125Ⅰ-心得静冰冻切片法测大鼠心肌β肾上腺素能受体
作者：陈建鸣 刘慧荣 支建明
单位：陈建鸣(山西医科大学循环生理学研究室 太原 030001)；刘慧荣(山西医科大学循环生理学研究室 太原 030001)；支建明(山西医科大学循环生理学研究室 太原 030001)
关键词：受体，肾上腺素能；吲哚洛尔；心肌；大鼠，Wistar
山西医科大学学报000205 摘要： 以125Ⅰ-心得静为放射配基，采用冰冻切片技术建立了对大鼠心肌β肾上腺素能受体(adrenoceptor,AR)的测定法。实验结果证明，心肌AR与放射配基的特异结合在125Ⅰ-心得静浓度为400 pmol/L时达饱和，并确定在12.5～800 pmol/L范围为最适配基浓度。本法消耗组织微量，并可在近似生理条件下研究受体的特征变化。
中图分类号： R33-33 文献标识码： A
, http://www.100md.com
文章编号：1007-6611(2000)02-0105-02
心肌β肾上腺素能受体(adrenoceptor,AR)属于G-蛋白耦联受体家族，为心肌组织的主要受体之一。该受体被相应配体激活后，在调控心率、心肌收缩力以及细胞的传导性等方面起着重要作用[1]。心肌AR密度及亲合力的改变可反应心肌的内在损伤，测定AR是心脏病学、药理学等重要的研究方法之一[2]。对心肌AR的测定，国内外文献报道多用提膜法，即通过组织匀浆、高速和超速离心，提取相对较纯的细胞膜受体，再与放射配基结合测定受体密度和活性，具有消耗组织、受体活性丧失较多等特点。本实验参照冰冻切片测定受体法，以125Ⅰ-心得静(pindolol,PIN)为放射配基直接与心肌细胞结合，在近似生理条件下测定心肌AR受体的密度及活性，为研究AR与心肌病的关系提供新的微量法。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 心肌来源：Wistar健康大鼠，体重200～250 g，雌雄不拘，125Ⅰ-PIN由南京医科大学心血管研究室惠赠，比放射活性7.77×1016 Bq/mol，心得安、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素均为美国Sigma公司产品，Tris(三羟甲基氨基甲烷)，MgCl2均为国产分析纯。OCT(甲基纤维素)为美国Meler公司产品。Tris 50 nmol/L、MgCl2 10 mmol/L，pH 7.4。
1.2 方法
1.2.1 Wistar大鼠用体积分数为0.05水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸取心，迅速置于液氮中速冻室肌组织，再将心肌组织条修正为3 cm×4 cm规则平面，OCT包埋，于-18 ℃恒温冷冻切片机柜内行连续切片，厚40 μm。取3片组织融铸于预冷的载玻片上，吹干，同时再取组织用考马斯亮蓝法作蛋白定量[3]。
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1.2.2 将载有心肌组织的玻片分8个剂量组置于陶磁盘内，每组双复管。在组织切片上滴加12.5～800 pmol/L的125 Ⅰ-PIN，总结合TB、非特异结合NSB分4个剂量组，加10-4 mol/L心得安，以Tris缓冲液补足体积为400 μl。将载玻片放于30 ℃孵箱中，孵育30 min后，弃去孵育液，用0 ℃Tris缓冲液洗脱20 min，用冷蒸馏水缓缓冲洗10 s，吹干，分别用刀片刮下组织片，玻璃纸包裹置于试管中计数放射性(北京核医学仪器厂产FHλ计数仪，效率75%)。TB减NSB得特异结合值SB。
1.2.3 放射配基与受体结合反应过程中，孵育温度及时间、洗脱时间、反应液pH值、心肌蛋白含量以及125Ⅰ-PIN浓度均对受体结合有影响，采取逐一变更各因素的方法进行观察分析，从而摸索出最佳条件。
2 结果
, 百拇医药 2.1 方法学试验
2.1.1 125Ⅰ-PIN在所用范围内与大鼠心肌细胞的冰冻切片上AR在25 ℃,20 min时与受体结合即呈饱和性，非特异结合为5%。洗脱20 min后，随洗脱时间的延长，NSB下降很少，但已结合到受体上的配基亦渐解离，在20 min时，NSB/TB值最小，即特异结合率最高。
2.1.2 125Ⅰ-PIN特异结合的最适pH值 pH7.4时特异结合率最高，偏酸或偏碱均使SB下降或NSB升高。
2.1.3 心肌组织蛋白浓度与结合量的关系 下降蛋白量在0.2～1.5 mg范围内线性关系良好。
2.2 结合试验
