一种神经生长的抑制性因子——collapsin-1的提取和功能测定
作者：丁新生 都爱莲 邓晓萱 姚 娟 程 虹
单位：210029南京医科大学第一附属医院神经内科
关键词：神经生长抑制因子；collapsin-1；背根神经节；生长冠萎缩
临床神经病学杂志000201 【摘要】 目的 提取一种成年鸡脑源性的神经生长抑制因子——collapsin-1并测定其功能。方法 鸡脑膜粗提物通过数个离子交换柱和麦胚凝集素亲和柱，再经SDS-PAGE电泳纯化，用背根神经节(DRG)培养物检测其致萎缩活性。结果 成年鸡脑膜提取物具有导致背根神经节生长冠萎缩的活性；随纯度的增加，活性也增加。100 kd的蛋白质与致萎缩活性紧密相关。结论 collapsin-1为一种成年鸡脑源性神经生长抑制因子。
Purification and identification a neuron growth inhibitor-collapsin-1
, 百拇医药
Ding Xinsheng, Du Ailian, Deng Xiaoxuan,et al.
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To purify and identify an adult chick brain-derived neuron growth inhibitor-collapsin-1.Methods Chick brain extract was purified through several ion exchange columns and a wheat germ agglutinin(WGA) affinity column,fractions from each step were purified by SDS-PAGE electrophoresis,their collapsing activities were assessed by a dorsal root ganglia (DRG) cell culture.Results Adult chick brain extract could result in the activity of DRG growth cone collapse.The collapsing activity increased accor-ding to the increase of proteins purity.A 100 kd protein was immediately related to collapsing activity.Conclusion Collapsin-1 was an adult chick brain-derived neuron growth inhibitor.
, 百拇医药
【Key words】 Neuron growth inhibitor Collapsin-1 Dorsal root ganglia Growth cone collapse
近年研究发现除神经营养因子(NTF)外，神经系统中还存在着特异性的轴突生长吸引因子和轴突生长抑制因子[1]。它们在轴突生长冠的周围不同时空范围内不均衡地表达，诱导特定的神经轴突穿行相当长的距离后，准确地投射到靶部位，因此统称为神经诱向因子[2]。国外学者已提取和确认了许多种神经诱向因子[3,4]，国内尚缺乏有关报道。我们在美国同道的协助下，提取和纯化了成年鸡脑源性神经生长抑制性因子(NGI) collapsin-1，并检测了其致萎缩功能，为进一步研究神经抑制因子提供了可靠的方法。
1 材料和方法
1.1 材料 新鲜成年鸡软脑膜，E7新鲜存活鸡胚。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 蛋白质的分离和纯化 参考Raper[5]的方法，取出液氮冷冻的新鲜鸡脑膜，Hank液中浸泡，搅碎，10000 r/min离心。沉淀用Hank液洗3遍。2.25 M蔗糖PBS重悬，所得混合物用0.8 M和2.25 M的蔗糖PBS抽提。12000 r/min离心后，收集位于上层和中层之间的脑膜混合物，0.5×PBS洗3遍，-70℃冷冻备用。
取出冷冻的脑膜混合物用0.5×PBS(另加3%胆酸)浸泡，匀浆后在4℃下100 000 r/min离心1小时。上清通过Q-Sepharose阴离子交换柱，滤液通过S-Sepharose阳离子交换柱，所得洗脱液(S-洗脱液)与麦胚凝集素4℃下共同孵育2小时，4个柱体积冲洗液(内加0.5 M的N-乙酰-D-葡糖胺)洗脱。麦胚凝集素-洗脱液通过一个Mono S阳离子交换柱(HR 5/5)，逐渐增加冲洗液中的盐浓度进行洗脱。按1 ml/管收集流出液。每管中取1 μl加入背根神经节(DRG)培养物中观察其活性，将能引起50%以上生长冠萎缩的样品收集起来，等体积的冲洗液稀释，再次通过Mono S阳离子交换柱，流出物分为活性组和非活性组。
, 百拇医药
