血小板第4因子对急性照射小鼠造血保护作用的实验研究
作者：朱柏贵 杨岚 田琼 张绍章 张发科 孙秉中
单位：朱柏贵(710032 西安，第四军医大学西京医院[(现在江苏省武警医院))；杨岚(710032 西安，第四军医大学西京医院[(现在江苏省武警医院))；孙秉中(710032 西安，第四军医大学西京医院[(现在江苏省武警医院))；朱柏贵(现在江苏省武警医院)；田琼(第四军医大学放射医学教研室)；张绍章(第四军医大学放射医学教研室)；张发科(第四军医大学放射医学教研室)
关键词：
中华血液学杂志000618 近年的研究表明，血小板第4因子(PF4)可抑制造血干/祖细胞的生长[1，2]，其抑制作用是可逆的，利用此性质能保护骨髓造血干/祖细胞免受损伤[3] 。作为肿瘤治疗重要手段之一的放疗及核泄漏等意外事故造成的核辐射可损伤正常造血组织，出现感染、出血甚至死亡。我们旨在探讨PF4对急性放射损伤小鼠骨髓细胞保护的作用机制。
, 百拇医药
材料和方法
1 实验动物 BALB/c小鼠，雄性，体重18～20g，鼠龄10～12周，购自第四军医大学实验动物中心。
2 照射条件 60Coγ射线一次全身均匀照射，吸收剂量为7.5Gy，吸收剂量率为1.67Gy/min。
3 试剂 PF4由上海贝特公司提供，用双蒸水稀释成工作液，置4℃冰箱保存备用，稀释浓度为100μg/ml。
4 小鼠的处理 将30只小鼠随机分3组，每组10只。用PF4或PBS小鼠腹腔注射(ip)2次，间隔6h，第2次注射后20h，接受7.5Gy 60Coγ射线全身照射。①照射组：PBS 每次17ml/kg×2；②PF4+照射组：PF4 每次20μg/kg×2；③对照组：不接受ip及照射。照后8d，每组小鼠经颈椎脱臼法处死，取股骨骨髓细胞，计数股骨骨髓有核细胞数(BMC)。取出脾脏并浸泡在Bouin’液中24h,观察脾结节形成率。取出肺，留做细胞培养刺激因子。
, 百拇医药
5 粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)测定 用体外双层琼脂培养法。底层加入：RPMI 1640 13.33ml，马血清6.66ml，肺组织(直径0.1cm)3块，3g/L琼脂 2.13ml；上层加入：
RPMI 1640 4.39ml，马血清2.33ml，30g/L琼脂 0.6ml，骨髓有核细胞1×105。每组实验的培养物均一式7份，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育8d，然后在倒置显微镜下计数CFU-GM数。
6 BMC的DNA测定 将每组小鼠BMC 1×108，加入到10ml 10-3mol/L CaCl2中磨碎，3000r/min离心10min(1℃)，沉淀，加入4ml 0.2mol/L过氯酸，水解15min(90℃条件下)，再离心取上清，用紫外分光光度计测量DNA含量[吸光度，(A)]。
, 百拇医药
7 流式细胞仪分析细胞周期 1×106BMC用体积分数为70%的乙醇固定，碘化丙锭染色， 用流式细胞仪分析死亡细胞及细胞周期变化情况。
8 统计学处理 数据以
±s表示，组间比较用t检验。
结果
1 PF4对小鼠BMC数、DNA含量、CFU-GM的影响 7.5Gy 60Coγ射线全身照射后第8天，照射组与PF4预处理组BMC数、DNA含量均明显减少，但照射组更明显，二者之间差异显著(P<0.01)，PF4预处理组CFU-GM较照射组显著增高，且较对照组比较也明显增高，分别与二者比较，P<0.01和P<0.05(见表1)。
表1 小鼠照射后第8天BMC数、DNA含量、CFU-GM(个/股骨)的变化(±s) 组别
, http://www.100md.com
鼠数
BMC数
(×109/L)
DNA含量(A)
CFU-GM
照射
10
4.69±0.87
0.0814±0.00015
3.3±2.4
PF4+照射
10
, 百拇医药
31.25±6.57△
0.2550±0.00027△
89.6±13.2△
对照
10
175.00±12.96
0.8396±0.05356
74.1±11.8
注：与照射组比较，△P<0.01
2 PF4对内源性脾结节形成的影响 照射后第8天的脾结节数，PF4预处理组为6.25/只，对照组为1.50/只，PF4预处理组明显增高,二者比较差异有显著性意义(P<0.01)。
, 百拇医药
3 PF4对骨髓细胞周期的影响 用流式细胞仪分别测定了照射后第8天照射组、PF4处理组及对照组细胞周期分布，各期所占的比例见表2，照射组较PF4处理组及对照组细胞体积增大，分布弥散，出现了异常增高的坏死、凋亡峰，比例达63.8%，G1期细胞明显减少，为23.8%(见图1)，其S期比例相对增高。从以上还可以看出，PF4处理组细胞体积无明显增大，分布较集中，坏死细胞占0.5%，G1期细胞较照射组增高。
