遗传性视网膜变性视细胞凋亡与p53基因表达
作者：刘斌 朱秀安
单位：刘斌(北京医科大学第三医院眼科 100083)；朱秀安(北京医科大学第三医院眼科 100083)
关键词：视网膜变性；细胞凋亡；基因；p53
中华眼科杂志000118 【摘要】 目的 研究遗传性视网膜变性视细胞凋亡的基因调控。方法 对出生后第13～60天的遗传性视网膜变性动物模型RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜，进行末端脱氧核糖核苷酸连接酶介导生物素dUTP末端标记(TUNEL)凋亡细胞检测、p53蛋白免疫组织化学染色、p53 mRNA原位杂交和RT-PCR。结果 RCS大鼠视网膜视细胞自生后第25天出现凋亡，第30～35天达高峰；视细胞凋亡初期，即生后第28～30天，视细胞内p53蛋白和mRNA水平均显著升高。RT-PCR亦显示，RCS大鼠视网膜在生后第25～35天时可见较多p53 mRNA扩增产物。结论 遗传性视网膜变性视细胞凋亡初期p53基因呈高表达，提示p53基因可能参与视细胞凋亡的调控
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Photoreceptor apoptosis and p53 gene expression in inherited retinal degeneration of RSC rats
LIU Bin, ZHU Xiu′an.
(Department of Ophthalmology, Third Clinical School, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)
【Abstract】 Objective To investigate the gene regulation of photoreceptor apoptosis in inherited retinal degeneration. Method The retinas of inherited retinal degeneration in animal models of RCS (Royal College of Surgeons) rats, ranging from 13th to 60th postnatal days in age, were studied by TdT-mediated biotin-dUTP nickend labeling (TUNEL) for apoptosis, immunohistochemistry for p53 protein, in situ hybridization and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for p53 mRNA. Results The photoreceptor of RCS rats underwent apoptosis from 25th postnatal day, and reached the highest level at 30-35th postnatal days. At the early stage of photoreceptor apoptosis, the level of p53 protein and mRNA in photoreceptors increased significantly. RT-PCR also showed that there was more production of p53 mRNA at 25 to 35th postnatal days in the retinas of RCS rats. Conclusion P53 gene expression increases significantly at the early stage of photoreceptor apoptosis, indicating that p53 gene might play a role in the regulation of photoreceptor apoptosis in inherited retinal degeneration.
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【Key words】 Retinal degeneration； Apoptosis； Genes,p53
