位缺口平移(ISNT)标记。
ISNT程序：(1) 切片依次预处理：0.1 mol/L Tris HCl(pH8.0)缓冲液；25%冰醋酸处理10分钟；0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)缓冲液；10 μg/ml蛋白酶K 37℃处理30分钟；4%多聚甲醛固定5分钟；0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液和重蒸水漂洗后，在空气中晾干。(2) ISNT标记：切片在缺口平移混合液：0.05 mol/L Tris-HCl pH7.2，0.05 mol/L MgCl，10 μg/μl乙酰化BSA，0.2X地高辛DNA标记混合液(Boe hringer Mannheim公司产品)，0.2 U/μl DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)中37℃保湿1小时。(3) 显色反应：切片依次经1%牛血清37℃保温30分钟；1∶1000碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim公司产品)，室温4小时；0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.2)、TSM1和TSM2冲洗；四唑氮蓝和BCIP显色液中显色。(4) 对照实验：实验中缺口平移混合液中不加DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)，其它步骤与阳性实验相同，其结果为阴性。
, 百拇医药
3.凋亡细胞计数：每组选择24张相同断面的切片，光镜下在每张切片上随机计数每10个曲细精管生精细胞中凋亡精子的数目，然后做显著性检验。
结果
缺锌组大鼠血清锌明显降低16.4±0.8 μmol/L，而对照组为21.6±1.4 μmol/L(P<0.05)。同时，睾丸锌的含量明显减少对照组54.4±12.4 μg/g下降为缺锌组39.7±10.8 μg/g(P<0.05)，睾丸生精细胞凋亡的数目则明显增多，对照组为6.9±1.3 No./10个曲细精管切面，而缺锌组为21.4±3.8No./10个曲细精管切面(P<0.01)。
组织切片显示，对照组在精原细胞层内偶可见凋亡细胞分布(图1)。缺锌组大鼠睾丸的凋亡细胞可见于各级生精细胞，其中以精原细胞层内的凋亡细胞最多，有时呈串状或密集成堆(图2～4)。
讨论
, http://www.100md.com
锌是睾丸组织中的重要微量元素之一，缺锌时，睾丸细胞的DNA含量显著降低[2]，血清睾酮水平和精液量减少[3]，提示缺锌可影响睾丸的发育和功能。细胞凋亡的酶学机制主要是经过由镁依赖核酸酶将DNA切割，再由钙镁依赖性核酸内切酶，将DNA在核小体与核小体之间解，核结构完全丢失。锌离子是钙镁依赖性核酸酶内切酶的抑制因子，缺锌可通过激活此酶而诱发细胞凋亡[1]。另外；DNA中含有结合相当紧密的锌，它能够稳定DNA的四级结构，保护DNA免受过氧化的损害。锌还是Cu Zn-SOD的结构成份，缺锌时，CuZn-SOD活性降低，自由基增多，后者与睾丸蛋白质、DNA、脂质体等反应，引起蛋白质氧化，DNA链断裂，细胞膜起苞，脂质氧化，这些正是睾丸细胞凋亡的特征[2]。可见缺锌可能影响睾丸精子的细胞凋亡。本研究利用我们多年采用的单纯缺锌模型[4]，在观测缺锌组大鼠在血清锌明显降低，睾丸组织的锌含量明显减少的基础上，进一步将分子生物学中DNA探针标记技术应用到组织切片上，在原位进行形态计量。结果表明，缺锌大鼠睾丸生精细胞的细胞凋亡数目明显增加，从一定程度证明缺锌触发睾丸生精细胞凋亡数目的增加，可能是缺锌干扰睾丸精子发育的分子生物学机制之一。
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图1 正常大鼠睾丸生精细胞内的凋亡细胞少，仅见于精原细胞层(↑) ISNT标记 ×20
图2 缺锌大鼠睾丸生精细胞内的凋亡细胞多，分布于各级生精细胞(↑) ISNT标记 ×20
图3 缺锌大鼠睾丸精原细胞层内有成串的凋亡细胞(↑)ISNT标记 ×20
图4 缺锌大鼠睾丸精原细胞层内成堆凋亡细胞的放大(↑)ISNT标记 ×100
本课题为全军医药科研基金资助项目参考文献
1Matsushita K, Kitagawa K, Matsuyama T, et al. Effect of systemic zinc administration on delayed neuronal death in the gerbil hippocampus. Brain Res, 1996, 743(1-2):362-365.
, http://www.100md.com
2Oteiza PI. Zinc deficiency causes oxidative damage to proteins, lipids and DNA inrat testes. J Nutr, 1995, 125：823-829.