1.2.2 DRG的培养及致萎缩功能的检测 按照Fan[6]提供的方法培养DRG细胞。简言之，取E7 背根神经节剪成小块，置于laminin包被的盖片上，一起放入含F-12标准培养液的48孔板中，37℃ CO2环境中培养18～24小时。取少量各阶段的提取物(其中胆碱脂粗提物在4℃ PBS中过夜)分别加入各孔中，与培养液轻轻混匀，37℃ 5% 的CO2中孵育1小时，用4%的多聚甲醛在含10%蔗糖的PBS中固定1小时，显微镜下计算发生萎缩的生长冠所占的百分比，导致50%以上发生萎缩的被认为有活性。
1.2.3 电泳 将各阶段的提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后计算各条带的分子量。
2 结 果
2.1 致萎缩活性的识别 生长冠的生长和萎缩是以其尖端特殊结构的动态变化为基础的[7]。在培养液中，生长冠上有十余条细丝状的丝状伪足和基部帆幕状的板状伪足，它们在培养液中不停地伸展、回缩，介导生长冠的生长。加入抑制因子后，丝状伪足立即停止摆动，继之回缩、变短；板状伪足也缩回形成浓缩的残球。甲醛固定以后，未发生萎缩的生长冠膨大，有突起；萎缩的生长冠则失去了突起，呈枯枝状。
, 百拇医药
2.2 纯化蛋白的检测 鸡脑膜中提取的活性物质能结合阳离子交换柱和WGA亲和柱，并易于洗脱下来[3]。这种特性用来浓缩和纯化致萎缩活性物质。我们的检测结果显示，各阶段提取物导致50%生长冠萎缩所需要蛋白浓度依次为：胆碱脂粗提物16 μg/ml、S-洗脱物2 μg/ml、WGA-洗脱物72 ng/ml、两次Mono S洗脱物均为6 ng/ml(蛋白含量据Bradlyze的方法计算[8])。第2次Mono S洗脱物中的活性组即为部分纯化的神经抑制因子。
2.3 活性蛋白的确认 我们把活性组、非活性组及提纯各阶段的所得物通过SDS-PAGE电泳。活性组在100 kd处有一明显的条带，而非活性组中几乎没有此带。与其他组相比，随着纯化倍数的增加，这个条带更加明显，在活性组中最明显，约占总区带强度的10%～20%，提示该蛋白与致萎缩活性呈现紧密相关性。
将该100 kd蛋白条带洗脱下来，胰酶消化后通过液相色谱柱分离，Edman降解法测序得到4个肽段。BLAST程序[9]查找发现这4个肽段与Luo等[4]提取的蛋白collapsin-1 完全匹配，证明我们提取的蛋白为神经抑制因子collapsin-1。
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3 讨 论
Raper等[5]发现，胚胎鸡脑膜粗提物具有导致生长冠萎缩的功能，而且这种活性具有胰酶敏感性和热不稳定性，提示它可能是蛋白质。我们用离子交换法纯化了成年鸡脑源性蛋白质collapsin-1，它的含量与致萎缩活性呈现明显的相关性，提示它最可能是导致DRG生长冠萎缩的蛋白质，且蛋白测序结果与Luo等的报道完全一致。Luo等还克隆表达了collapsin-1的cDNA，所得的重组collapsin-1与天然collapsin-1对DRG生长冠具有相似的致萎缩活性。以上结果均证明，collapsin-1就是鸡脑膜中导致DRG生长冠萎缩的神经生长抑制因子。我们的实验验证了抑制因子的存在，为进一步研究神经抑制因子提供了可靠的方法。
近几年的研究发现神经生长抑制因子为一大家族结构同源、功能相近的蛋白质[1]。我们所提取的collapsin-1属于第3个亚家族(即sema3A)[10]，它通过膜表面受体neuropilin-1[11]启动依赖cGMP的细胞内信号传导过程[12]，介导生长冠的萎缩。另有研究表明：降低细胞内cGMP水平和加入collapsin-1的抗体[13]或neuropilin-1的抗体[11]都能逆转或中和生长冠对sema3A的萎缩反应，这些结果使外源性干预中枢神经损伤后的再生成为可能。
, 百拇医药
总之，神经生长抑制因子的发现为神经科学的研究注入了新的活力，它在成年鸡脑中的表达初步解释了中枢神经损伤后不能再生的原因，对这个领域的深入研究使最终解决中枢神经损伤后的再生问题成为可能。
本课题为国家自然科学基金(No. 39840011)、江苏省自然科学基金(No. BK97057)资助项目
参 考 文 献
1 Keynes R,Cook GMW.Axon guidance molecules.Cell,1995,83:161
2 Tessier-Lavigne M,Goodman CS.The molecular biology of axon guidance.Science,1996,274:1123
3 Kolodikin AL,Matthes DJ,Goodman CS.The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules. Cell,1993,75:1389
, 百拇医药
4 Luo YL,Raible D,Raper AJ. Collapsin:a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones.Cell,1993,75:217
5 Raper JA,Kapfhammer JP.The enrichment of a neuronal growth cone collapsing activity from embryonic chick brain. Neuron,1990,4:21