遗传性视网膜变性是严重的致盲疾患，发病机制不清，且无有效的防治方法。Chang等[1]认为,细胞凋亡可能是各种类型视网膜变性病变中视细胞死亡的共同病理途径。但目前对视细胞凋亡的分子调控机制认识甚少，尚未见某种基因或分子与视细胞凋亡调控直接相关的报道。p53基因是一种抑癌基因，可作为“凋亡基因”直接诱导细胞凋亡，在许多类型的细胞凋亡中发挥着重要作用。在研究视细胞凋亡过程中，p53基因表达对认识视细胞凋亡调控机制、寻找遗传性视网膜变性防治方法具有重要意义。
对人类遗传性视网膜变性的研究因受组织标本来源的限制，需借助动物模型。RCS(Royal College of Surgeons)大鼠是研究遗传性视网膜变性的经典动物模型，目前已确定此鼠视网膜病变主要以视细胞凋亡为主[2]。我们于1997年5月采用末端脱氧核糖核苷酸连接酶介导生物素dUTP末端标记(TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labelling，TUNEL)方法进一步确定视细胞凋亡的时间，用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法观察视细胞凋亡不同时期p53基因的表达，探讨p53基因与视细胞凋亡的关系，为进一步研究视网膜变性及视细胞凋亡的发生机制提供实验资料。
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材料与方法
一、动物
取生后第13、15、20、25～45及60天RCS大鼠(美国Illinois大学眼科研究所惠赠，北京医科大学动物所饲养)，各4～12只，雌雄不拘。12 h光照(65～76 LUX)/12 h黑暗循环条件下饲养。同龄SD(Sprague-Dawley)大鼠作正常对照。
二、TUNEL检测[3]
25%水合氯醛腹腔麻醉动物，常规方法制备视网膜组织石蜡切片。切片经脱蜡；水化；20 mg/L的蛋白酶K 100 μl消化组织，37℃，30 min；3%过氧化氢消除内源性过氧化酶，30 min；TdT酶反应液20 μl：1×TdT缓冲液,TdT 0.3×106 U/L,Bio-11-dUTP 0.01 mmol/L(美国Promega公司)；混匀后置37℃，4h；枸橼酸缓冲液终止反应，20 min；正常马血清封闭，20 min；亲和素辣根过氧化酶复合物(美国Vector Laboratories ABC试剂盒)，1 h；DAB显色。常规封片。阳性对照片在TdT酶标记反应前用1 mg/L DNA酶I 20 μl水解DNA，37℃，30 min。
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三、P53蛋白免疫组化染色
视网膜石蜡切片经脱蜡，水化；3%过氧化氢消除内源性过氧化酶，30 min；0.01 mol/L枸橼酸缓冲液修复抗原，置95～98℃，10 min；正常马血清封闭，20 min；兔抗大鼠p53蛋白多克隆抗体(美国Novocastra Laboratories公司)1∶100稀释，4℃，过夜；生物素标记的羊抗兔抗体1∶1 000稀释，室温下置1 h；亲和素辣根过氧化酶复合物(美国Vector Laboratories ABC试剂盒)，1 h；DAB显色；Mayer苏木素复染；常规封片。
四、p53mRNA原位杂交
2 000 bp p53 cDNA裸探针按非放射性DNA探针标记方法进行地高辛标记；视网膜石蜡切片经脱蜡，水化；100 mg/L的蛋白酶K 100 μl，置于37℃，20 min；0.1 mol/L HCl，10 min；组织经70%，80%，90%，95%，100%酒精逐级脱水后晾干；每20 μl杂交液加1 μl标记探针，95℃变性3 min后，直接滴加到组织片上，封口膜覆盖，37℃，20 h；5×SSC，3×SSC，2×SSC，1×SSC逐级冲洗；地高辛缓冲液浸泡后加抗地高辛抗体(德国Boehringer Mannheim Gmbh公司)，1∶500稀释，37℃，30 min；地高辛缓冲液冲洗；BCIP/NBT显色；晾干组织后封片。
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五、p53mRNART-PCR
用Trizol抽提视网膜总RNA；紫外分光光度计测定RNA浓度；以mRNA为模板，oligo(dT)12-18为引物，SuperscriptII逆转录酶合成cDNA(Life Technologies RNA逆转录试剂盒)：20 μl逆转录反应体系含1×PCR缓冲液，总RNA 3 μg，oligo(dT)12-181 μl，2.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L dNTP，10 mmol/L DTT,70℃变性后加Superscript Ⅱ逆转录酶200 U，42℃，50 min；70℃，15 min终止反应；加1 μl RNaseH消化RNA，37℃，20min。阳性对照管用试剂盒中提供的对照RNA代替组织中抽提的总RNA。阴性对照管反应体系中不加逆转录酶。