2.2.1 选用上述最佳实验条件，作125Ⅰ-PIN饱和实验，将TB减去NSB所得的SB换算成B(pmol/g pro)对125Ⅰ-PIN作图可见，随125Ⅰ-PIN浓度增高，SB起初也逐渐增大，配基浓度达400 pmol/L就已饱和，随后呈一平台。特异结合占总结合值(SB/TB)的80%～90%。用Scatchard法处理得一直线，由直线斜率的负倒数得到大鼠心肌AR的平衡解离常数KD=(20.5±7.8) pmol/L，由直线在横坐标上的截距得到受体最大结合量Bmax=(47.1±12.6 )pmol/g (
±s,n=8)。
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2.2.2 作竞争抑制实验，在抑制50%125Ⅰ-PIN结合所需心得安、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素的IC50分别为1.0、13.1、107.0 μmol/L。再根据公式K1＝IC50/(1+L/KD)，求得表现解离常数为6.60×10-7mol/L、7.95×10-6mol/L、7.96×10-5mol/L(见图1)。
图1 肾上腺素能受体竞争抑制曲线
3 讨论
放射性配基是受体放射分析法中关键所在，它可以是氚标记或碘标记的。在实验中，由于生物材料的量有限，受体浓度降低，因而要求配基的放射性活度和特异性均很高，在这方面碘标记物远远优于氚标记物[4]。
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冰冻切片法自80年代应用于放射自显影技术[5，6]，对受体的定位和定量进行研究，从而能够在近似生理条件下研究受体的变化。从本实验结果来看，125Ⅰ-PIN与冰冻心肌组织切片中的AR产生特异结合。孵育时间的结合时相表明，在20 min时已达饱和，孵育时间延长会导致NSB增高，致使SB相应降低，此外125I-PIN与心肌组织中的AR结合后，尚有未结合的游离部分附在玻片组织上需要洗去。洗脱时间控制的太短，不能去除物理吸附，如过分延长，已结合到受体上的配基则会出现解离趋势，而NSB下降的很少。本方法在25 min时NSB/TB值较小，洗脱目的已达到。
对受体结合特征的研究表明，随125Ⅰ-PIN浓度的升高，特异结合在400 pmol/L时达饱和结合时有高度亲合力；Scatchard作图及Hill作图均为一直线，表明受体配基的结合过程遵循Clark模型；竞争实验表明拮抗剂对AR的亲合力大于去甲肾上腺素，与这些药物相应的生理和药理效应一致。这些结果高度提示125Ⅰ-PIN确为结合到心肌AR上。
, 百拇医药
传统的测定心肌AR所用的提纯细胞膜法，所需组织量多，且提膜过程中多次洗涤、离心，腺苷酸及一些活性物质可能在提纯中失去，而这些是受体功能的重要调节者。本法采用心肌速冻后切片保温孵育，在受体与放射配基结合前步骤少，对完整细胞环境影响小，基本保持了近似生理状态下的结合过程，仅从亚细胞水平考察受体。本法为研究AR与心脏疾病的关系提供了一种相对微量的方法，也为研究心血管系统中G蛋白耦联受体的系统调控、从分子细胞水平探讨发病机制提供了新的途径。
作者简介：陈建鸣，男，1958年3月，大专，技师
参考文献：
[1] van Zwieten PA.Adrenergic and muscarinic receptor classification and relevance and drug target[J].J Hypertens,1991,9(suppl):18.
, 百拇医药
[2] Cooke L,Muntz KH.Differences in beta adrenergic receptor agonist affinity between cardiac myocytes and coronary arteriolesin canine-heart[J].J Pharmacol Exp Ther,1994,269(1):351～357.
[3] Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248.
[4] 李卫一，曹国宪.125Ⅰ-心得静的标记及其与β受体的饱和结合研究[J].中华核医学杂志，1989，9(2)：111～112.
, 百拇医药
[5] Vandermolen DT, Muntz KH, Buja LM.Quantification of beta-adrenergic receptors in canine cardiac myocytes using autoangiography and an internal standard[J].Lab Invest,1986,54(3):353～359.
[6] Motulsky HJ.Adrenergic receptors in man direct identification physiologic regulated and clinical alternation[J].N Engl J Med,1982,307:18.