6 Fan JH,Mansfield SG,Redmond T,et al. The organization of F-actin and mecrotubules in growth cones exposed to a brainderived collapsing factor.J Cell Biol，1993,121:867
, http://www.100md.com
7 Bentley D,Toroian-Raymond A.Disoriented pathfinding by pioneer neuron growth cones deprived of filopodia by cytochalasin treatment.Nature,1986,323:712
8 Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976,72:248
9 Altschul SF,Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool.J Mol Biol，1990,215:403
, 百拇医药
10 Semaphorin Nomenclature Committee. Unified nomenclature for the semaphorins/collapsins.Cell,1999,97:551
11 He ZG,Tessier-Lavigne M.Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent semophorin Ⅲ.Cell,1997,90:739
12 Song HJ,Ming GL,He ZG,et al. Conversion of neuronal growth cone responses from repulsion to attraction by cyclic nucleotides.Science,1998,281:1515
13 丁新生，都爱莲，邓晓萱，等.神经生长抑制因子collapsin-1的致萎缩活性可被它的抗体所阻断.江苏医药，2000,26:85
(收稿1999-12-07 修回2000-01-11), http://www.100md.com
单位：210029南京医科大学第一附属医院神经内科
关键词：神经生长抑制因子；collapsin-1；背根神经节；生长冠萎缩
临床神经病学杂志000201 【摘要】 目的 提取一种成年鸡脑源性的神经生长抑制因子——collapsin-1并测定其功能。方法 鸡脑膜粗提物通过数个离子交换柱和麦胚凝集素亲和柱，再经SDS-PAGE电泳纯化，用背根神经节(DRG)培养物检测其致萎缩活性。结果 成年鸡脑膜提取物具有导致背根神经节生长冠萎缩的活性；随纯度的增加，活性也增加。100 kd的蛋白质与致萎缩活性紧密相关。结论 collapsin-1为一种成年鸡脑源性神经生长抑制因子。
Purification and identification a neuron growth inhibitor-collapsin-1
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Ding Xinsheng, Du Ailian, Deng Xiaoxuan,et al.
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To purify and identify an adult chick brain-derived neuron growth inhibitor-collapsin-1.Methods Chick brain extract was purified through several ion exchange columns and a wheat germ agglutinin(WGA) affinity column,fractions from each step were purified by SDS-PAGE electrophoresis,their collapsing activities were assessed by a dorsal root ganglia (DRG) cell culture.Results Adult chick brain extract could result in the activity of DRG growth cone collapse.The collapsing activity increased accor-ding to the increase of proteins purity.A 100 kd protein was immediately related to collapsing activity.Conclusion Collapsin-1 was an adult chick brain-derived neuron growth inhibitor.