以逆转录合成的cDNA为模板，p53第6外显子为引物(5′-TATTCTTGCTCTTAGGCCTG-3′,5′-AGT-CTTCCAGCGTGATGAT-3)(北京医科大学病理室合成)，TagDNA多聚酶的作用下扩增p53 mRNA的特定片断(232 bp)：50 μl PCR反应体系含1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP,Tag酶1 μl，cDNA 5 μl。PCR循环条件：94℃预变性，3 min；94℃，50 s；54℃，50 s；72℃，1 min；30个循环；后延伸15 min。以β-actin作为内参照(196 bp)。阳性对照管的模板用逆转录阳性对照管产物，并用相应引物。阴性对照管的模板用逆转录阴性对照管产物。5 μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
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结果
一、RCS大鼠视网膜视细胞凋亡
TUNEL染色，RCS大鼠生后第25天视网膜外核层视细胞核出现阳性染色，细胞核呈棕色染色(图1)，随鼠龄增加，阳性染色的细胞核数逐渐增加，第30～35天时达高峰(图2，3)。以后逐渐减少，至生后第60天时无阳性染色的细胞核。
图1 RCS大鼠生后第 25天视网膜， 可见少许染色阳性的视细胞核 (箭头示)TUNEL×200
图 2，3 RCS大鼠生后第30、 35天视网膜，可见阳性染色的视细胞核数明显增加 (箭头)TUNEL×200
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二、RCS大鼠视网膜视细胞p53蛋白表达
p53蛋白免疫组化染色，RCS大鼠生后第25天，视细胞内节部位出现较弱的阳性染色，呈棕色颗粒状(图4)。第28～30天，阳性染色逐渐增强，阳性颗粒主要位于视细胞内节，少量位于细胞浆和细胞核(图5)。随鼠龄增加，视细胞内节的阳性染色程度逐渐减弱，视细胞核的阳性染色逐渐增强，生后第35天时，较多的细胞核呈阳性染色(图6)。至生后第45天时无阳性染色。视网膜其它各层均为阴性染色。正常同龄SD大鼠视网膜为阴性染色。
图 4 RCS大鼠生后第25天视网膜， 视细胞内节可见阳性染色 (白箭头) 免疫组织化学染色×200
图 5 RCS大鼠生后第 28 天视网膜， 视细胞内节阳性染色 (白箭头) 明显增强免疫组织化学染色×200
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图 6 RCS大鼠生后第 天视网膜， 视细胞内节仍可见阳性染色 (白箭头) ， 并有较多视细胞核呈阳性 (箭头)免疫组织化学染色×200
三、RCS大鼠视网膜视细胞p53mRNA表达
p53mRNA原位杂交，与正常SD大鼠视网膜相比，RCS大鼠生后第25～35天时，视网膜外核层出现阳性染色，第28天时明显(图7，8)，主要位于视细胞的胞浆内(图9)，视网膜其它各层无阳性染色。
p53 mRNA RT-PCR，产物为232 bp，与预期长度相符。各鼠龄RCS大鼠和正常SD大鼠视网膜均有产物。生后第25～35天时RCS大鼠视网膜产物量偏高(图10)。重复实验，所得结果相似。
图 7 视网膜P53 mRNA原位杂交， 可见正常SD大鼠视网膜，ONL示外核层， 呈阴性?位杂交阳性染色×100
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图 8 视网膜P53 mRNA原位杂交， 生后第28天RCS大鼠视网膜，ONL 示外核层呈显著阳性染色原位杂交阳性染色×100
图 9 视网膜P53 mRNA原位杂交，局部放大， 显示阳性染色主要位于视细胞胞浆内 (箭头)?位杂交阳性染色×400
1～4示对应的β-actin mRNA产物 5～8示第25、35、60天RCS大鼠及第35天正常SD大鼠视网膜p53 mRNA产物 9示DNA marker
图10 视网膜p53 mRNA RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳
讨论
一、RCS大鼠视网膜视细胞凋亡初期p53基因高表达
