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编号:10281902
小鼠精子和球形精子细胞显微注射受精研究
http://www.100md.com 《解剖学报》 1999年第2期
     作者:李子义 谭景和 孙兴参 刘忠华 周琪 贺桂馨

    单位:李子义谭景和 孙兴参 刘忠华 周琪 贺桂馨 东北农业大学生物工程系,哈尔滨 150030

    关键词:精子;球形精子细胞;显微注射;电活化;电融合;小鼠

    解剖学报990213

    【摘要】 目的 研究动物受精机理。 方法 以昆明白鼠为实验动物,利用显微注射技术,对精子和球形精子细胞的显微注射受精进行了研究。结果 1. 带下注射受精,注射4~6个精子的卵的受精率(32.5%)和卵裂率(25.0%)显著高于注射单个精子的卵的受精率和卵裂率(分别为12.5%和6.3%)(P<0.05)。2. 带下注射4~6精子后,有第1极体卵母细胞的存活率(69.6%)、受精率(32.5%)和卵裂率(25.0%)分别高于无第1极体卵母细胞的存活率、受精率和卵裂率(分别为64.4%、20.7%和13.8%),但两者无显著差异(P>0.05)。3.胞质内精子注射卵的存活率(21.4%)极显著低于带下注射卵的存活率(69.6%)(P<0.01);而胞质内精子注射卵的受精率(35.5%)、卵裂率(32.3)%和囊胚率(20.0%)则高于带下注射卵的受精率(33.3%)、卵裂率(25.0%)和囊胚率(10.0%),但无显著差异(P>0.05)。4.将球形精子细胞注入经电活化处理的卵母细胞的透明带下,注射卵的存活率为90.5%,电融合率为34.6%,2-细胞分裂率为28.3%。 结论 1.注射精子的数量对小鼠带下注射的受精率和卵裂率有显著影响。2.卵母细胞中第1极体存在与否对小鼠带下注射的受精率和卵裂率无显著影响。3. 不同注射方法对小鼠卵的存活率有极显著的影响,而对受精率、卵裂率和囊胚率无显著影响。4. 本实验所采用的电融合条件,尚未满足多数球形精子细胞与卵母细胞融合之需要。
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    FERTILIZATION BY MICROINJECTION OF SPERMATOZOON AND ROUND SPERMATID INTO OOCYTE IN THE MOUSE

    Li Ziyi,Tan Jinghe, Sun Xingshen, Liu Zhonghuan, Zhou Qi, He Guixin

    (Department of Biotechnology, Northeast Agricultural University)

    【Abstract】 Objective To study fertilization mechanism in mammals and provide essential data for treating human male infertility. Methods Using microinjection technique, the fertilization by microinjection of spermatozoa and round spermatids into oocytes in the mouse was systematically studied. Results 1. Following subzonal injection of spermatozoa into occytes, the fertilization rate (32.5%) and cleavage rate(25.0%) in the oocytes injected with 4-6 spermatozoa were significantly higher (P<0.05) than those (12.5% and 6.3%, respectively) in the oocytes injected with a single spermatozoon. 2. Following subzonal injection of 4-6 spermatozoa into the oocytes, the survival rate (69.6%), fertilization rate (32.5%) and cleavage rate (25.0%) in those oocytes with polar body 1 (PB1) were higher than those (64.4%, 20.7% and 13.8%, respectively) in the oocytes without PB1, but the difference was not significant (P>0.05). 3. The survival rate (21.4%) in the oocytes injected with a single spermatozoon into the cytoplasm was significantly lower (P<0.01) than that (69.0%) in the oocytes injected with 4\|6 spermatozoa into the perivitelline space (PVS). The fertilization rate (35.5%), cleavage rate (32.2%) and blastocyst rate (20.0%) in those oocytes injected with a single spermatozoon into the cytoplasm of oocytes were higher than those (33.3%, 25.0% and 10.0%, respectively) in the oocytes injected with 4-6 spermatozoa into the PVS, but they did not differ significantly(P>0.05). 4. Following subzonal injection of a round spermatid into the oocyte, the survival rate, electrofusion rate and 2-cell rate were 90.5%, 34.6% and 28.3%, respectively.Conclusions 1. The fertilization rate and cleavage rate in the oocytes were significantly affected by the number of subzonal injection of spermatozoa. 2. The survival rate, fertilization rate and cleavage rate in the oocytes with PB1 or without PB1 were not significantly affected when subzonal injection of spermatozoa. 3. The survival rate in the oocytes were significantly affected by injection methods, and the fertilization rate, cleavage rate and blastocyst rate in the oocytes were not significantly affected by injection methods. 4. Most round spermatids and oocytes were not fused on the present condition of electrofusion.
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    【Key words】 Spermatozoon; Round spermatid; Microinjection; Electrical activation; Electrofusion; Mouse