表2 流式细胞仪测定受照小鼠第8天BMC周期分布(%) 组别
鼠数
细胞周期分布
死亡细胞
G0/G1
, 百拇医药
S
G2/M
照射
10
74.0
19.6
6.4
63.8
PF4+照射
10
83.6
13.5
2.9
, 百拇医药
0.5
对照
10
83.9
13.8
2.4
0.2
4 PF4对照射小鼠30d存活率的影响 接受7.5Gy 60Coγ射线全身照射后30d存活率，照射组为0，PF4 每次20μg/kg组为55%，PF4 每次40μg/kg和每次60μg/kg组均为60% ，PF4预处理三组间比较，差异无显著性(P>0.05)。
5 本实验重复2次，结果基本相同，经统计学处理差异无显著性。 讨 论
, http://www.100md.com
近年的研究表明，PF4对造血干/祖细胞的抑制作用是可逆的，主要是通过抑制DNA 的合成，使细胞增殖周期停滞于S期[4]，造成对细胞增殖的暂时抑制，从而可避免周期特异性细胞毒剂的损伤。体外实验表明，CD34+脐血细胞经PF4预处理48h后，对细胞毒性的化疗药物有较大的耐受性，且不提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受性[3，5]。
辐射可以引起碱基的损伤，糖基的破坏，DNA链的断裂，DNA交联及二、三级结构的变化。细胞可以出现染色体畸变、突变、凋亡等不同的死亡过程。辐射的敏感性随着细胞中的DNA含量而增加，细胞DNA的含量越高越易受γ射线的损伤。在影响辐射细胞效应中，细胞周期有明显作用，其各时相对辐射的敏感性不一致，在G2、M期附近最敏感，S期最不敏感[6]。骨髓造血干/祖细胞是辐射最敏感的细胞群体，其死亡形式是增殖性死亡。本实验显示, PF4可提高7.5Gy γ射线受照小鼠内源性脾结节数以及BMC数，能显著减少辐射损伤后细胞的死亡率，证明PF4能避免或减少骨髓造血干/祖细胞的辐射损伤。PF4处理组BMC的DNA含量及CFU-GM集落数比照射组显著增高，且PF4处理组CFU-GM集落较照组也明显增高，G1期比例增高，说明PF4促进保护后的造血干/祖细胞进入细胞周期并增殖、分化。流式细胞分析结果表明，受照第8天，照射组BMC的死亡率达63.8%，S期比例也相对增高，说明BMC对γ射线敏感，呈增殖性死亡。另外，实验还显示PF4能提高7.5Gy γ射线受照小鼠30d的存活率，也反映了PF4能保护小鼠造血系统，避免骨髓造血功能衰竭。
, http://www.100md.com
上述结果表明，正常骨髓细胞经PF4处理后，对辐射具有较大的耐受性。这一作用可望达到临床肿瘤放化疗时保护造血干细胞的目的。
DNA含量(相对荧光强度)
图1 用流式细胞仪分析PF4对照射小鼠BMC(照射后第8天)的影响
参考文献
1，Xi XD,Caen JP,Fournier S,et al.Direct and reversible inhibition of platelet factor 4 on megakaryocyte development from CD34+ cord blood cells: comparative studies with transforming growth factor β1.Br J Haemetol,1996, 93:265-272.
, 百拇医药
2，Lecomte-Raclet L, Alemany M, Grand AS, et al. New insights into the negative regulation of hematopoiesis by chemokine platelet factor 4 and related peptides. Blood,1998, 91:2772-2780.
3，Han ZC,Lu M,Li J,et al.Platelet factor 4 and other CXC chemokines support the survival of normal hematopoietic cells and reduce the chemosensitivity of cell to cytoxic agents.Blood,1997,89:2328-2335.
4，韩忠朝,张学军,奚晓东,等.PF4保护造血前体细胞及其作用机制的研究.实验生物学报,1996,28:415-425.
5，Aidoudi S,Guigon M,Lebeurier I,et al.In vivo effect of platelet factor 4 (PF4) and tetrapeptide AcSDKP on haemopoiesis of mice treated with 5-fluorouracil. Br J Haematol,1996,94:443-448.