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RCS大鼠系在英国皇家外科学院(Royal College of Surgeons)最早培育成功而得名。1938年已确定此鼠有遗传性视网膜变性，以后确定为常染色体隐性遗传性视网膜变性，基因型为rdy,是目前研究某些形式的视网膜色素变性、遗传性黄斑变性及脉络膜缺损等疾病的动物模型。尽管RCS大鼠的基因缺陷尚未确定，但已确定此缺陷基因特异性影响视网膜色素上皮细胞，导致其不能吞噬视细胞外节脱落的膜盘，进而导致视细胞变性死亡[4]。膜盘堆积导致视细胞死亡的机制目前尚不清楚，但已确定视细胞死亡是以细胞凋亡的形式进行[2]。我们用TUNEL方法进一步确定了视细胞凋亡的时间，发现视细胞凋亡的高峰期是生后第30～35天。在此基础上，用免疫组织化学染色、原位杂交及RT-PCR方法研究视细胞凋亡过程中p53基因的表达，在生后第28～30天，即视细胞凋亡的初期，视细胞内p53蛋白和mRNA水平均显著升高，提示p53基因可能参与视细胞凋亡的启动。
二、RCS大鼠视网膜视细胞p53蛋白表达特点
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p53蛋白是一种磷酸化蛋白，具有转录因子的活性。它在细胞质内合成，细胞核内发挥作用，与特定的基因序列结合，发挥转录因子作用，上调或下调某些基因表达，产生细胞效应。p53基因的主要生物学功能是引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡和分化。特别是细胞DNA受损断裂后，影响细胞周期调控点，使细胞停滞在G1期或G2期[5]。通常情况下，在正常或非转化细胞中，p53蛋白水平较低且半衰期很短，用免疫组织化学染色很难检测到。因此，免疫组织化学染色检测p53蛋白阳性，常提示p53蛋白有异常高表达。正常SD大鼠视网膜p53蛋白免疫组织化学染色为阴性，而RCS大鼠生后第25～35天，视细胞内p53蛋白染色阳性，特别是生后第28～30天，p53蛋白阳性染色显著增强，提示p53蛋白有异常的一过性高表达。p53蛋白高表达的时间正是大量视细胞发生凋亡的前期，提示p53蛋白可能参与视细胞凋亡的启动。p53蛋白阳性染色颗粒主要位于贴近细胞核的视杆内节胞浆内，为何在此出现目前还难以解释，可能与内节是视细胞合成蛋白质的主要部位有关。p53蛋白合成后进入细胞核发挥作用，我们在大量RCS大鼠视网膜标本中发现，视细胞核的阳性染色有逐渐增加趋势，提示视细胞内的p53蛋白也是进入细胞核发挥作用，但可能因此种p53蛋白为野生型蛋白，进入细胞核后很快被降解，故较难检测。
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三、RCS大鼠视网膜视细胞p53 mRNA表达特点
原位杂交检测同样显示，在RCS大鼠视细胞凋亡的初期，p53mRNA水平显著升高，与p53蛋白免疫组织化学染色的研究结果相符。用敏感的RT-PCR方法检测视网膜p53 mRNA也发现，RCS大鼠出生后25～35天的视网膜p53 mRNA扩增产物量偏高。但在其它时期的RCS大鼠和正常SD大鼠视网膜，也有少量p53 mRNA扩增产物，提示正常情况下视网膜有低水平p53 mRNA存在。
本研究表明，正常情况下视网膜可有低水平的p53基因表达。在RCS大鼠视网膜视细胞凋亡的初期，视细胞p53基因出现异常的高表达，与其细胞凋亡有显著的相关性。然而，目前的研究结果尚不能确定p53基因高表达是否直接引起视细胞凋亡，有待进一步研究。本研究认为，RCS大鼠视网膜视细胞p53基因高表达可能参与视细胞凋亡的启动调控。
参考文献
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1 Chang GQ, Hao Y, Wong F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron, 1993, 11: 595-605.
2 Tso MOM, Zhang C, Alber AS, et al. Apoptosis leads to photoreceptor degeneration in inherited retinal dystrophy of RCS rats. Inves Ophthalmol Vis Sci, 1994, 35: 2693-2699.
3 Gavrieli I, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119: 493-501.
4 Edwards RB, Szamier RB. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science, 1997, 197: 1001-1003.
5 Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, et al. p53 tumor suppressor gene. Nature, 1991, 531: 453-456.