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【Key words】 Neuron growth inhibitor Collapsin-1 Dorsal root ganglia Growth cone collapse
近年研究发现除神经营养因子(NTF)外，神经系统中还存在着特异性的轴突生长吸引因子和轴突生长抑制因子[1]。它们在轴突生长冠的周围不同时空范围内不均衡地表达，诱导特定的神经轴突穿行相当长的距离后，准确地投射到靶部位，因此统称为神经诱向因子[2]。国外学者已提取和确认了许多种神经诱向因子[3,4]，国内尚缺乏有关报道。我们在美国同道的协助下，提取和纯化了成年鸡脑源性神经生长抑制性因子(NGI) collapsin-1，并检测了其致萎缩功能，为进一步研究神经抑制因子提供了可靠的方法。
1 材料和方法
1.1 材料 新鲜成年鸡软脑膜，E7新鲜存活鸡胚。
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1.2 方法
1.2.1 蛋白质的分离和纯化 参考Raper[5]的方法，取出液氮冷冻的新鲜鸡脑膜，Hank液中浸泡，搅碎，10000 r/min离心。沉淀用Hank液洗3遍。2.25 M蔗糖PBS重悬，所得混合物用0.8 M和2.25 M的蔗糖PBS抽提。12000 r/min离心后，收集位于上层和中层之间的脑膜混合物，0.5×PBS洗3遍，-70℃冷冻备用。
取出冷冻的脑膜混合物用0.5×PBS(另加3%胆酸)浸泡，匀浆后在4℃下100 000 r/min离心1小时。上清通过Q-Sepharose阴离子交换柱，滤液通过S-Sepharose阳离子交换柱，所得洗脱液(S-洗脱液)与麦胚凝集素4℃下共同孵育2小时，4个柱体积冲洗液(内加0.5 M的N-乙酰-D-葡糖胺)洗脱。麦胚凝集素-洗脱液通过一个Mono S阳离子交换柱(HR 5/5)，逐渐增加冲洗液中的盐浓度进行洗脱。按1 ml/管收集流出液。每管中取1 μl加入背根神经节(DRG)培养物中观察其活性，将能引起50%以上生长冠萎缩的样品收集起来，等体积的冲洗液稀释，再次通过Mono S阳离子交换柱，流出物分为活性组和非活性组。
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1.2.2 DRG的培养及致萎缩功能的检测 按照Fan[6]提供的方法培养DRG细胞。简言之，取E7 背根神经节剪成小块，置于laminin包被的盖片上，一起放入含F-12标准培养液的48孔板中，37℃ CO2环境中培养18～24小时。取少量各阶段的提取物(其中胆碱脂粗提物在4℃ PBS中过夜)分别加入各孔中，与培养液轻轻混匀，37℃ 5% 的CO2中孵育1小时，用4%的多聚甲醛在含10%蔗糖的PBS中固定1小时，显微镜下计算发生萎缩的生长冠所占的百分比，导致50%以上发生萎缩的被认为有活性。
1.2.3 电泳 将各阶段的提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后计算各条带的分子量。
2 结 果
2.1 致萎缩活性的识别 生长冠的生长和萎缩是以其尖端特殊结构的动态变化为基础的[7]。在培养液中，生长冠上有十余条细丝状的丝状伪足和基部帆幕状的板状伪足，它们在培养液中不停地伸展、回缩，介导生长冠的生长。加入抑制因子后，丝状伪足立即停止摆动，继之回缩、变短；板状伪足也缩回形成浓缩的残球。甲醛固定以后，未发生萎缩的生长冠膨大，有突起；萎缩的生长冠则失去了突起，呈枯枝状。
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2.2 纯化蛋白的检测 鸡脑膜中提取的活性物质能结合阳离子交换柱和WGA亲和柱，并易于洗脱下来[3]。这种特性用来浓缩和纯化致萎缩活性物质。我们的检测结果显示，各阶段提取物导致50%生长冠萎缩所需要蛋白浓度依次为：胆碱脂粗提物16 μg/ml、S-洗脱物2 μg/ml、WGA-洗脱物72 ng/ml、两次Mono S洗脱物均为6 ng/ml(蛋白含量据Bradlyze的方法计算[8])。第2次Mono S洗脱物中的活性组即为部分纯化的神经抑制因子。
2.3 活性蛋白的确认 我们把活性组、非活性组及提纯各阶段的所得物通过SDS-PAGE电泳。活性组在100 kd处有一明显的条带，而非活性组中几乎没有此带。与其他组相比，随着纯化倍数的增加，这个条带更加明显，在活性组中最明显，约占总区带强度的10%～20%，提示该蛋白与致萎缩活性呈现紧密相关性。
将该100 kd蛋白条带洗脱下来，胰酶消化后通过液相色谱柱分离，Edman降解法测序得到4个肽段。BLAST程序[9]查找发现这4个肽段与Luo等[4]提取的蛋白collapsin-1 完全匹配，证明我们提取的蛋白为神经抑制因子collapsin-1。
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3 讨 论