6，刘及,主编.辐射血液学.第1版.北京:原子能出版社,1991.12-38.
(收稿日期：1999-07-16), http://www.100md.com
单位：朱柏贵(710032 西安，第四军医大学西京医院[(现在江苏省武警医院))；杨岚(710032 西安，第四军医大学西京医院[(现在江苏省武警医院))；孙秉中(710032 西安，第四军医大学西京医院[(现在江苏省武警医院))；朱柏贵(现在江苏省武警医院)；田琼(第四军医大学放射医学教研室)；张绍章(第四军医大学放射医学教研室)；张发科(第四军医大学放射医学教研室)
关键词：
中华血液学杂志000618 近年的研究表明，血小板第4因子(PF4)可抑制造血干/祖细胞的生长[1，2]，其抑制作用是可逆的，利用此性质能保护骨髓造血干/祖细胞免受损伤[3] 。作为肿瘤治疗重要手段之一的放疗及核泄漏等意外事故造成的核辐射可损伤正常造血组织，出现感染、出血甚至死亡。我们旨在探讨PF4对急性放射损伤小鼠骨髓细胞保护的作用机制。
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材料和方法
1 实验动物 BALB/c小鼠，雄性，体重18～20g，鼠龄10～12周，购自第四军医大学实验动物中心。
2 照射条件 60Coγ射线一次全身均匀照射，吸收剂量为7.5Gy，吸收剂量率为1.67Gy/min。
3 试剂 PF4由上海贝特公司提供，用双蒸水稀释成工作液，置4℃冰箱保存备用，稀释浓度为100μg/ml。
4 小鼠的处理 将30只小鼠随机分3组，每组10只。用PF4或PBS小鼠腹腔注射(ip)2次，间隔6h，第2次注射后20h，接受7.5Gy 60Coγ射线全身照射。①照射组：PBS 每次17ml/kg×2；②PF4+照射组：PF4 每次20μg/kg×2；③对照组：不接受ip及照射。照后8d，每组小鼠经颈椎脱臼法处死，取股骨骨髓细胞，计数股骨骨髓有核细胞数(BMC)。取出脾脏并浸泡在Bouin’液中24h,观察脾结节形成率。取出肺，留做细胞培养刺激因子。
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5 粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)测定 用体外双层琼脂培养法。底层加入：RPMI 1640 13.33ml，马血清6.66ml，肺组织(直径0.1cm)3块，3g/L琼脂 2.13ml；上层加入：
RPMI 1640 4.39ml，马血清2.33ml，30g/L琼脂 0.6ml，骨髓有核细胞1×105。每组实验的培养物均一式7份，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育8d，然后在倒置显微镜下计数CFU-GM数。
6 BMC的DNA测定 将每组小鼠BMC 1×108，加入到10ml 10-3mol/L CaCl2中磨碎，3000r/min离心10min(1℃)，沉淀，加入4ml 0.2mol/L过氯酸，水解15min(90℃条件下)，再离心取上清，用紫外分光光度计测量DNA含量[吸光度，(A)]。
, 百拇医药
7 流式细胞仪分析细胞周期 1×106BMC用体积分数为70%的乙醇固定，碘化丙锭染色， 用流式细胞仪分析死亡细胞及细胞周期变化情况。
8 统计学处理 数据以
±s表示，组间比较用t检验。结果
1 PF4对小鼠BMC数、DNA含量、CFU-GM的影响 7.5Gy 60Coγ射线全身照射后第8天，照射组与PF4预处理组BMC数、DNA含量均明显减少，但照射组更明显，二者之间差异显著(P<0.01)，PF4预处理组CFU-GM较照射组显著增高，且较对照组比较也明显增高，分别与二者比较，P<0.01和P<0.05(见表1)。
表1 小鼠照射后第8天BMC数、DNA含量、CFU-GM(个/股骨)的变化(
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
BMC数
(×109/L)
DNA含量(A)
CFU-GM
照射
10
4.69±0.87
0.0814±0.00015
3.3±2.4
PF4+照射
10
, 百拇医药
31.25±6.57△
0.2550±0.00027△
89.6±13.2△
对照
10
175.00±12.96
0.8396±0.05356
74.1±11.8
注：与照射组比较，△P<0.01
2 PF4对内源性脾结节形成的影响 照射后第8天的脾结节数，PF4预处理组为6.25/只，对照组为1.50/只，PF4预处理组明显增高,二者比较差异有显著性意义(P<0.01)。
, 百拇医药
3 PF4对骨髓细胞周期的影响 用流式细胞仪分别测定了照射后第8天照射组、PF4处理组及对照组细胞周期分布，各期所占的比例见表2，照射组较PF4处理组及对照组细胞体积增大，分布弥散，出现了异常增高的坏死、凋亡峰，比例达63.8%，G1期细胞明显减少，为23.8%(见图1)，其S期比例相对增高。从以上还可以看出，PF4处理组细胞体积无明显增大，分布较集中，坏死细胞占0.5%，G1期细胞较照射组增高。