(收稿日期：1999-02-10), 百拇医药
单位：刘斌(北京医科大学第三医院眼科 100083)；朱秀安(北京医科大学第三医院眼科 100083)
关键词：视网膜变性；细胞凋亡；基因；p53
中华眼科杂志000118 【摘要】 目的 研究遗传性视网膜变性视细胞凋亡的基因调控。方法 对出生后第13～60天的遗传性视网膜变性动物模型RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜，进行末端脱氧核糖核苷酸连接酶介导生物素dUTP末端标记(TUNEL)凋亡细胞检测、p53蛋白免疫组织化学染色、p53 mRNA原位杂交和RT-PCR。结果 RCS大鼠视网膜视细胞自生后第25天出现凋亡，第30～35天达高峰；视细胞凋亡初期，即生后第28～30天，视细胞内p53蛋白和mRNA水平均显著升高。RT-PCR亦显示，RCS大鼠视网膜在生后第25～35天时可见较多p53 mRNA扩增产物。结论 遗传性视网膜变性视细胞凋亡初期p53基因呈高表达，提示p53基因可能参与视细胞凋亡的调控
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Photoreceptor apoptosis and p53 gene expression in inherited retinal degeneration of RSC rats
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【Abstract】 Objective To investigate the gene regulation of photoreceptor apoptosis in inherited retinal degeneration. Method The retinas of inherited retinal degeneration in animal models of RCS (Royal College of Surgeons) rats, ranging from 13th to 60th postnatal days in age, were studied by TdT-mediated biotin-dUTP nickend labeling (TUNEL) for apoptosis, immunohistochemistry for p53 protein, in situ hybridization and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for p53 mRNA. Results The photoreceptor of RCS rats underwent apoptosis from 25th postnatal day, and reached the highest level at 30-35th postnatal days. At the early stage of photoreceptor apoptosis, the level of p53 protein and mRNA in photoreceptors increased significantly. RT-PCR also showed that there was more production of p53 mRNA at 25 to 35th postnatal days in the retinas of RCS rats. Conclusion P53 gene expression increases significantly at the early stage of photoreceptor apoptosis, indicating that p53 gene might play a role in the regulation of photoreceptor apoptosis in inherited retinal degeneration.
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【Key words】 Retinal degeneration； Apoptosis； Genes,p53
遗传性视网膜变性是严重的致盲疾患，发病机制不清，且无有效的防治方法。Chang等[1]认为,细胞凋亡可能是各种类型视网膜变性病变中视细胞死亡的共同病理途径。但目前对视细胞凋亡的分子调控机制认识甚少，尚未见某种基因或分子与视细胞凋亡调控直接相关的报道。p53基因是一种抑癌基因，可作为“凋亡基因”直接诱导细胞凋亡，在许多类型的细胞凋亡中发挥着重要作用。在研究视细胞凋亡过程中，p53基因表达对认识视细胞凋亡调控机制、寻找遗传性视网膜变性防治方法具有重要意义。