    正常的受精过程,精子必须穿过透明带并与卵质膜融合而进入卵中。随着显微操作技术和设备的日趋完善,使得由透明带和卵质膜所形成的人工授精障碍能够得以排除。胞质内精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 或带下注射(subzonal injection, SUZI),是利用显微操作仪将精子(或精子细胞)直接注射到卵胞质内或透明带下的受精过程,称为显微注射受精(microfertilization)或显微操作协助受精(micromanipulation-assisted fertilization)[1]。它是体外受精与显微操作技术相结合而形成的一项新技术,该技术在动物受精机理研究、治疗男性不育、动物育种和野生动物遗传资源保存方面,有着极为广阔的应用前景。小鼠带下注射受精已于1998年有子代出生[2],而小鼠胞质内精子注射的研究一直进展缓慢。到1995年,Kimura等[3]改进了显微操作系统,Ahmadi等[4]先向胞质内注入Ca2+、再注入精子,先后获得小鼠胞质内精子注射受精后代。
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    尽管已有后代出生,但有关精子(或精子细胞)显微注射受精的基础理论研究还很少。本实验以小鼠为实验动物,利用显微注射技术,对精子和球形精子细胞显微注射受精进行了研究,旨在为深入研究动物受精机理,以及为治疗男性不育等提供基础数据。

    材料和方法

    1. 动物选择

    实验用昆明白鼠,雌鼠6~8周龄、体重25~35g,雄鼠8~12周龄、体重35~45g,购自哈尔滨市制药厂实验动物室,按常规方法饲养管理。

    2. 卵子准备

    雌鼠腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(PMSG),间隔48h腹腔注射10IU人绒毛膜促性腺激素(hCG),进行超排卵处理。注射hCG后16h,以颈椎脱臼法处死雌鼠,剪下输卵管,在实体解剖镜下,用眼科镊子划破输卵管壶腹部收集卵丘团。卵丘团经0.1%透明质酸酶(Sigma公司)处理1~2min(37℃),去掉卵丘细胞,获取的卵母细胞置Hepes-CZB[5]液中洗3次后备用。
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    3. 精子与球形精子细胞准备

    以颈椎脱臼法处死雄鼠,取双侧附睾尾及部分输精管中的精子,移入含有1 ml T[6]6液的小管中,用封口膜封住管口后,放入37℃温箱中待用。采用带下注射时,精子在T6液中获能2h(37℃温箱中);胞质内注射时,可免去精子获能步骤,直接将1份精子悬液与3~4份用T6液配制的含10%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)滞动液混合待用。球形精子细胞的制备参照Ogura等[7]方法进行。即取小鼠睾丸,剥离睾丸被膜,用眼科剪刀剪碎曲细精管,置Hepes-CZB中离心2次(1 000r/min, 5min/次),取沉淀物的表层置操作液滴中,球形精子细胞体积很小,直径约10μm(9~11μm),细胞中央有染色质团构成的轮廓明显的球形区。

