改良门静脉周围和腔静脉周围肝细胞分离
作者：张先杰 李铎 孙海晨 李非 孙家邦
单位：(首都医科大学宣武医院普外科实验室)
关键词：
首都医科大学学报000234 由于肝脏独特的血液循环特点，无论在形态还是功能方面，门静脉周围肝细胞(PP)和腔静脉周围肝细胞(PV)存在不均匀性。多年来广泛采用洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术分离PP、PV肝细胞。但传统方法获取PP、PV肝细胞需要2只鼠，因此对研究2种肝细胞的不均一性存在很多不足。1999年10月至2000年3月我们对此方法进行了改进，利用同1只鼠来获得2种肝细胞，克服了传统方法的缺点。
1 材料和方法
SD大鼠10只(首都医科大学动物室提供)，体质量200～300 g，雌雄不限。
, http://www.100md.com
洋地黄皂甙(digitonin)4 g/L(Sigma公司)，胶原酶(collagenase，Sigma公司)。
肝灌注缓冲液Ⅰ：hepes 10 mmol/L(Sigma公司)，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.68 mmol/L，Na2HPO4.12 H2O 0.7 mmol/L，EGTA 1 g(Server公司)，葡萄糖 10 mmol/L，加入酚红指示剂，调pH值7.45。
肝灌注缓冲液Ⅱ：缓冲液Ⅰ配方去掉EGTA 1 g，加CaCl2 5 mmol/L，加入酚红指示剂，调pH值7.45，加入0.04%胶原酶。
PBS液：Na2HPO4.12 H2O 8.1 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L。
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实验步骤：①最初同传统的洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术[1]。结扎头侧腔静脉，门静脉和尾侧腔静脉插管，以20 mL/min的注速经门静脉注入肝灌注缓冲液5 min，以清除肝脏中的血液，然后从腹腔取出肝脏并放置在无菌平板上，使肝脏呈自然状态。②在血管进入中叶处，血管钳钳夹中叶血管， 以10 mL/min的注速经门静脉注入洋地黄皂甙直到左侧叶肝组织变色(约0.5 min)。以20 mL/min的注速经尾侧腔静脉逆行方向注入肝灌注缓冲液Ⅰ，以洗去洋地黄皂甙(3 min)。注意冲洗后1 min方可移去血管钳，以防洋地黄皂甙进入中叶肝组织的门静脉系。③在血管进入左侧叶处，钳夹左侧叶血管，以10 mL/min的注速经尾侧腔静脉注入洋地黄皂甙直到中叶肝组织变色(约1 min)。然后以20 mL/min的注速经门静脉逆行方向注入肝灌注缓冲液Ⅰ以洗去洋地黄皂甙(5 min)。同样注意冲洗后1 min方可移去血管钳，以防洋地黄皂甙进入左侧叶肝组织的腔静脉系。④两肝叶以及另外两叶(右叶及尾叶)同时以肝灌注缓冲液Ⅰ、Ⅱ灌注，具体过程如文献[2]所述，不同的是中叶、左侧叶肝组织应在2个烧杯中独立分离。这样左侧叶肝组织分离出腔静脉周围肝细胞，中叶肝组织分离出门静脉周围肝细胞。另外在整个过程中没用血管钳，洋地黄皂甙进入两静脉系统，门静脉周围肝细胞及腔静脉周围肝细胞均遭破坏，放弃。
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2 结果和讨论
应用改良的洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术分离10只大鼠肝细胞。细胞活率(台盼蓝排除实验)：PP(95.0±3.5)%，PV(94.7±2.6)%。细胞总量：PP细胞(9.75±0.24)×107/叶，PV细胞(9.67±0.31)×107/叶。
由于在肝叶内的不同位置，肝细胞呈现形态、生物化学及功能方面的不均一性。尽管不够明确，但是这种不均一性对肝脏的多种功能可能有十分重要的作用[3]。多年来，洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术是获得PP或PV细胞最简单可靠的方法[1]。但传统方法是在不同大鼠分别获得PP或PV细胞，这种不同大鼠的个体差异可能掩盖或增加2种肝细胞的不均一性。另外对于某些短期实验，要求精确比较PP和PV细胞的不均一性，用不同鼠在不同时间分离PP和PV细胞会影响我们的观察结果的准确性，改良后的方法克服了这些缺点。
, 百拇医药
通过多次实验，证明此改良方法不仅有助于研究PP和PV细胞的不均一性，还可节省时间、经费及人员。
参 考 文 献
1，Quistorff B. Preparation of isolated periportal or perivenous hepatocytes from rat liver. Methods Mol Biol, 1990,5:177～187
2，孙海晨,李铎,孙家邦,等.改良原位二部法门脉胶原酶灌注分离单肝细胞.首都医科大学学报,1998,19(1):65～66
3，Jungermann K, Kietzmann T. Zonation of parenchymal and nonparenchymal meatabolism in liver. Annu Rev Nutr, 1996,16:179～203
收稿日期：2000-03-01, 百拇医药