3Hunt CD, Johnson PE, Herbel J, et al. Effects of dietary zinc depletion on seminal volume and zinc loss, serum tegtosterone concentrations, and sperm morphology in young man. Am J Clin Nutr, 1992, 56：148-157.
4Flanagan PR. A model to produce pure zinc deficiency in rats and its use to demonstrate that dietery phytate increases the excretion of endogenous zinc. J Nutr, 1984, 114：493-502. (收稿：1997-08-08 修回：1997-11-18), http://www.100md.com
单位：300162 天津，中国人民武装警察部队医学院
关键词：锌；缺乏症；睾丸；细胞凋亡
中华医学杂志/980205 【摘要】 目的 了解缺锌对睾丸发育及其功能的影响，研究缺锌对睾丸生精细胞凋亡的影响。方法 选用Wistar雄性大鼠16只，均分为对照组和缺锌组。喂养4周后，采用原子吸收分光光度法，测定血清和睾丸锌的含量；采用原位缺口平移技术观察睾丸曲细精管中细胞凋亡数目的变化。结果在缺锌组大鼠血清锌(16.4±0.8 μmol/L)较对照组血清锌(21.6±1.4 μmol/L)明显降低的情况下，锌缺大鼠睾丸内锌含量(39.7±10.8 μg/g)也较对照组(54.4±12.4 μg/g)明显降低，睾丸曲细精管生精细胞凋亡的数目(21.4±3.8 No./10个曲细精管)则较对照组的凋亡细胞数目(6.9±1.3No./10个曲细精管)明显增多。结论 锌是睾丸发育所必需的营养素，缺锌可诱发睾丸生精细胞凋亡。
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Effect of zinc deficiency on apoptosis of spermatogenic cells of rat tostis Li Jisheng, Xu Pengxiao, He Zhi. Department of Anatomy, Chinese People′s Armed Police Force Medical College, Tianjin 300162
【Abstract】 Objective To study the changes of testis apoptosis in zinc deficient rats will promote the understanding of the molecular mechanism of zinc deficiency in the development and function of testis. Methods 16 Wistar rats were divided randomly into zinc control group (ZC) and zinc deficiency group (ZD). The serum and testis zinc contents were measured with atomic absorse method; the apoptosis of spermatogenic cells was studied with in situ nick translation (ISNT) technique. Results Under zinc deficient status, the zinc contents of the serum and testis were obviously decreased (P<0.05). The apoptosis number of spermatogenic cells was significantly increased (P<0.01). Conclusion The adequate amount of zinc is essential to the development of testis, whereas zinc deficiency can harmfully affect it. This effect is perhaps carried out in different ways, but the increasing apoptosis numbers of spermatogenic cells might be one of molecular miechanisms of the effect of zinc defficiency on testis development.
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【Key words】 Zinc defficiency diseases Testis Apoptosis
(Natl Med J China, 1998, 78：91-93)
已有实验表明[1]，细胞内锌在调节细胞凋亡方面起重要作用。锌对睾丸的发育是十分重要的。缺锌可影响睾丸的发育、精子的形成和睾酮的分泌[2，3]，但关于缺锌对睾丸发育影响的机制目前尚不清楚。鉴此，本研究采用检测细胞凋亡的原位缺口平移法(in situ nick translation, ISNT)，观测缺锌大鼠睾丸生精细胞凋亡的变化。
材料与方法
一、动物分组和饲养
选用健康Wistar雄性大鼠16只，2个月龄，重150～170g，随机均分为两组：缺锌组和对照组。动物分组饲养于不锈钢笼内，自由用饮去离子水，两组动物饲料配方和饲养方法详见文献[4]。喂养4周后进行实验。
, 百拇医药
二、观测指标和方法
1.睾丸和血清锌的测定：两组大鼠麻醉、开胸，心脏抽血2ml后，灌注固定，分离血清和一侧睾丸，采用IL-AA951型原子吸收分光光度计，测定血清和睾丸锌含量。
2.睾丸原位缺口平移标记：组织切片：取两组大鼠的另一侧睾丸做冠状位冰冻切片，片厚30 μm，切片贴于涂有铬明胶的载片上，37℃烘箱烘烤过夜，行原位缺口平移(ISNT)标记。