对人类遗传性视网膜变性的研究因受组织标本来源的限制，需借助动物模型。RCS(Royal College of Surgeons)大鼠是研究遗传性视网膜变性的经典动物模型，目前已确定此鼠视网膜病变主要以视细胞凋亡为主[2]。我们于1997年5月采用末端脱氧核糖核苷酸连接酶介导生物素dUTP末端标记(TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labelling，TUNEL)方法进一步确定视细胞凋亡的时间，用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法观察视细胞凋亡不同时期p53基因的表达，探讨p53基因与视细胞凋亡的关系，为进一步研究视网膜变性及视细胞凋亡的发生机制提供实验资料。
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材料与方法
一、动物
取生后第13、15、20、25～45及60天RCS大鼠(美国Illinois大学眼科研究所惠赠，北京医科大学动物所饲养)，各4～12只，雌雄不拘。12 h光照(65～76 LUX)/12 h黑暗循环条件下饲养。同龄SD(Sprague-Dawley)大鼠作正常对照。
二、TUNEL检测[3]
25%水合氯醛腹腔麻醉动物，常规方法制备视网膜组织石蜡切片。切片经脱蜡；水化；20 mg/L的蛋白酶K 100 μl消化组织，37℃，30 min；3%过氧化氢消除内源性过氧化酶，30 min；TdT酶反应液20 μl：1×TdT缓冲液,TdT 0.3×106 U/L,Bio-11-dUTP 0.01 mmol/L(美国Promega公司)；混匀后置37℃，4h；枸橼酸缓冲液终止反应，20 min；正常马血清封闭，20 min；亲和素辣根过氧化酶复合物(美国Vector Laboratories ABC试剂盒)，1 h；DAB显色。常规封片。阳性对照片在TdT酶标记反应前用1 mg/L DNA酶I 20 μl水解DNA，37℃，30 min。
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三、P53蛋白免疫组化染色
视网膜石蜡切片经脱蜡，水化；3%过氧化氢消除内源性过氧化酶，30 min；0.01 mol/L枸橼酸缓冲液修复抗原，置95～98℃，10 min；正常马血清封闭，20 min；兔抗大鼠p53蛋白多克隆抗体(美国Novocastra Laboratories公司)1∶100稀释，4℃，过夜；生物素标记的羊抗兔抗体1∶1 000稀释，室温下置1 h；亲和素辣根过氧化酶复合物(美国Vector Laboratories ABC试剂盒)，1 h；DAB显色；Mayer苏木素复染；常规封片。
四、p53mRNA原位杂交
2 000 bp p53 cDNA裸探针按非放射性DNA探针标记方法进行地高辛标记；视网膜石蜡切片经脱蜡，水化；100 mg/L的蛋白酶K 100 μl，置于37℃，20 min；0.1 mol/L HCl，10 min；组织经70%，80%，90%，95%，100%酒精逐级脱水后晾干；每20 μl杂交液加1 μl标记探针，95℃变性3 min后，直接滴加到组织片上，封口膜覆盖，37℃，20 h；5×SSC，3×SSC，2×SSC，1×SSC逐级冲洗；地高辛缓冲液浸泡后加抗地高辛抗体(德国Boehringer Mannheim Gmbh公司)，1∶500稀释，37℃，30 min；地高辛缓冲液冲洗；BCIP/NBT显色；晾干组织后封片。
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五、p53mRNART-PCR
用Trizol抽提视网膜总RNA；紫外分光光度计测定RNA浓度；以mRNA为模板，oligo(dT)12-18为引物，SuperscriptII逆转录酶合成cDNA(Life Technologies RNA逆转录试剂盒)：20 μl逆转录反应体系含1×PCR缓冲液，总RNA 3 μg，oligo(dT)12-181 μl，2.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L dNTP，10 mmol/L DTT,70℃变性后加Superscript Ⅱ逆转录酶200 U，42℃，50 min；70℃，15 min终止反应；加1 μl RNaseH消化RNA，37℃，20min。阳性对照管用试剂盒中提供的对照RNA代替组织中抽提的总RNA。阴性对照管反应体系中不加逆转录酶。