单位：(首都医科大学宣武医院普外科实验室)
关键词：
首都医科大学学报000234 由于肝脏独特的血液循环特点，无论在形态还是功能方面，门静脉周围肝细胞(PP)和腔静脉周围肝细胞(PV)存在不均匀性。多年来广泛采用洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术分离PP、PV肝细胞。但传统方法获取PP、PV肝细胞需要2只鼠，因此对研究2种肝细胞的不均一性存在很多不足。1999年10月至2000年3月我们对此方法进行了改进，利用同1只鼠来获得2种肝细胞，克服了传统方法的缺点。
1 材料和方法
SD大鼠10只(首都医科大学动物室提供)，体质量200～300 g，雌雄不限。
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洋地黄皂甙(digitonin)4 g/L(Sigma公司)，胶原酶(collagenase，Sigma公司)。
肝灌注缓冲液Ⅰ：hepes 10 mmol/L(Sigma公司)，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.68 mmol/L，Na2HPO4.12 H2O 0.7 mmol/L，EGTA 1 g(Server公司)，葡萄糖 10 mmol/L，加入酚红指示剂，调pH值7.45。
肝灌注缓冲液Ⅱ：缓冲液Ⅰ配方去掉EGTA 1 g，加CaCl2 5 mmol/L，加入酚红指示剂，调pH值7.45，加入0.04%胶原酶。
PBS液：Na2HPO4.12 H2O 8.1 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L。
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实验步骤：①最初同传统的洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术[1]。结扎头侧腔静脉，门静脉和尾侧腔静脉插管，以20 mL/min的注速经门静脉注入肝灌注缓冲液5 min，以清除肝脏中的血液，然后从腹腔取出肝脏并放置在无菌平板上，使肝脏呈自然状态。②在血管进入中叶处，血管钳钳夹中叶血管， 以10 mL/min的注速经门静脉注入洋地黄皂甙直到左侧叶肝组织变色(约0.5 min)。以20 mL/min的注速经尾侧腔静脉逆行方向注入肝灌注缓冲液Ⅰ，以洗去洋地黄皂甙(3 min)。注意冲洗后1 min方可移去血管钳，以防洋地黄皂甙进入中叶肝组织的门静脉系。③在血管进入左侧叶处，钳夹左侧叶血管，以10 mL/min的注速经尾侧腔静脉注入洋地黄皂甙直到中叶肝组织变色(约1 min)。然后以20 mL/min的注速经门静脉逆行方向注入肝灌注缓冲液Ⅰ以洗去洋地黄皂甙(5 min)。同样注意冲洗后1 min方可移去血管钳，以防洋地黄皂甙进入左侧叶肝组织的腔静脉系。④两肝叶以及另外两叶(右叶及尾叶)同时以肝灌注缓冲液Ⅰ、Ⅱ灌注，具体过程如文献[2]所述，不同的是中叶、左侧叶肝组织应在2个烧杯中独立分离。这样左侧叶肝组织分离出腔静脉周围肝细胞，中叶肝组织分离出门静脉周围肝细胞。另外在整个过程中没用血管钳，洋地黄皂甙进入两静脉系统，门静脉周围肝细胞及腔静脉周围肝细胞均遭破坏，放弃。
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2 结果和讨论
应用改良的洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术分离10只大鼠肝细胞。细胞活率(台盼蓝排除实验)：PP(95.0±3.5)%，PV(94.7±2.6)%。细胞总量：PP细胞(9.75±0.24)×107/叶，PV细胞(9.67±0.31)×107/叶。
由于在肝叶内的不同位置，肝细胞呈现形态、生物化学及功能方面的不均一性。尽管不够明确，但是这种不均一性对肝脏的多种功能可能有十分重要的作用[3]。多年来，洋地黄皂甙-胶原酶灌注技术是获得PP或PV细胞最简单可靠的方法[1]。但传统方法是在不同大鼠分别获得PP或PV细胞，这种不同大鼠的个体差异可能掩盖或增加2种肝细胞的不均一性。另外对于某些短期实验，要求精确比较PP和PV细胞的不均一性，用不同鼠在不同时间分离PP和PV细胞会影响我们的观察结果的准确性，改良后的方法克服了这些缺点。
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通过多次实验，证明此改良方法不仅有助于研究PP和PV细胞的不均一性，还可节省时间、经费及人员。
参 考 文 献
1，Quistorff B. Preparation of isolated periportal or perivenous hepatocytes from rat liver. Methods Mol Biol, 1990,5:177～187
2，孙海晨,李铎,孙家邦,等.改良原位二部法门脉胶原酶灌注分离单肝细胞.首都医科大学学报,1998,19(1):65～66
3，Jungermann K, Kietzmann T. Zonation of parenchymal and nonparenchymal meatabolism in liver. Annu Rev Nutr, 1996,16:179～203
收稿日期：2000-03-01, 百拇医药