收稿日期：1999-04-08, 百拇医药
单位：陈建鸣(山西医科大学循环生理学研究室 太原 030001)；刘慧荣(山西医科大学循环生理学研究室 太原 030001)；支建明(山西医科大学循环生理学研究室 太原 030001)
关键词：受体，肾上腺素能；吲哚洛尔；心肌；大鼠，Wistar
山西医科大学学报000205 摘要： 以125Ⅰ-心得静为放射配基，采用冰冻切片技术建立了对大鼠心肌β肾上腺素能受体(adrenoceptor,AR)的测定法。实验结果证明，心肌AR与放射配基的特异结合在125Ⅰ-心得静浓度为400 pmol/L时达饱和，并确定在12.5～800 pmol/L范围为最适配基浓度。本法消耗组织微量，并可在近似生理条件下研究受体的特征变化。
中图分类号： R33-33 文献标识码： A
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文章编号：1007-6611(2000)02-0105-02
心肌β肾上腺素能受体(adrenoceptor,AR)属于G-蛋白耦联受体家族，为心肌组织的主要受体之一。该受体被相应配体激活后，在调控心率、心肌收缩力以及细胞的传导性等方面起着重要作用[1]。心肌AR密度及亲合力的改变可反应心肌的内在损伤，测定AR是心脏病学、药理学等重要的研究方法之一[2]。对心肌AR的测定，国内外文献报道多用提膜法，即通过组织匀浆、高速和超速离心，提取相对较纯的细胞膜受体，再与放射配基结合测定受体密度和活性，具有消耗组织、受体活性丧失较多等特点。本实验参照冰冻切片测定受体法，以125Ⅰ-心得静(pindolol,PIN)为放射配基直接与心肌细胞结合，在近似生理条件下测定心肌AR受体的密度及活性，为研究AR与心肌病的关系提供新的微量法。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 心肌来源：Wistar健康大鼠，体重200～250 g，雌雄不拘，125Ⅰ-PIN由南京医科大学心血管研究室惠赠，比放射活性7.77×1016 Bq/mol，心得安、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素均为美国Sigma公司产品，Tris(三羟甲基氨基甲烷)，MgCl2均为国产分析纯。OCT(甲基纤维素)为美国Meler公司产品。Tris 50 nmol/L、MgCl2 10 mmol/L，pH 7.4。
1.2 方法
1.2.1 Wistar大鼠用体积分数为0.05水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸取心，迅速置于液氮中速冻室肌组织，再将心肌组织条修正为3 cm×4 cm规则平面，OCT包埋，于-18 ℃恒温冷冻切片机柜内行连续切片，厚40 μm。取3片组织融铸于预冷的载玻片上，吹干，同时再取组织用考马斯亮蓝法作蛋白定量[3]。
, http://www.100md.com
1.2.2 将载有心肌组织的玻片分8个剂量组置于陶磁盘内，每组双复管。在组织切片上滴加12.5～800 pmol/L的125 Ⅰ-PIN，总结合TB、非特异结合NSB分4个剂量组，加10-4 mol/L心得安，以Tris缓冲液补足体积为400 μl。将载玻片放于30 ℃孵箱中，孵育30 min后，弃去孵育液，用0 ℃Tris缓冲液洗脱20 min，用冷蒸馏水缓缓冲洗10 s，吹干，分别用刀片刮下组织片，玻璃纸包裹置于试管中计数放射性(北京核医学仪器厂产FHλ计数仪，效率75%)。TB减NSB得特异结合值SB。
1.2.3 放射配基与受体结合反应过程中，孵育温度及时间、洗脱时间、反应液pH值、心肌蛋白含量以及125Ⅰ-PIN浓度均对受体结合有影响，采取逐一变更各因素的方法进行观察分析，从而摸索出最佳条件。
2 结果
, 百拇医药 2.1 方法学试验
2.1.1 125Ⅰ-PIN在所用范围内与大鼠心肌细胞的冰冻切片上AR在25 ℃,20 min时与受体结合即呈饱和性，非特异结合为5%。洗脱20 min后，随洗脱时间的延长，NSB下降很少，但已结合到受体上的配基亦渐解离，在20 min时，NSB/TB值最小，即特异结合率最高。
2.1.2 125Ⅰ-PIN特异结合的最适pH值 pH7.4时特异结合率最高，偏酸或偏碱均使SB下降或NSB升高。
2.1.3 心肌组织蛋白浓度与结合量的关系 下降蛋白量在0.2～1.5 mg范围内线性关系良好。
2.2 结合试验
2.2.1 选用上述最佳实验条件，作125Ⅰ-PIN饱和实验，将TB减去NSB所得的SB换算成B(pmol/g pro)对125Ⅰ-PIN作图可见，随125Ⅰ-PIN浓度增高，SB起初也逐渐增大，配基浓度达400 pmol/L就已饱和，随后呈一平台。特异结合占总结合值(SB/TB)的80%～90%。用Scatchard法处理得一直线，由直线斜率的负倒数得到大鼠心肌AR的平衡解离常数KD=(20.5±7.8) pmol/L，由直线在横坐标上的截距得到受体最大结合量Bmax=(47.1±12.6 )pmol/g (