Raper等[5]发现，胚胎鸡脑膜粗提物具有导致生长冠萎缩的功能，而且这种活性具有胰酶敏感性和热不稳定性，提示它可能是蛋白质。我们用离子交换法纯化了成年鸡脑源性蛋白质collapsin-1，它的含量与致萎缩活性呈现明显的相关性，提示它最可能是导致DRG生长冠萎缩的蛋白质，且蛋白测序结果与Luo等的报道完全一致。Luo等还克隆表达了collapsin-1的cDNA，所得的重组collapsin-1与天然collapsin-1对DRG生长冠具有相似的致萎缩活性。以上结果均证明，collapsin-1就是鸡脑膜中导致DRG生长冠萎缩的神经生长抑制因子。我们的实验验证了抑制因子的存在，为进一步研究神经抑制因子提供了可靠的方法。
近几年的研究发现神经生长抑制因子为一大家族结构同源、功能相近的蛋白质[1]。我们所提取的collapsin-1属于第3个亚家族(即sema3A)[10]，它通过膜表面受体neuropilin-1[11]启动依赖cGMP的细胞内信号传导过程[12]，介导生长冠的萎缩。另有研究表明：降低细胞内cGMP水平和加入collapsin-1的抗体[13]或neuropilin-1的抗体[11]都能逆转或中和生长冠对sema3A的萎缩反应，这些结果使外源性干预中枢神经损伤后的再生成为可能。
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总之，神经生长抑制因子的发现为神经科学的研究注入了新的活力，它在成年鸡脑中的表达初步解释了中枢神经损伤后不能再生的原因，对这个领域的深入研究使最终解决中枢神经损伤后的再生问题成为可能。
本课题为国家自然科学基金(No. 39840011)、江苏省自然科学基金(No. BK97057)资助项目
参 考 文 献
1 Keynes R,Cook GMW.Axon guidance molecules.Cell,1995,83:161
2 Tessier-Lavigne M,Goodman CS.The molecular biology of axon guidance.Science,1996,274:1123
3 Kolodikin AL,Matthes DJ,Goodman CS.The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules. Cell,1993,75:1389
, 百拇医药
4 Luo YL,Raible D,Raper AJ. Collapsin:a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones.Cell,1993,75:217
5 Raper JA,Kapfhammer JP.The enrichment of a neuronal growth cone collapsing activity from embryonic chick brain. Neuron,1990,4:21
6 Fan JH,Mansfield SG,Redmond T,et al. The organization of F-actin and mecrotubules in growth cones exposed to a brainderived collapsing factor.J Cell Biol，1993,121:867
, http://www.100md.com
7 Bentley D,Toroian-Raymond A.Disoriented pathfinding by pioneer neuron growth cones deprived of filopodia by cytochalasin treatment.Nature,1986,323:712
8 Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976,72:248
9 Altschul SF,Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool.J Mol Biol，1990,215:403
, 百拇医药
10 Semaphorin Nomenclature Committee. Unified nomenclature for the semaphorins/collapsins.Cell,1999,97:551
11 He ZG,Tessier-Lavigne M.Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent semophorin Ⅲ.Cell,1997,90:739
12 Song HJ,Ming GL,He ZG,et al. Conversion of neuronal growth cone responses from repulsion to attraction by cyclic nucleotides.Science,1998,281:1515
13 丁新生，都爱莲，邓晓萱，等.神经生长抑制因子collapsin-1的致萎缩活性可被它的抗体所阻断.江苏医药，2000,26:85
(收稿1999-12-07 修回2000-01-11), http://www.100md.com