ISNT程序：(1) 切片依次预处理：0.1 mol/L Tris HCl(pH8.0)缓冲液；25%冰醋酸处理10分钟；0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)缓冲液；10 μg/ml蛋白酶K 37℃处理30分钟；4%多聚甲醛固定5分钟；0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液和重蒸水漂洗后，在空气中晾干。(2) ISNT标记：切片在缺口平移混合液：0.05 mol/L Tris-HCl pH7.2，0.05 mol/L MgCl，10 μg/μl乙酰化BSA，0.2X地高辛DNA标记混合液(Boe hringer Mannheim公司产品)，0.2 U/μl DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)中37℃保湿1小时。(3) 显色反应：切片依次经1%牛血清37℃保温30分钟；1∶1000碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim公司产品)，室温4小时；0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.2)、TSM1和TSM2冲洗；四唑氮蓝和BCIP显色液中显色。(4) 对照实验：实验中缺口平移混合液中不加DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)，其它步骤与阳性实验相同，其结果为阴性。
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3.凋亡细胞计数：每组选择24张相同断面的切片，光镜下在每张切片上随机计数每10个曲细精管生精细胞中凋亡精子的数目，然后做显著性检验。
结果
缺锌组大鼠血清锌明显降低16.4±0.8 μmol/L，而对照组为21.6±1.4 μmol/L(P<0.05)。同时，睾丸锌的含量明显减少对照组54.4±12.4 μg/g下降为缺锌组39.7±10.8 μg/g(P<0.05)，睾丸生精细胞凋亡的数目则明显增多，对照组为6.9±1.3 No./10个曲细精管切面，而缺锌组为21.4±3.8No./10个曲细精管切面(P<0.01)。
组织切片显示，对照组在精原细胞层内偶可见凋亡细胞分布(图1)。缺锌组大鼠睾丸的凋亡细胞可见于各级生精细胞，其中以精原细胞层内的凋亡细胞最多，有时呈串状或密集成堆(图2～4)。
讨论
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锌是睾丸组织中的重要微量元素之一，缺锌时，睾丸细胞的DNA含量显著降低[2]，血清睾酮水平和精液量减少[3]，提示缺锌可影响睾丸的发育和功能。细胞凋亡的酶学机制主要是经过由镁依赖核酸酶将DNA切割，再由钙镁依赖性核酸内切酶，将DNA在核小体与核小体之间解，核结构完全丢失。锌离子是钙镁依赖性核酸酶内切酶的抑制因子，缺锌可通过激活此酶而诱发细胞凋亡[1]。另外；DNA中含有结合相当紧密的锌，它能够稳定DNA的四级结构，保护DNA免受过氧化的损害。锌还是Cu Zn-SOD的结构成份，缺锌时，CuZn-SOD活性降低，自由基增多，后者与睾丸蛋白质、DNA、脂质体等反应，引起蛋白质氧化，DNA链断裂，细胞膜起苞，脂质氧化，这些正是睾丸细胞凋亡的特征[2]。可见缺锌可能影响睾丸精子的细胞凋亡。本研究利用我们多年采用的单纯缺锌模型[4]，在观测缺锌组大鼠在血清锌明显降低，睾丸组织的锌含量明显减少的基础上，进一步将分子生物学中DNA探针标记技术应用到组织切片上，在原位进行形态计量。结果表明，缺锌大鼠睾丸生精细胞的细胞凋亡数目明显增加，从一定程度证明缺锌触发睾丸生精细胞凋亡数目的增加，可能是缺锌干扰睾丸精子发育的分子生物学机制之一。
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图1 正常大鼠睾丸生精细胞内的凋亡细胞少，仅见于精原细胞层(↑) ISNT标记 ×20
图2 缺锌大鼠睾丸生精细胞内的凋亡细胞多，分布于各级生精细胞(↑) ISNT标记 ×20
图3 缺锌大鼠睾丸精原细胞层内有成串的凋亡细胞(↑)ISNT标记 ×20
图4 缺锌大鼠睾丸精原细胞层内成堆凋亡细胞的放大(↑)ISNT标记 ×100
本课题为全军医药科研基金资助项目参考文献
1Matsushita K, Kitagawa K, Matsuyama T, et al. Effect of systemic zinc administration on delayed neuronal death in the gerbil hippocampus. Brain Res, 1996, 743(1-2):362-365.
, http://www.100md.com
2Oteiza PI. Zinc deficiency causes oxidative damage to proteins, lipids and DNA inrat testes. J Nutr, 1995, 125：823-829.
3Hunt CD, Johnson PE, Herbel J, et al. Effects of dietary zinc depletion on seminal volume and zinc loss, serum tegtosterone concentrations, and sperm morphology in young man. Am J Clin Nutr, 1992, 56：148-157.
4Flanagan PR. A model to produce pure zinc deficiency in rats and its use to demonstrate that dietery phytate increases the excretion of endogenous zinc. J Nutr, 1984, 114：493-502. (收稿：1997-08-08 修回：1997-11-18), http://www.100md.com