表2 流式细胞仪测定受照小鼠第8天BMC周期分布(%) 组别
鼠数
细胞周期分布
死亡细胞
G0/G1
, 百拇医药
S
G2/M
照射
10
74.0
19.6
6.4
63.8
PF4+照射
10
83.6
13.5
2.9
, 百拇医药
0.5
对照
10
83.9
13.8
2.4
0.2
4 PF4对照射小鼠30d存活率的影响 接受7.5Gy 60Coγ射线全身照射后30d存活率，照射组为0，PF4 每次20μg/kg组为55%，PF4 每次40μg/kg和每次60μg/kg组均为60% ，PF4预处理三组间比较，差异无显著性(P>0.05)。
5 本实验重复2次，结果基本相同，经统计学处理差异无显著性。 讨 论
, http://www.100md.com
近年的研究表明，PF4对造血干/祖细胞的抑制作用是可逆的，主要是通过抑制DNA 的合成，使细胞增殖周期停滞于S期[4]，造成对细胞增殖的暂时抑制，从而可避免周期特异性细胞毒剂的损伤。体外实验表明，CD34+脐血细胞经PF4预处理48h后，对细胞毒性的化疗药物有较大的耐受性，且不提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受性[3，5]。
辐射可以引起碱基的损伤，糖基的破坏，DNA链的断裂，DNA交联及二、三级结构的变化。细胞可以出现染色体畸变、突变、凋亡等不同的死亡过程。辐射的敏感性随着细胞中的DNA含量而增加，细胞DNA的含量越高越易受γ射线的损伤。在影响辐射细胞效应中，细胞周期有明显作用，其各时相对辐射的敏感性不一致，在G2、M期附近最敏感，S期最不敏感[6]。骨髓造血干/祖细胞是辐射最敏感的细胞群体，其死亡形式是增殖性死亡。本实验显示, PF4可提高7.5Gy γ射线受照小鼠内源性脾结节数以及BMC数，能显著减少辐射损伤后细胞的死亡率，证明PF4能避免或减少骨髓造血干/祖细胞的辐射损伤。PF4处理组BMC的DNA含量及CFU-GM集落数比照射组显著增高，且PF4处理组CFU-GM集落较照组也明显增高，G1期比例增高，说明PF4促进保护后的造血干/祖细胞进入细胞周期并增殖、分化。流式细胞分析结果表明，受照第8天，照射组BMC的死亡率达63.8%，S期比例也相对增高，说明BMC对γ射线敏感，呈增殖性死亡。另外，实验还显示PF4能提高7.5Gy γ射线受照小鼠30d的存活率，也反映了PF4能保护小鼠造血系统，避免骨髓造血功能衰竭。
, http://www.100md.com
上述结果表明，正常骨髓细胞经PF4处理后，对辐射具有较大的耐受性。这一作用可望达到临床肿瘤放化疗时保护造血干细胞的目的。
DNA含量(相对荧光强度)
图1 用流式细胞仪分析PF4对照射小鼠BMC(照射后第8天)的影响
参考文献
1，Xi XD,Caen JP,Fournier S,et al.Direct and reversible inhibition of platelet factor 4 on megakaryocyte development from CD34+ cord blood cells: comparative studies with transforming growth factor β1.Br J Haemetol,1996, 93:265-272.
, 百拇医药
2，Lecomte-Raclet L, Alemany M, Grand AS, et al. New insights into the negative regulation of hematopoiesis by chemokine platelet factor 4 and related peptides. Blood,1998, 91:2772-2780.
3，Han ZC,Lu M,Li J,et al.Platelet factor 4 and other CXC chemokines support the survival of normal hematopoietic cells and reduce the chemosensitivity of cell to cytoxic agents.Blood,1997,89:2328-2335.
4，韩忠朝,张学军,奚晓东,等.PF4保护造血前体细胞及其作用机制的研究.实验生物学报,1996,28:415-425.
5，Aidoudi S,Guigon M,Lebeurier I,et al.In vivo effect of platelet factor 4 (PF4) and tetrapeptide AcSDKP on haemopoiesis of mice treated with 5-fluorouracil. Br J Haematol,1996,94:443-448.
6，刘及,主编.辐射血液学.第1版.北京:原子能出版社,1991.12-38.
(收稿日期：1999-07-16), http://www.100md.com