    4. 显微操作工具制备
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    将1.2mm×150mm玻璃毛细管,手工拉制成外径130~150μm的吸管,然后在微锻仪上加工成内径约20μm的固定吸管。将1.2mm×150mm玻璃毛细管,经拉针仪、磨针仪和微锻仪制成注射针管。用于ICSI的注射针管内径为6μm,用于SUZI的注射针管内径8~10μm,用于球形精子细胞带下注射的注射针管内径约10μm。玻璃毛细管在制备针管之前经超声波洗涤、洗液浸泡、高热灭菌处理。制备好的针管使用前再经紫外线照射20 min灭菌。

    5. 显微操作

    将注射针管和固定吸管安装至显微操作仪上,在φ90mm培养皿中,做9个50μl的小滴(正中央1滴,周围成环形排列8滴)。正中央1滴为精子-PVP悬液(用于胞质内精子注射)或精子-获能液悬液(用于带下精子注射)或球形精子细胞悬液(用于带下注射),周围8滴(Hepes-CZB液)各移入2~5个待注射卵(通常空出2个小滴,用于调试针管)。显微操作时,注射针管在含有精子或球形精子细胞的小滴中,将单个精子从尾部吸入注射针管尖端(胞质内精子注射)或吸入1~6个精子(带下注射)或吸入单个球形精子细胞(带下注射)。用固定吸管固定卵母细胞,使其极体(在有第1极体卵母细胞)朝向液滴内相当于时针“12”点或“6”点的位置,注射针管在相当于“3”点的位置穿过透明带刺入卵胞质,将单个精子连同微量的液体注入胞质;或注射针管穿过透明带后,将1个或多个精子连同极少量液体注入卵周隙或将单个球形精子细胞注入卵周隙(带下注射)。随后,慢慢撤出注射针管,并将卵母细胞从固定管释放下去。
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    6. 卵母细胞的电活化与电融合

    在带下注射球形精子细胞之前,需对卵母细胞进行活化处理,所用仪器为KeFa-450型细胞融合仪(中国科学院发育生物学研究所研制)和自制的由2条铜片构成的平板电极。电活化前,将0.3mol/L甘露醇溶液(含0.1 mmol/L MgSO4和0.05 mmol/L CaCl2)注入两电极之间做成小滴,将卵母细胞从Hepes-CZB中移到0.3 mol/L甘露醇液滴内平衡1~2min后,再移入电极间的甘露醇滴内,以1.0kV/cm、320μs、3次直流电脉冲(每次间隔1 s)的条件[8]对卵母细胞进行电活化处理。电活化后的卵母细胞经Hepes-CZB液洗3次后,即可将球形精子细胞注入带下。球形精子细胞注入经电活化处理的卵母细胞的透明带下后,间隔0.5~1h,以1.0kV/cm、80μs、1次脉冲的条件,对球形精子细胞与卵母细胞进行电融合处理。

    7. 显微注射胚胎与电活化对照组卵母细胞的体外培养
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    显微注射后,注射胚胎Hepes-CZB洗3次,移入CZB[9]培养滴(5~10个/50μl)中,覆盖矿物油(mineral oil, embryo tested, Sigma公司),置CO2孵育箱中,在37.5℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度条件下,培养3~4d。培养6~8h后观察受精情况,每隔12h观察并记录卵裂情况,间隔48h换液1次,适时摄片。

    电活化对照组卵母细胞不经甘露醇和电刺激,直接入CZB液培养。培养6h后,用倒置光学显微镜检查卵母细胞活化情况。

    8. 受精卵与孤雌活化卵判定标准及统计学分析

    胞质内精子注射、透明带下精子注射和透明带下球形精子细胞注射的显微注射胚胎,只有当出现2原核2极体(2PN、2PB)时才判定为受精;当出现1原核1极体(1PN、1PB)、1原核2极体(1PN、2PB)、2原核1极体(2PN、1PB)时判定为活化。每次球形精子细胞带下注射实验,只有当电活化对照组卵母细胞无一活化时,实验组数据才有效。本实验所得数据用χ2检验法(chi-square test)进行统计学分析。
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    结 果