以逆转录合成的cDNA为模板，p53第6外显子为引物(5′-TATTCTTGCTCTTAGGCCTG-3′,5′-AGT-CTTCCAGCGTGATGAT-3)(北京医科大学病理室合成)，TagDNA多聚酶的作用下扩增p53 mRNA的特定片断(232 bp)：50 μl PCR反应体系含1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP,Tag酶1 μl，cDNA 5 μl。PCR循环条件：94℃预变性，3 min；94℃，50 s；54℃，50 s；72℃，1 min；30个循环；后延伸15 min。以β-actin作为内参照(196 bp)。阳性对照管的模板用逆转录阳性对照管产物，并用相应引物。阴性对照管的模板用逆转录阴性对照管产物。5 μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
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一、RCS大鼠视网膜视细胞凋亡
TUNEL染色，RCS大鼠生后第25天视网膜外核层视细胞核出现阳性染色，细胞核呈棕色染色(图1)，随鼠龄增加，阳性染色的细胞核数逐渐增加，第30～35天时达高峰(图2，3)。以后逐渐减少，至生后第60天时无阳性染色的细胞核。
图1 RCS大鼠生后第 25天视网膜， 可见少许染色阳性的视细胞核 (箭头示)TUNEL×200
图 2，3 RCS大鼠生后第30、 35天视网膜，可见阳性染色的视细胞核数明显增加 (箭头)TUNEL×200
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二、RCS大鼠视网膜视细胞p53蛋白表达
p53蛋白免疫组化染色，RCS大鼠生后第25天，视细胞内节部位出现较弱的阳性染色，呈棕色颗粒状(图4)。第28～30天，阳性染色逐渐增强，阳性颗粒主要位于视细胞内节，少量位于细胞浆和细胞核(图5)。随鼠龄增加，视细胞内节的阳性染色程度逐渐减弱，视细胞核的阳性染色逐渐增强，生后第35天时，较多的细胞核呈阳性染色(图6)。至生后第45天时无阳性染色。视网膜其它各层均为阴性染色。正常同龄SD大鼠视网膜为阴性染色。
图 4 RCS大鼠生后第25天视网膜， 视细胞内节可见阳性染色 (白箭头) 免疫组织化学染色×200
图 5 RCS大鼠生后第 28 天视网膜， 视细胞内节阳性染色 (白箭头) 明显增强免疫组织化学染色×200
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图 6 RCS大鼠生后第 天视网膜， 视细胞内节仍可见阳性染色 (白箭头) ， 并有较多视细胞核呈阳性 (箭头)免疫组织化学染色×200
三、RCS大鼠视网膜视细胞p53mRNA表达
p53mRNA原位杂交，与正常SD大鼠视网膜相比，RCS大鼠生后第25～35天时，视网膜外核层出现阳性染色，第28天时明显(图7，8)，主要位于视细胞的胞浆内(图9)，视网膜其它各层无阳性染色。
p53 mRNA RT-PCR，产物为232 bp，与预期长度相符。各鼠龄RCS大鼠和正常SD大鼠视网膜均有产物。生后第25～35天时RCS大鼠视网膜产物量偏高(图10)。重复实验，所得结果相似。
图 7 视网膜P53 mRNA原位杂交， 可见正常SD大鼠视网膜，ONL示外核层， 呈阴性?位杂交阳性染色×100
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图 8 视网膜P53 mRNA原位杂交， 生后第28天RCS大鼠视网膜，ONL 示外核层呈显著阳性染色原位杂交阳性染色×100
图 9 视网膜P53 mRNA原位杂交，局部放大， 显示阳性染色主要位于视细胞胞浆内 (箭头)?位杂交阳性染色×400
1～4示对应的β-actin mRNA产物 5～8示第25、35、60天RCS大鼠及第35天正常SD大鼠视网膜p53 mRNA产物 9示DNA marker图10 视网膜p53 mRNA RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳
讨论
一、RCS大鼠视网膜视细胞凋亡初期p53基因高表达