±s,n=8)。, http://www.100md.com
2.2.2 作竞争抑制实验，在抑制50%125Ⅰ-PIN结合所需心得安、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素的IC50分别为1.0、13.1、107.0 μmol/L。再根据公式K1＝IC50/(1+L/KD)，求得表现解离常数为6.60×10-7mol/L、7.95×10-6mol/L、7.96×10-5mol/L(见图1)。
图1 肾上腺素能受体竞争抑制曲线
3 讨论
放射性配基是受体放射分析法中关键所在，它可以是氚标记或碘标记的。在实验中，由于生物材料的量有限，受体浓度降低，因而要求配基的放射性活度和特异性均很高，在这方面碘标记物远远优于氚标记物[4]。
, http://www.100md.com
冰冻切片法自80年代应用于放射自显影技术[5，6]，对受体的定位和定量进行研究，从而能够在近似生理条件下研究受体的变化。从本实验结果来看，125Ⅰ-PIN与冰冻心肌组织切片中的AR产生特异结合。孵育时间的结合时相表明，在20 min时已达饱和，孵育时间延长会导致NSB增高，致使SB相应降低，此外125I-PIN与心肌组织中的AR结合后，尚有未结合的游离部分附在玻片组织上需要洗去。洗脱时间控制的太短，不能去除物理吸附，如过分延长，已结合到受体上的配基则会出现解离趋势，而NSB下降的很少。本方法在25 min时NSB/TB值较小，洗脱目的已达到。
对受体结合特征的研究表明，随125Ⅰ-PIN浓度的升高，特异结合在400 pmol/L时达饱和结合时有高度亲合力；Scatchard作图及Hill作图均为一直线，表明受体配基的结合过程遵循Clark模型；竞争实验表明拮抗剂对AR的亲合力大于去甲肾上腺素，与这些药物相应的生理和药理效应一致。这些结果高度提示125Ⅰ-PIN确为结合到心肌AR上。
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传统的测定心肌AR所用的提纯细胞膜法，所需组织量多，且提膜过程中多次洗涤、离心，腺苷酸及一些活性物质可能在提纯中失去，而这些是受体功能的重要调节者。本法采用心肌速冻后切片保温孵育，在受体与放射配基结合前步骤少，对完整细胞环境影响小，基本保持了近似生理状态下的结合过程，仅从亚细胞水平考察受体。本法为研究AR与心脏疾病的关系提供了一种相对微量的方法，也为研究心血管系统中G蛋白耦联受体的系统调控、从分子细胞水平探讨发病机制提供了新的途径。
作者简介：陈建鸣，男，1958年3月，大专，技师
参考文献：
[1] van Zwieten PA.Adrenergic and muscarinic receptor classification and relevance and drug target[J].J Hypertens,1991,9(suppl):18.
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[2] Cooke L,Muntz KH.Differences in beta adrenergic receptor agonist affinity between cardiac myocytes and coronary arteriolesin canine-heart[J].J Pharmacol Exp Ther,1994,269(1):351～357.
[3] Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248.
[4] 李卫一，曹国宪.125Ⅰ-心得静的标记及其与β受体的饱和结合研究[J].中华核医学杂志，1989，9(2)：111～112.
, 百拇医药
[5] Vandermolen DT, Muntz KH, Buja LM.Quantification of beta-adrenergic receptors in canine cardiac myocytes using autoangiography and an internal standard[J].Lab Invest,1986,54(3):353～359.
[6] Motulsky HJ.Adrenergic receptors in man direct identification physiologic regulated and clinical alternation[J].N Engl J Med,1982,307:18.
收稿日期：1999-04-08, 百拇医药