    1. 单精子与多精子注入透明带下的受精结果

    以3种不同数量精子分别注入透明带下受精,结果见表1。

    2. 卵母细胞老化程度对带下注射受精的影响

    将4~6个精子分别注入有第1极体和无第1极体卵母细胞透明带下受精,结果见表2。

    3. 不同注射方法受精结果

    将单个精子注入卵胞质内或把4~6个精子注入透明带下受精,结果见表3。

    4. 球形精子细胞带下注射后的电融合与卵裂结果

    先以1.0kV/cm、320μs、3次脉冲的条件对小鼠卵母细胞进行电活化处理,然后将球形精子细胞注入经电活化处理的卵母细胞透明带下,注射卵的存活率为90.5%。间隔0.5~1h,以1.0kV/cm、80μs、1次脉冲的条件对球形精子细胞与卵母细胞进行电融合处理,融合率为34.6%,2-细胞分裂率为28.3%(表4)。
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    表1 单精子与多精子注入透明带下的受精结果

    Table 1 Results of fertilization by subzonal injection of a single or more than one spermatozoa into mouse oocytes 注射精子数

    No. of sperm

    injected

    重复次数

    No. of

    replicates

    注射卵数

    No. of eggs
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    injected

    存活卵数(%)

    No.(%) of

    eggs survived

    受精卵数(%)

    No. (%) of

    eggs fertilized

    卵裂数(%)

    No. (%) of

    eggs cleaved

    1

    4
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    43

    32(74.4)a

    4(12.5)a

    2(6.3)a

    2~3

    3

    34

    24(70.6)a

    9(26.5)ab

    4(18.2)ab

    4~6
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    5

    56

    36(69.6)a

    13(32.5)b

    10(25.0)b

    注:同列中右上角注有不同字母的数值表示差异显著(P<0.05)

    Note:In the same column, differences among numbers containing the aifferent letters in the superscripts are significant(P<0.05).

    表2 卵母细胞老化程度对带下注射受精的影响
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    Table 2 Effects of egg age on fertilization of mouse oocytes by subzonal injection 卵母细胞

    oocytes

    重复次数

    No. of

    replicates

    注射卵数

    No. of eggs

    injected

    存活卵数(%)

    No.(%) of
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    eggs survived

    受精卵数(%)

    No. (%) of

    eggs fertilized

    卵裂数(%)

    No. (%) of

    eggs cleaved

    有第1极体 with PB1

    5

    56

    39(69.6)a
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    13(32.5)a

    10(25.0)a

    无第1极体 without PB1

    4

    45

    29(64.4)a

    6(20.7)a

    4(13.8)a

    注:同列中右上角注有相同字母的数值表示差异不显著(P>0.05)

    Note: In the same column, differences among numbers containing the same letters in the superscripts are not significant(P>0.05). Note:PB1, polar body 1。
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    表3 不同注射方法受精结果

    Table 3 Results of fertilization with ICSI and SUZI 显微注射方法

    methods of

    microinjection

    重复次数

    No. of

    replicates

    注射卵数

    No. of eggs

    injected

    存活
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    卵数(%)

    No.(%) of

    eggs

    survived

    受精

    卵数(%)

    No. (%) of

    eggs

    fertilized

    各发育阶段胚胎数(%)

    No.(%) of oocytes developed to

    卵裂数
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    cleavage

    2~8细胞

    2-8 cells

    8-桑椹胚

    8 cell-morula

    囊胚

    blastocyst

    胞质内注射 ICSI

    11

    145

    31(21.4)a

    11(35.5)a
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    10(32.3)a

    3(30.0)a

    5(50.0)a

    2(20.0)a

    带下注射SUZI

    5

    56

    39(69.6)b

    13(33.3)a

    10(25.0)a
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    5(50.0)a

    4(40.0)a

    1(10.0)a

    注:同列中右上角注有不同字母的数值表示差异极显著(P<0.01)

    Note: In the same column, differences among numbers containing the different letters in the superscripts are highly significant (P<0.01). ICSI: intracytoplasmic sperm injection; SUZI: subzonal injection.