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RCS大鼠系在英国皇家外科学院(Royal College of Surgeons)最早培育成功而得名。1938年已确定此鼠有遗传性视网膜变性，以后确定为常染色体隐性遗传性视网膜变性，基因型为rdy,是目前研究某些形式的视网膜色素变性、遗传性黄斑变性及脉络膜缺损等疾病的动物模型。尽管RCS大鼠的基因缺陷尚未确定，但已确定此缺陷基因特异性影响视网膜色素上皮细胞，导致其不能吞噬视细胞外节脱落的膜盘，进而导致视细胞变性死亡[4]。膜盘堆积导致视细胞死亡的机制目前尚不清楚，但已确定视细胞死亡是以细胞凋亡的形式进行[2]。我们用TUNEL方法进一步确定了视细胞凋亡的时间，发现视细胞凋亡的高峰期是生后第30～35天。在此基础上，用免疫组织化学染色、原位杂交及RT-PCR方法研究视细胞凋亡过程中p53基因的表达，在生后第28～30天，即视细胞凋亡的初期，视细胞内p53蛋白和mRNA水平均显著升高，提示p53基因可能参与视细胞凋亡的启动。
二、RCS大鼠视网膜视细胞p53蛋白表达特点
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p53蛋白是一种磷酸化蛋白，具有转录因子的活性。它在细胞质内合成，细胞核内发挥作用，与特定的基因序列结合，发挥转录因子作用，上调或下调某些基因表达，产生细胞效应。p53基因的主要生物学功能是引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡和分化。特别是细胞DNA受损断裂后，影响细胞周期调控点，使细胞停滞在G1期或G2期[5]。通常情况下，在正常或非转化细胞中，p53蛋白水平较低且半衰期很短，用免疫组织化学染色很难检测到。因此，免疫组织化学染色检测p53蛋白阳性，常提示p53蛋白有异常高表达。正常SD大鼠视网膜p53蛋白免疫组织化学染色为阴性，而RCS大鼠生后第25～35天，视细胞内p53蛋白染色阳性，特别是生后第28～30天，p53蛋白阳性染色显著增强，提示p53蛋白有异常的一过性高表达。p53蛋白高表达的时间正是大量视细胞发生凋亡的前期，提示p53蛋白可能参与视细胞凋亡的启动。p53蛋白阳性染色颗粒主要位于贴近细胞核的视杆内节胞浆内，为何在此出现目前还难以解释，可能与内节是视细胞合成蛋白质的主要部位有关。p53蛋白合成后进入细胞核发挥作用，我们在大量RCS大鼠视网膜标本中发现，视细胞核的阳性染色有逐渐增加趋势，提示视细胞内的p53蛋白也是进入细胞核发挥作用，但可能因此种p53蛋白为野生型蛋白，进入细胞核后很快被降解，故较难检测。
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三、RCS大鼠视网膜视细胞p53 mRNA表达特点
原位杂交检测同样显示，在RCS大鼠视细胞凋亡的初期，p53mRNA水平显著升高，与p53蛋白免疫组织化学染色的研究结果相符。用敏感的RT-PCR方法检测视网膜p53 mRNA也发现，RCS大鼠出生后25～35天的视网膜p53 mRNA扩增产物量偏高。但在其它时期的RCS大鼠和正常SD大鼠视网膜，也有少量p53 mRNA扩增产物，提示正常情况下视网膜有低水平p53 mRNA存在。
本研究表明，正常情况下视网膜可有低水平的p53基因表达。在RCS大鼠视网膜视细胞凋亡的初期，视细胞p53基因出现异常的高表达，与其细胞凋亡有显著的相关性。然而，目前的研究结果尚不能确定p53基因高表达是否直接引起视细胞凋亡，有待进一步研究。本研究认为，RCS大鼠视网膜视细胞p53基因高表达可能参与视细胞凋亡的启动调控。
参考文献
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1 Chang GQ, Hao Y, Wong F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron, 1993, 11: 595-605.
2 Tso MOM, Zhang C, Alber AS, et al. Apoptosis leads to photoreceptor degeneration in inherited retinal dystrophy of RCS rats. Inves Ophthalmol Vis Sci, 1994, 35: 2693-2699.
3 Gavrieli I, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119: 493-501.
4 Edwards RB, Szamier RB. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science, 1997, 197: 1001-1003.
5 Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, et al. p53 tumor suppressor gene. Nature, 1991, 531: 453-456.
(收稿日期：1999-02-10), 百拇医药