    表4 球形精子细胞带下注射后的电融合与卵裂结果
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    Table 4 Results of electrofusion and cleavage after subzonal injection of round spermatids into mouse oocytes 重复次数

    No. of replicates

    注射卵数

    No. of eggs injected

    存活卵数(%)

    No.(%) of eggs survived

    电融合数(%)

    No. (%) of eggs

    electrofused
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    卵裂数(%)

    No. (%) of eggs cleaved

    13

    147

    133(90.5)

    46(34.6)

    13(28.3)

    讨 论

    1. 关于小鼠胞质内精子注射和带下精子注射的研究

    小鼠胞质内精子注射受精研究一直进展缓慢。其原因是,小鼠卵母细胞抗损伤能力较差,胞质内注射后,卵子常迅速崩解。Markert[10]和Gomibuchi等[11]先后报道获得小鼠卵胞质内精子注射受精的结果,Goto等[12]报道胞质内注射后胚胎发育到8-细胞。到1995年,Kimura等[3]改进了显微操作系统,Ahmadi等[4]先向胞质内注入Ca2+再注入精子,先后获得小鼠胞质内精子注射受精后代。而小鼠带下注射受精研究已于1988年有子代出生[2]。本实验结果显示,将单个精子或多个精子(2~3个或4~6个)注入小鼠卵透明带下,注射4~6个精子的卵的受精率和卵裂率显著高于注射单个精子的卵的受精率和卵裂率。表明注射精子的数量对小鼠带下注射的受精率和卵裂率有显著影响。这可能是由于多精子注射中所选择的精子获得效果好或已发生顶体反应的比率比选择单个精子高的缘故。带下注射结果还显示,有第1极体卵的受精率和卵裂率高于无第1极体卵的受精率和卵裂率,但两者无显著差异。可能是无第1极体卵母细胞处于刚刚老化(即第1极体刚刚消失)阶段的缘故,而对无第1极体注射胚进一步的发育还有待研究。本实验结果还显示,胞质内精子注射的卵的存活率极显著低于带下注射的卵的存活率;而受精率、卵裂率和囊胚率则比带下注射的高,但差异并不显著。说明这两种显微注射方法的差异主要在于对小鼠卵的存活率影响的不同。因此,至少在小鼠,对于侧重受精率和发育率的研究,应尽量采用带下注射法进行受精。
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    2. 关于小鼠球形精子细胞带下注射及其发育的研究

    利用显微注射受精技术,研究变态前的单倍体球形精子细胞(round spermatid)能否象精子一样参与基因组的融合和胚胎发育已有一些报道[5,7]。本实验是在我们实验室原有研究工作的基础上,先以1.0kV/cm、320μs、3次脉冲条件活化小鼠卵母细胞,将球形精子细胞注入带下后,再以1.0kV/cm、80μs、1次脉冲的条件融合球形精子细胞和卵母细胞,并将融合胚体外培养及观察发育情况。实验中发现,小鼠卵母细胞经电活化刺激后,卵透明带弹性增强,易于显微注射。所以,小鼠球形精子细胞带下注射后,卵的存活率很高(90.5%),其原因还有待研究。本实验所获得的球形精子细胞和卵母细胞的电融合率和2-细胞发育率仅为34.6%和28.3%。从资料报道小鼠球形精子细胞带下注射(移植2-细胞胚胎)的产仔率1.7%(6/364)[13]和(移植受精卵)产仔率6.3%(12/192)[14]来看,所移植的2-细胞或受精卵在体内发育到正常分娩期的比率仍很低,而我们获得的28.3%的2-细胞胚,体内发育能力如何仍需做进一步研究。
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    * 黑龙江省科委资助课题(No.L94B02)

    现在解放军农牧大学组织学胚胎学教研室工作,长春 130062

    收稿1997-10 修回1998-05

    参考文献

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